方法論記事

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

28.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/56412

⸱

2018年2月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

この記事について

サマリー

膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

要約

皮膚モデルの in vitro栽培ますます関連、製薬および化粧品用となっている物質のテストし同様、医薬品の開発にも使われて.これらのモデルは主に不可欠な要因別の物質への透過性の膜挿入システムで耕されます。通常、これらのパラメーターを決定するための応用法は、通常大規模なサンプル サイズ (例えば、フランツ ・拡散セル) または骨の折れる機器 (例えば、(FRAP) 退色後蛍光回復) が必要です。本研究は 4.26 〜 12.2 mm (栽培面積) の直径サイズの膜挿入システムに直接透水係数を決定する方法を示します。メソッドは、アガロース、コラーゲン ・ ゲル、皮膚モデルを表すコラーゲン細胞モデルと検証されました。さまざまな分子サイズと異なる細胞モデル (HaCaT、線維芽細胞は、コラーゲン ・ ゲルから成る) の透過特性を持つ物質の浸透プロセスは、正確に記述されていた。

また、上記の実験的方法をサポートするため、シミュレーションが設立されました。ストークス半径 m 14 × 10-10に分子サイズが小さい物質についても実験データにフィットまでシミュレーション (4,000 MW)、されるため、システムを記述するための有望なツール。また、シミュレーション実験努力をかなり減らすことができます、拡張またはより複雑なセットアップに適合する十分な堅牢です。

概要

オルガノ典型的な 3 D 培養医薬品開発とテスト1の物質の強力なツールとなっています。この点で、ヒト皮膚モデルなど、化粧品業界の規制要件により特別な関心です。彼らはその後として独自の単一器官培養ウェル プレート、または追加臓器モデル、例えば、肝2との組み合わせで多 organ チップのいずれかの使用のための多数の 3 D 皮膚モデルの開発につながっています。

肌と同等の栽培に関して気液界面 (ALI) は、適切な表皮分化3の重要な要素です。下部に液体透過性膜で容器から成る細胞文化挿入は、アリを確立する通常使用されます。ALIs は、12 ウェル (径 12.2 mm) まで表皮4Phenion5Episkin6、96 ウェル (4.26 直径 mm) からサイズの皮膚モデルの文化など市販の皮膚モデルに広く使用されています。ここで説明したメソッドは、膜挿入における物質の透過を決定します。

透水係数、培養皮膚モデルは、ネイティブの皮膚5と比較しての品質を評価する重要なパラメーターであるし、どのように迅速に評価するために使用される活性物質が皮膚を通して移行します。薬や化粧品の製品は、皮膚に適用する必要があります、特に場合は、このパラメーターは正確に活性剤がそれを通過するときに理解しておく必要。シミュレーション システムの挙動を予測し、必要な時間のかかる実験努力を減らすに助けることができるさらに、物質が関与している大口の場合は特に。

フランツ ・拡散セルは、透過実験皮膚および皮膚モデル5,6,7,8,9に芸術の状態です。このデバイスは、固定サンプル (拡散障壁) と 2 つのコンパートメントの間で構成されます。テストする物質がサンプル (ドナー コンパートメント) の上部に直接適用され、反対 (受容体) のコンパートメントに浸透の化合物の濃度を検出できます。アクセプタ側では、一定の温度と同種の物質濃度は温度チャンバー、マグネチックスターラーを保障されます。サンプルは、アクセプタ側でフランツ ・ セルのサンプリング アームから撮影することができます。179 cm と 19 cm の高さ範囲でこのシステムは比較的大きい10,11です。ゲル状物質や組織の拡散係数測定のための別の方法は、縛る。この手法の原理を使用漂白蛍光粒子ゲルと、漂白の領域の回復時間を決定するラベルの付いた拡散係数12,13,14を計算します。

さらに、皮膚15,16物質の浸透過程を決定するために、赤外光の吸光度と粒子の動きを検出するフーリエ変換赤外線 (FTIR) 分光法を使用できます。ただし、これらやその他のイメージングの方法 (例えば、2 光子蛍光相関分光法17) 集中的な楽器の費用必要があります。

