機能再生大腿骨につながるラットモデルにおける仮骨延長法のための効率的かつ再現可能なプロトコル

サマリー

本研究では、許可は、創外固定器を除去した後、動物で体重を支える生理模型大腿骨ラット (を行う) を新たに開発した創外固定器の仮骨延長術を用いた再現性と詳細なプロトコルについて説明します。

要約

このプロトコルでは、ラット大腿骨モデルにおける仮骨延長法のための新しく開発した創外固定器の使用について説明します。仮骨延長法 (DO) は、骨、骨切り後の再生に導く手技です。切り離した骨四肢互いから離れて緩やかな気晴らし目的伸長に到達する移動しています。この手順は、延長、偽関節、骨や顎顔面再建法および骨腫瘍切除の術後骨欠損の再生術後上限と下限の手足の人間で広く用いられます。のみいくつかの研究は、明確に、機能的な再生骨、すなわち、創外固定器を除去した後骨折ではない生理学的荷重をサポートして骨を得ることで、プロトコルの効率を示します。また、プロトコルが異なるように、再現性が困難な研究の比較、情報の不足によって制限されます。本研究の目的はラット骨延長、外部の取り外しの後動物に生理学的な荷重を許可する詳細な手技と適切な創外固定器設計を含む再現可能なプロトコルを開発、創固定器。

概要

仮骨延長法 (DO) は手術技法を広く臨床的に^1,2,3,4人間の下位^1,2の上部³骨延長、後偽関節、骨や顎顔面再建法⁴のように同様に骨腫瘍切除の術後骨欠損の再生治療。骨骨骨切り術、創外固定器の配置後の再生につながるを行います。切り離した骨四肢互いから離れて緩やかな気晴らし²希望の伸長に到達する移動しています。統合期間に依存して、中にないより伸びがあります。

行う手順は、3 つの段階に分かれています: 遅延、気晴らし、および統合します。一般的には、7 日間の潜伏期間を切り⁴の直後に開始します。これは、骨修復治癒プロセス⁴の最初のステップを開始することができます。潜伏期間は、再生のカルスおよび周囲軟部組織^1,2,4に牽引力を適用する、気晴らしの期間が続きます。目的の伸長に達したら、気晴らしが停止し統合期間を開始します。この期間中は、創外固定器は再生骨がその除去をサポートする十分な機能まで維持されます。

様々 なパラメーターを行う長さ延長、創外固定器各種、気晴らしの周波数、連結期間または機械的ストレスに気を取られてカルスの種類の長さのレートなど骨修復に影響を与えます。例として、速度と延長の頻度つながることができます早期統合⁵またはプロセスの中断に壊死組織やカルス^6,7内嚢胞のような非回復可能な損害を作成することによって。

多くのプロトコルは、骨修復プロセスを研究し、骨統合を最大限に異なる動物モデル^8,9,10をされています。ラットでは, ほとんどの研究^{11,12,13,14,15}はカルスの統合をスピードアップを行うプロトコルを短縮する方法に焦点を当てた。これらの実験の一部は人間の臨床応用^5,13,,1516外部アクセサリー既に市販を使用しました。しかし、創外固定器のこれらのタイプ、人間の大腿骨から異なる解剖学的特徴を表わすラット大腿骨には適していません。また、のみいくつかの研究は、明確に機能再生骨^7,16を得ることで、プロトコルの効率を示します。したがって、彼らの異なるプロトコルと創外固定器^12,13,14,17に関する情報の不足のための様々 な行う調査からの結果を比較することは困難です。

