灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

Summary

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。

Abstract

我々は、細胞の三次元培養のためのチップベースの細胞培養システムを開発した。チップは通常、マイクロ射出成形、マイクロホットエンボス加工または熱成形マイクロによって、非生分解性ポリマー、例えば、ポリカーボネートやポリメチルメタクリレートから製造されています。しかし、それはまた、生分解性ポリマーから製造することができる。その全体的な寸法は0.7 × 1 20 × 20 ​​× 0.7 1ミリメートル（hxwxl）です。使用するチップの主な特徴は、どちら1156立方マイクロコンテナ（CF -チップ）までのグリッドであり、それぞれ120から300までの大きさ× 300 × 300μ（hxwxl）または300μの直径を有する円形凹部と深さの300μ（R -チップ）。足場は、10美緒を収容することができる。三次元構成で細胞。最適な栄養とガス供給の場合、チップは、バイオリアクターのハウジングに挿入されます。バイオリアクターは、最も単純な構成で、additionalyローラーポンプとガスの供給を持つ媒体タンクから構成され、閉じた滅菌の循環ループの一部です。バイオリアクター、灌流、灌流、あるいは混合操作モードで実行することができます。私たちは正常細胞株と同様に数週間の期間にわたって主要な細胞を栽培している。ラット初代肝細胞のために我々は2週間以上器官の機能の保全を示すことができた。肝細胞癌細胞株のために我々はされていないか、ほんの少しだけ標準的な単層培養で発現する肝臓特異的遺伝子の誘導を示すことができた。幹細胞株との最初の分化実験では有望されて以来、システムはまた、幹細胞の培養系として有用かもしれません。

Protocol

本論文では、細胞株と同様に初代培養細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォーム（図1）の使用方法について説明します。多くの細胞が唯一の3D -環境の明示器官の機能を行うので、我々は細胞がすべての空間方向に付着することができるの足場を提供するポリマーチップを開発し、流体の流れを制御するためのバイオリアクターのハウジングにマウントできることを、実験のデザインに応じて酸素張力などは、ポリマーの表面は様々な技術、例えば、UV照射、PECVD、γ-移植するか、従来の湿式化学によって変更することができます。

図01

1。脱気し、チップのhydrophilisation

ご使用の前に、チップは脱気して親水化する必要があります。このため、アルコールのシリーズが行われる。 DMPC処理水で100％イソプロパノール、70％....

Discussion

我々は積極的に灌流マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームを開発しました。チップは、マイクロ射出成形、ホットエンボス加工と同様のマイクロ熱成形技術³による生分解性ポリマーの非生分解性からだけでなく、製造することができる。実験のデザインに応じて、ポリマーの表面は、UV -照射⁴で修正することができます。式のいくつかの肝臓特異的遺伝子の解析だけでなく、いくつかの肝臓特異的タンパク質の分析^5,6で示される可能性があるため肝細胞株と同様に初代ラット肝細胞が正常にこれらのデバイスで栽培することができる。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
細胞	その他	ATCC	HB-8065
ラットテール由来コラーゲン	I 試薬	Roche Group	11 179 179 001
PARIS kit	試薬	Ambion	AM1921
Syto16	試薬	Invitrogen	S7578
抗サイトケラチン 18	抗体	Abcam	ab668	Primary Ab, Mouseモノクローナル、PBS
抗E-カドヘリン	抗体	Abcam	ab1416	Primary Ab、マウスモノクローナル、PBSで1/50で1/100を使用。
ヤギ抗アルブミン	試薬	Bethyl Laboratories	E80-129	Primary Ab、ヤギ抗ヒトアルブミン、PBS
ウサギ抗マウスIgG1	抗体	Invitrogen	A11059	Secondary Ab、Alexa Flour 488 抱合、PBS + 0.5% BSA
Cy3 抗ヤギIgG	試薬	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPureロバa-ヤギIgG Ab、PBSで1/700を使用 +0.5%BSAの