この記事で手法を提案直接測定する膜挿入システム内の障壁の透過性皮膚モデルが栽培することができます。このメソッドは、小さなサンプル (よく 4.26 mm までサイズ) の数が多いとコンパクトなシステムで実行される透過性実験できます。これはフランツ ・拡散セル、別のデバイスが、デバイスにマウントするには、それぞれのプローブが必要し、小さなサンプル (4.26 mm サイズ) を実現することは困難ですのとは対照的です。さらに、メソッドは、主要なインストルメンテーション (例えば、共焦点または多光子顕微鏡) を必要としない、時間とコストの削減が達成されました。

多孔膜の実験を行ったすべては agarose のゲルまたは膜上確立されたコラーゲン細胞モデルから成るシステム サンプル (バリア) を挿入します。分子サイズが異なる蛍光物質 (ドナー) は、サンプルの上部に適用され、蛍光プレート リーダーを使用して下部 (受容体) に浸透物質の濃度が検出されました (図 1参照)。メソッドを検証し、このシミュレーションの精度をテストするために agarose のゲルが生成され、障壁として使用します。ヒドロゲルは、一般的に生物科学13多孔質媒質中の拡散と浸透のプロセスの調査のために使用されます。簡略化された皮膚モデル18,19 である一次繊維芽細胞とひと成人低カルシウム高温ケラチノ サイト (HaCaT) 細胞 (細胞マトリックス モデル)、コラーゲン マトリックスから成るセル シード システムの試験方法.

さらに、浸透プロセス フロー数値流体力学シミュレーションによるシミュレートしました。パラメーター最適化による拡散係数が実験データから計算することが分かった。一般に、このシミュレーションは、異なるアプリケーションを提供しています例えば、短い実験に基づく透過過程を予測することが可能だし、シミュレーションが実験の数を大幅に削減できます。

具体的には、2 ・ オルガン ・ チップ (2 OC) が開発市販1,22、実験とシミュレーションがオルガン オンチップ システム1,20,21にアプリケーションの設計されていた 23,24,25。原則として、膜挿入システムに基づく任意の臓器モデルの浸透プロセスはこの方法で記述することができます。

プロトコル

1. 透水性研究サンプルの準備

注: 透過計測とシミュレーションを確認するために agarose のゲルまたは皮膚モデルの栽培に基づく細胞マトリックス モデルで構成されるサンプルが使用されました。

  1. Agarose のゲル
    1. (二重蒸留水) H2O の 10 mL の agarose 高分解能粉末の 0.2 g を溶解します。
    2. ソリューションをミックスし、80 ° C に加熱8 分間温度を維持します。
    3. 96 ウェル膜挿入システム (4.26 mm 径) の膜に 28.6 μ L agarose のゲルを適用または使用 226 μ 12 よく膜挿入システム (直径 12 mm) (例えば、Transwell システム)。
    4. ゲルが固化するまでに 10 分を待ちます。
  2. コラーゲン ゲル
    注: 無菌条件の下ですべての手順を実行、ソリューションがコラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷の上に保持されます。
    1. 1 ml の 0.4% コラーゲン R ソリューション (ラット尾コラーゲン) のミックス 125 μ のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS)。
    2. 黄色から赤色に変わり、フェノールレッドの色まで 1 M NaOH (水酸化ナトリウム) (〜 6 μ L) でソリューションを滴定しなさい。
    3. コラーゲン ・ ゲルをダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) の 125 μ L を加え、ピペット チップを慎重に混ぜます。
    4. 96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜にコラーゲン ・ ゲルの 28.6 μ L を適用します。
    5. 30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。
  3. 線維芽細胞とコラーゲン細胞モデル
    注: すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。
    1. 実験の前に 5-7 日一次繊維芽細胞を準備します。DMEM + 細胞培養フラスコ (75 cm2












    4. figure-protocol-1



  1. figure-protocol-2




















結果

シミュレーションの精度を評価するために障壁を行った 96 ウェル膜透過実験 2% アガロースゲル システムを挿入します。フルオレセイン ナトリウム塩 (NaFl) とフルオレセイン イソチオ シアン酸メンブラン (FD) は、45 × 10-10 m ストークス半径 (376.27 40,000 mol wt) を 5 × 10-10 m から拡散物質の分子の大きさの影響を確認する使用されました。シミュレーションのネイティブのパラメーター最適化シミュレーションを実験データに合うように使用されました。