したがって、本研究の目的はラットのモデルで、機能再生骨につながる大腿骨での効率的かつ再現可能なプロトコルを記述するためだった。この目的のために、自家製で使いやすい創外固定器がこのプロトコルでくわしく記載されてラット大腿骨の特にを考案しました。このデバイスの仕様を起草、機械的応力と残留応力の生産を避けるの良好な分布のためのすべての基本的な制約を考慮しました。骨や周囲の組織に純粋な牽引力を許可するデバイスの適切なジオメトリ、動物、骨伸長の長さと骨セグメントの良い配置の制御の歩行のための適切な重量の技術仕様が含まれてピンと骨の交点におけるせん断応力生産なしまた、このデバイスは、気晴らし、生体親和性と損傷することがなく滅菌中に動物の鎮静なしで使用しなければならなかった。統合の 7 週間後ラット大腿骨上で行うこのプロトコルは創外固定器を除去した後、再生のカルスの骨折ではない動物の生理学的体重を支えるによって示される機能再生骨につながった。動物の生理学的歩行再生カルスのマイクロ CT 解析と x 線解析から得られる建築のパラメーターと一致していた。

プロトコル

説明したすべての手順は Aix マルセーユの大学機関動物ケアおよび使用委員会は、フランスの研究省によって承認され、マルセイユ医学部 (従来の動物の家で実行フランス).

1 です次のガイドラインに基づく外部創固定器の機能仕様の定義

1. 最適化骨アンカレッジ。。
   1. (ねじ部) の直径 1 mm のピンを半分スレッドをインプラントします
   。
2. 動物の不快感を軽減するデザインを選択します。
   1. 7,723 mm ³ (32 × 19 × 12.7 mm) の音量に収まる小さなサイズの創外固定器を選択します
   。
   2. 低創外固定器の選択、重量、動物を不安を避けるために、pin なし未満 13 g ' 歩行。その低密度のために 2 つのブロックのための材料としてアルミニウムを選択します
      。 注: ブロックの面取りはかなり 2 つの部分の重量を減少します
   。
3. 引張力の方向が骨の方向に平行に保持されるように、創固定器の動きを制御し、純粋な引張力を確保する。
   1. 使用はバーをスライドさせて 2 つのブロックを通過します。グルーヴし、それぞれは 2 つのピンを耐えることができるようにブロックを開きます
   。
   2. はブロックで自由に回転を 1 つの滑らかな側に伸長ネジを使用し、回転によって指と 2 番目のブロックを転置するスレッド側を握ることができます。引張力の方向を骨の方向に平行に保つために、破壊の両側の骨に 2 本のピンを固定します。ピンにストレスを適切に分散できるように縦軸に引張力を維持します。ロックボルトと 4 つのピンをセキュリティで保護します
   。
4. アルミニウム、チタン、殺菌温度に耐えることができる鋼のような材料を選択します
。
5. 創外固定器のジオメトリに対応するそのピンの位置を確認 ( 図 1 -B)。
   1. 穴あけ位置を維持するために骨に締めクランプを含む掘削ガイドを使用します
   。
   2. は、低締付け力でクランプのレバー腕を短きます。デバイスは、上記の将来の骨折は、両側をクリアする途中でクランプを配置します
   。
6. ローレットネジを締めます、携帯電話のブロックを解除するを追加することにより作る簡単マニュアルに気晴らしを調整。
   1. 指だけで操作するための十分な幅のネジを使用します
   。
   2. 気晴らしに簡単に許可するように、2 つのブロック間伸長ネジの真ん中にドリル四角ナットを追加します
   。
   3. は、薄いピンとマニュアルの使用を許可する 2 つのブロック、またはオブジェクトの任意の種類を超えるこの正方形ナット (左右各 8 mm) を作る。0.125 mm の延長を許可するオンにスクリュー ¼ ターン
   。

