灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

サマリー

我々は、マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームについて説明します。一つのチップは10ミオまで収容することができる。流体の流れに関しては正確に定義された条件下で培養することができる細胞、滅菌、閉鎖循環ループ内の酸素分圧など。

要約

我々は、細胞の三次元培養のためのチップベースの細胞培養システムを開発した。チップは通常、マイクロ射出成形、マイクロホットエンボス加工または熱成形マイクロによって、非生分解性ポリマー、例えば、ポリカーボネートやポリメチルメタクリレートから製造されています。しかし、それはまた、生分解性ポリマーから製造することができる。その全体的な寸法は0.7 × 1 20 × 20 ​​× 0.7 1ミリメートル（hxwxl）です。使用するチップの主な特徴は、どちら1156立方マイクロコンテナ（CF -チップ）までのグリッドであり、それぞれ120から300までの大きさ× 300 × 300μ（hxwxl）または300μの直径を有する円形凹部と深さの300μ（R -チップ）。足場は、10美緒を収容することができる。三次元構成で細胞。最適な栄養とガス供給の場合、チップは、バイオリアクターのハウジングに挿入されます。バイオリアクターは、最も単純な構成で、additionalyローラーポンプとガスの供給を持つ媒体タンクから構成され、閉じた滅菌の循環ループの一部です。バイオリアクター、灌流、灌流、あるいは混合操作モードで実行することができます。私たちは正常細胞株と同様に数週間の期間にわたって主要な細胞を栽培している。ラット初代肝細胞のために我々は2週間以上器官の機能の保全を示すことができた。肝細胞癌細胞株のために我々はされていないか、ほんの少しだけ標準的な単層培養で発現する肝臓特異的遺伝子の誘導を示すことができた。幹細胞株との最初の分化実験では有望されて以来、システムはまた、幹細胞の培養系として有用かもしれません。

プロトコル

本論文では、細胞株と同様に初代培養細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォーム（図1）の使用方法について説明します。多くの細胞が唯一の3D -環境の明示器官の機能を行うので、我々は細胞がすべての空間方向に付着することができるの足場を提供するポリマーチップを開発し、流体の流れを制御するためのバイオリアクターのハウジングにマウントできることを、実験のデザインに応じて酸素張力などは、ポリマーの表面は様々な技術、例えば、UV照射、PECVD、γ-移植するか、従来の湿式化学によって変更することができます。

図01

1。脱気し、チップのhydrophilisation

ご使用の前に、チップは脱気して親水化する必要があります。このため、アルコールのシリーズが行われる。 DMPC処理水で100％イソプロパノール、70％、50％、30％から成るイソプロパノール溶液を調製していると、チップが100％の解決で始まる、各濃度で浸漬され、30代までのため。シリーズの最後のステップは、純粋なジメチルピロカーボネート（DMPC）、処理水で構成されています。この時点から、それはチップがぬれておくことが重要です。

2。コラーゲンIコーティング

アルコール系の後、チップは通常、ラットの尾からのコラーゲンI溶液でコーティングされています。 0.2パーセント酢酸2 mg / mlのコラーゲン原液から30μgのコラーゲンタンパク質に対応するアリコートを150μlの最終容量をDMPC処理水で希釈する。 10μgのコラーゲンIあたりcm ^2の表面積の密度とチップ表面のコラーゲンコーティングのこの結果。

3。肝細胞癌の細胞の接種

ラインヘップG2の肝細胞癌の細胞をトリプシン処理してカウントされます。短期実験（1〜6日）に5 * 10 ⁶細胞を各チップとそれに対応する制御さ6cm組織培養ペトリ皿に接種されています。 inoculteに、チップ5 * 10 ⁶細胞を150μlの培養培地に再懸濁し、チップの微小領域（図2）の上に配置されます。その後、それは2〜3時間のためのインキュベーター内に配置されます。この潜伏期間中の細胞の堆積物のマイクロコンテナへとコラーゲンIでコーティングされた足場に付着する。