そのために、シミュレートされた透磁率の線形部分だけの斜面は実験結果と比較しました。小さい分子サイズのシミュレーションと実験データよく一致した NaFl の 99.2% と FD 4,000 80.2% (図 4 aと4 b を図参照)。大きな分子サイズには、FD の 10,000 の 50.5%、FD 20,000 の 79.7%、FD 40,000 53.6% の相関を示す高い偏差が生成されます。シミュレーションでカーブ進行を示した (図 4 c-4e参照) グラフの一層のコースの強力な上昇そして初めに遅延。

透水係数とシミュレートされた拡散係数が表示されます表 4.透過係数は分子サイズの増加と共に減少します。標準偏差は 10-8 m/s × 0.47 0.08 × 10-8 m/s とあった (N = 7)、4.18% 46.15% の間の絶対的な誤差に対応しました。大きい分子の実験は誤差の絶対値の大きいを示した。シミュレートされた拡散係数は実験的透水係数に非常に同じように振る舞った。大きなストークス半径をもつ物質減少の拡散係数と 9.09%、18.46% の間であった絶対誤差を示した (N = 3)。

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

figure-results-6

ディスカッション

本研究は、組織構造の膜でエンジニア リングの透過特性を定量化する手法を説明します。Agarose のゲルを分子サイズが異なる物質の透過をテストおよび検証メソッドと対応するシミュレーション最初検討した.小さい分子浸透 (透過クロマトグラフィーによるゲル濾過の効果) を除いてマトリックス メッシュを速くことが知られています。似たような観測は、強膜26、ひと表皮膜27、人間の皮膚の17、およびラット皮膚28物質のサイズ排除実験で作られました。透水係数と対応するストークス半径 (説明、通常分子の有効な半径よりも小さい分子として同じ拡散速度を持つ移動剛体球の半径) の間の負の相関関係が示されています。26,28日と同様の関係は、分子サイズの異なる物質を用いた実験で観察されました。1/ストークス半径以上透水係数をプロットすることによって最小の分子サイズを 4 つのグループに線形相関が認められた (R2 = 0.93) (図 6)。これは提案法によるシミュレーションの透水係数は、現実的な範囲を示します。

実験では 46.15% のエラーはフランツ ・拡散セル システム10透水性実験の報告よりもやや大きい。1 つの可能な説明は、フルオレセイン-イソチオ シアン酸-デキストラン、後述のサイズ分布で可能性があります。

説明メソッドは利点フランツ拡散細胞システムを用いた方法と比較して重要であります。まず、セットアップがよりコンパクトです。実験は、商業のウェル プレート (∼ 13 cm × 8.5 cm) のスケールを持つ膜挿入システムで直接実行されます。別のフランツ ・拡散セルは各サンプルに必要なに対し、これにより、同時に実行する複数のサンプルです。第二に、栽培が行われる膜挿入皮膚モデルの透磁率を直接測定できます。フランツ ・拡散セルを使用して、サンプルにある撮影しは小さいサンプルのため手間がかかります、また時間がかかるシステムにマウントされています。

コラーゲン細胞マトリックスの透過実験セル シード システムにこのメソッドを正常に適用できることを示した。皮膚モデルにここに提示されたモデルを検証しましたただし、メソッドは、有機細胞培養、例えば腎臓や肝臓の他のタイプに適用できます。

本研究ではコラーゲン細胞モデルを用いて HaCaT 細胞が完全にモデルの表面をカバー (図 5参照)。これは、メソッドが HaCaT の層とコラーゲン細胞モデルと透水係数を区別するために十分に敏感であることを示す透水係数の削減につながった。理想的には、皮膚モデルは29の本当の皮膚の表皮に近づくと、バリアを構築する必要があります、したがって、実際に使用する前に皮膚モデルの質 (例えば真皮、表皮の建物) を検証する重要です。皮膚モデルの開発は、染色技術を可視化し、皮膚タンパク質とコラーゲン30,31,32の検出から定量化できます。透水係数は、皮膚モデルの開発を評価するための重要な要素もありますが、さらに、実験はこれを確認するために必要な。前述したように、このメソッドは、複数のサンプルを同時に実行できます。また、透磁率を測定し、それによって皮膚モデルのこのパラメーターの開発を観察する栽培中にサンプルを取ることが可能です。