2。手術

注: アシスタントはすべての外科手術に必要な。4 つの 12 週齢雄スプレイグ ラット飼育して規格研究所ダイエット 広告自由

。

1. 手術器具の準備します。
   1. すべての次の手術器具を滅菌: 1 rugine、2 ・ セン ' 1 メス、1 マヨはさみ 1 マヨネーズ Hegar 針ホルダー 1 マイクロ ・ オルセン-Hegar 針・ ホルダーのリトラクター
   。
   2. 創外固定器、掘削ガイド、4 半ねじピン、ネジ 4 本、先端や殺菌、ドリル先端の文字列と、piezotome の文字列。これらの楽器を 135 ° c で 18 分間オートクレーブによる滅菌
   3. は、手術台に滅菌フィールドの下の加熱パッドをインストールします。別の滅菌フィールドにすべての機器や用具を配置します
   。
2. 麻酔し、動物の準備します。
3. 麻酔薬と鎮痛剤の混合物を準備するラットの重量を量る
1. を決定する Bupremorphine とカルプロフェン即席鎮痛剤の混合物を準備するの量を計算しています。0.05 mg/kg で 5 mg/純量ブプレノルフィン (0.03 mg/mL) とカルプロフェン (5 mg/mL) をそれぞれ使用
2. ラットを抑制し、皮下注入する鎮痛剤混合、数秒待ってから、腹腔内麻酔薬の混合物を注入。
。
3. 右後肢電気かみそりを剃るし、ポビドン ヨード溶液で手足を消毒します
。
4. 動物を横に置く (右側上方) 内外軸創外固定器の正しい位置を許可する滅菌フィールドにします
。
5. 無菌圧縮を手術中に目を保護するためにその頭の上置く
。
4. 大腿骨における創外固定器をインプラントします。
   1. 皮膚切開のランドマーク。マーカー、次の矢状面で中央線の近位部 (hip) の遠位部 (膝) からポイントと 2 番目の点を描画します。これらの 2 点間の線を描画しています
   。
   2. メスを使用して描画の線に沿って伸張した皮膚を切開します
   。 メスの助けを借りて、大腿骨は完全にさらされるまで、
   3. は 外側広筋 と 大腿二頭筋 の間にカット。使用、2 ・ セン ' s リトラクター (アシスタントが必要な場合があります) 筋切開を容易にします
   。
   4. 骨膜を持ち上げるし、rugine の助けを借りて骨から軟部組織を切断します
   。
   5. は、公開されている大腿骨は、十分な長さを確認します。
      1. 創外固定器の最も近位と遠位の穴にピンを挿入します
      。
      2. 創外固定器を置き、両方のピンが大腿骨にアンカーすることができますを確認してください
      。
   6. インプラント 4 並列大腿骨の 1 mm 半ねじピン。
      1. 掘削ガイドを取るし、2 ・ センと筋肉を離れて動く ' s リトラクター。大腿骨の真ん中に穴あけのガイドのクランプを締める
      。
      2. ドリル 4 大腿骨にはあらかじめ穴します。4 ガイド穴を直径 0.6 mm の金属ドリル ビットを通過して 2,000 rpm の速度で穴をドリル電気ドリルを使用して。
         1. 最も近位および遠位にスタート穴と 2 つの完了は中間ガイドの物です。両方の野を通過するが、大腿骨のすぐ下に軟部組織に損傷を与えないように注意してください
         。
      3. 掘削ガイドを脱ぐ
      。
      4. は、0.8 mm 半ねじピンと 4 つの前の穴を拡大します。
         1. 作業 0.6 mm を前後ピン穴。滞在大腿骨と両方の皮質を経由してシンクに垂直になるように注意してください
         。
      5. 1 mm 半ねじピンをインプラントします。
         1. 針ホルダー付け 1 mm 半ねじピンの頭をグリップします
         。
         2. シンク前の穴を拡大するためのピンです。ピン両方の皮質を貫通し、・ センと 1 mm 以上をはみ出さないようにことを確認 ' s リトラクター
         。
      6. 創外固定器を半分スレッド 4 ピンに接続します。確認オフセット (、創固定器間の距離 ' s 2 つのブロックと骨表面) 約 6 mm は、簡単なステッチとシステム ¹⁸ の優れた剛性を許可します
      。
      7. 創外固定器のピンにロックされている、ロックのネジ 4 本をセキュリティで保護します
      。
5. Osteotomize 大腿骨。
   1. 、Piezotome と 2 の中央のピンの間の骨切りを実行します
   。
   2. Wo を閉じるund は吸収性縫合糸 (5.0) とメイヨー Hegar 針ホルダー連続ステッチを使用して。皮膚のみをステッチすると、確認と筋肉ではありません
   。
6. 手術モニター動物を確認します。
   1. 動物はまだ麻酔中、手術直後後の x 線を実行します。すべてのピンの深さを確認、長い軸に沿切り離した骨四肢
   。
   2. 確認鎮痛・ ブプレノルフィン (0.03 mg/mL) と Enrofloxacine (50 mg/mL) それぞれで、0.05 mg/kg および 10 mg/純量の皮下注入による antibioprophylaxy
   3. を決定する逆に麻酔アティパメゾールの量を計算しています。1 mg/kg でアティパメゾールを使用し、製品を管理するための皮下注射を行います。意識を取り戻すし、そのケージに戻るには、動物を許可します
   。
   4. 手術後 6 時間注入 2 回目 0.05 mg/kg 及び 5 mg/kg でそれぞれ鎮痛混合物 (ブプレノルフィンとカルプロフェン) の皮下
      。 次の鎮痛の混合物の 1 日 2 回と、antibioprophylaxy 日に 1 回 3 日間はこれらの注射を少なくとも、与えます。通常臨床検査鎮痛法の有効性を評価するために実行する必要があります、それぞれの動物の行動の標識に従って変更する必要があります。
   5. 動物は、手術の翌日に通常彼らの作動の後肢を使用して歩くことができることを確認します
   。