図2

4。バイオリアクターの住宅へのチップの挿入

潜伏期間の後、チップは、インキュベータから削除され、バイオリアクターのハウジングにマウント。このため、クリーンベンチの下に、組み立て済みのバイオリアクターに無菌包装から削除され、チップの挿入を可能にする程度に解体。チップは、慎重に滅菌ピンセットで処理し、バイオリアクターの上部と下部コンパートメントの世代につながるシールチップをとガスケットが含まれている溝に配置されます。その後、バイオリアクターは、再び組み立てられ、それがポンプに接続されているインキュベーター、ガスの供給と酸素アナライザに転送されます。

5。システムの充填

とすぐにバイオリアクターは培地リザーバに接続されているように、ポンプとガス供給閉鎖循環ループは、培地が充填されている。これは、チップの上に培地のフローとして定義されている灌流が達成されるように3方のコネクタを配置することによって行われます。これは、足場から細胞を除去することなく、バイオリアクターの循環から囲まれて空気の排出につながる。システムが完全に媒体が充填された後、3方のコネクタは、組織を介してチップの下から流れとして定義されている灌流が達成されるように切り替えられます。灌流の構成では流れが肝細胞には通常60〜500μL/ minからの範囲のセルのニーズに調整されます。

6。サンプリング

実験中に培地のサンプルを描くことができる。このため、注射器は、培地タンクの上に滅菌したポートに接続されています。サンプリングした後、ポートを70％イソプロパノールで滅菌されています。

7。ダウンストリームアプリケーションのためのチップから無傷の細胞の分離

実験の終了時に、バイオリアクターは、クリーンベンチに転送され、前述のように逆アセンブル、ガスの供給とローラーポンプから切断されています。滅菌ピンセットでチップは、バイオリアクターの筐体から削除さに配置され3.5センチメートルペトリ皿に、PBSですすいだ。その後、チップは、微細領域から細胞を分離するためにインキュベーターで5〜15分間トリプシン/ EDTA（0.25％/ 0.53mM）でインキュベートする。採取した細胞懸濁液を600 gで5分間遠心分離され次に、細胞を従来の下流の用途、例えば、全RNAまたはタンパク質の分離に使用することができます。日常的に、我々はマイクロアレイ解析やリアルタイムRT - PCRのためのトータルRNA（PARISキット、アンビオン社、オースティン、テキサス州、米国）を分離する。タンパク質発現は、レーザ走査型顕微鏡でチップ内のセルの免疫組織化学的染色後に分析されていますが、フローサイトメトリーにより、例えば、そうでなければ分析することができます。

ディスカッション

我々は積極的に灌流マイクロバイオリアクターにおける細胞の三次元培養のためのチップベースのプラットフォームを開発しました。チップは、マイクロ射出成形、ホットエンボス加工と同様のマイクロ熱成形技術³による生分解性ポリマーの非生分解性からだけでなく、製造することができる。実験のデザインに応じて、ポリマーの表面は、UV -照射⁴で修正することができます。式のいくつかの肝臓特異的遺伝子の解析だけでなく、いくつかの肝臓特異的タンパク質の分析^5,6で示される可能性があるため肝細胞株と同様に初代ラット肝細胞が正常にこれらのデバイスで栽培することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞	その他	ATCC	HB-8065
ラットテール由来コラーゲン	I 試薬	Roche Group	11 179 179 001
PARIS kit	試薬	Ambion	AM1921
Syto16	試薬	Invitrogen	S7578
抗サイトケラチン 18	抗体	Abcam	ab668	Primary Ab, Mouseモノクローナル、PBS
抗E-カドヘリン	抗体	Abcam	ab1416	Primary Ab、マウスモノクローナル、PBSで1/50で1/100を使用。
ヤギ抗アルブミン	試薬	Bethyl Laboratories	E80-129	Primary Ab、ヤギ抗ヒトアルブミン、PBS
ウサギ抗マウスIgG1	抗体	Invitrogen	A11059	Secondary Ab、Alexa Flour 488 抱合、PBS + 0.5% BSA
Cy3 抗ヤギIgG	試薬	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPureロバa-ヤギIgG Ab、PBSで1/700を使用 +0.5%BSAの