それは、透磁率が同時にゲル/コラーゲン-セル-モデル、膜を通して測定されること注意してください。検出された透水係数は、システム固有という異なる皮膚モデルの結果のみ比較できます同じ膜挿入を使用する場合です。さらに、皮膚モデルは、モデルを介してのみ被験物質に浸透し、それに隣接していないと誘導するエラー測定透水性を確保するために全体の栽培面積をカバーする必要があります。今後の実験で考慮するべきもう一つの側面は、皮膚を取り巻く自然環境です。通常、皮膚表面の温度は透過条件に影響を与えることができます内側の地域と比較して低いです。

計算機シミュレーションと実験を配置するために応用シミュレーションにおけるパラメーター最適化を可能にする方法が発表されました。シミュレーションは、分子サイズの小さい物質の実験データとよく一致するように発見されました。ただし、シミュレーションと実験データの偏差は分子サイズの大きな物質の観察されました。大規模な多糖類分子は、摩擦を高めるし、ゲル内拡散プロセスを遅くできます。この効果により、実験間の偏差の原因である異常拡散とシミュレーション値33,34。別の説明は、フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの小さいまたは大きい粒子の存在可能性があります。メーカーは、特定の範囲に存在するより小さくより大きい粒子を可能にすると平均サイズとして物質の分子量を指定します。ないもどれほど分散してこれらの物質は、小さい粒子浸透ゲルと流体チャネルを介してより速くです。これらの拡散と摩擦の影響を考慮するシミュレーションを拡張することが可能です。

透過性実験とシミュレーション 2 OC で使用するため開発されました。シミュレーションの助けを借りて、この実験法より洗練された実験的設定に直接転送することができます。たとえば、膜挿入システム シミュレーションは、2 OC のジオメトリまたは同様のセットアップで他のシステムに簡単に転送できます。今後の実験の設計をサポートする変調シミュレーションのこのオプションを使用できます。また、蒸発、異常拡散膜効果などの副作用は、シミュレーションの精度を向上させる統合できます。シミュレーション プログラムは、変更または皮膚モデルの開発の他の側面を調査するために他の物理モジュールを統合するシミュレーション式を改良する機会を与えます。1 つの例は、コラーゲン細胞モデルにおけるブドウ糖の消費量と乳酸の生産のシミュレーションです。

特に興味深い医療物質のテストでは、チップ上の器官システムで物質を分散する方法です。私の助けに答える質問物質がシステムに浸透する速さなどシミュレーションと透磁率のパラメーター多 organ チップで他の組織の濃度になりますだけでなく。このメソッドは、サポートし、そのような器官のオンチップ システムを開発およびテストを強化できます。

開示事項

Uwe マルクスは社長や株主と逆流性食道炎リンドナー TissUse gmbh 社は、製造・建設技術を商業化会社の株主であります。他の著者は本稿の出版物に関する利益相反を宣言しません。

謝辞

この作品は no. グラント ドイツ研究振興協会 (DFG) からの財政支援で作成されましたPO413/12-1 とラ 1028/7-1。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースカールロスK297.2高分解能粉末
コラーゲンServa47256.01コラーゲン R 溶液 0.4 %
DMEMロンザ (Biozym Scientific GmbH)880010-12高グルコース L-グルタミン
FCSBiochrom GmbHS0615 0114F子牛胎児血清
フルオレセイン ナトリウム塩Sigma-Aldrich46960-25G-F
フルオレセインイソチオシアネート-デキストランSigma-Aldrich46944-500MG4000 g/mol
フルオレセインイソチオシアネート-デキストランSigma-AldrichFD10S-250MG10,000 g/mol
フルオレセインイソチオシアネート-デ
ランSigma-AldrichFD40S-250MG40 000 g/mol
HBSSThermoFisher Scientific14170120カルシウム、マグネシウムなし、フェノールレッド
NaOHMerck1.06467.9010粒状
PBSGibco18912-014錠
トランズウェル細胞培養インサートCorning339196 well, 0.4 & micro;m細孔サイズ
トランズウェル細胞培養インサートコーニング(VWR)734-156312ウェル、0.4&マイクロ;m細孔サイズ
トリプシンBiochrom GmbHL2143EDTA付き
キスト

参考文献

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

再版と許可

タグ

透過性の決定拡散係数3D組織モデルアガロースゲルコラーゲンゲルコラーゲン細胞モデル蛍光測定シミュレーションの最適化
ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。