3。気晴らし

1 週間

1. ニュートラルで創外固定器のまま固定。この段階の終わりには、手足を x 線します。骨セグメントを整列させるとピンの位置を確認します
。
2. 手動でターン四角ナット 1 つの半分 (0.25 mm) 時計回りに 12 時間間隔、気晴らしをします。運営骨セグメントの初期の長さを基準にして延長 12% を表す 5 mm 骨の延長につながるはずだ 10 日そらす。
   1. はこのステップの間に動物を麻酔しません。下肢骨セグメントを整列させるとピンの位置を確認するこの期間の終わりに、半分の方法を x 線します
   。
3. 47 日間の創外固定器を維持します。気を取られてギャップ石灰化の進行状況を確認する毎週の手足を x 線します。日 64 創外固定器を取り外して 2 日 (66 日目) の動物の散歩を自由にしましょう。合計連結期間 7 週間
。
4. 吸入セボフルランの過剰摂取で統合の 7 週間後、すべてのラットを安楽死させる
。
5. 切除周囲の組織に気を取られ、対側の大腿骨。
   1. 作る傷の皮膚切開は、メスの助けを借りて、矢状面の後正中線を位置しています。膝の前にヒップの上から切開を実行します
   。 大腿骨は完全にさらされるまで、
   2. はメスと 外側広筋 と 大腿二頭筋 の間にカット。可能な限り、骨筋を切断します
   。
   3. 膝のすべての靭帯を切り、アーティキュレーションを解体します
   。
   4. 股関節の関節包をカットします
   。
   5. は半ねじピンを削除せず徹底的に骨をきれい。メスを使用すべての軟部組織を削除します
   。
6. 対側の大腿骨に 3.5.5 に 3.5.1 から手順を繰り返します
。
7. では、気が紛れるし対側大腿骨 x 線します。4 半ねじピンを削除し、マイクロ CT スキャン解析 (10 μ m 解像度) の-20 ° C ですべて大腿骨を格納します
。

結果

安定した定着を示す大腿骨の半ねじピンの緩み統合の最後に手術の端から撮影した x 線画像を認めなかった.ピンが平行でよく保存されました。行うプロセス (図 2) 行われる切り離した骨四肢の骨の縦軸に沿って整列。潜伏期間の終わりは、石灰化した領域には表示される (図 2B) がありませんでした。気晴らしの期間の終わりに、いくつかの石灰化領域は既存野 (図 2C) の近くに表示されていた。統合 (45 日) の 28 日後切り離した骨の四肢の間のギャップの非石灰化領域が小さかったし、ギャップ近傍だけでなくピン (図 2D) のレベルでも骨膜カルスを見ました。統合 (64 日) の 47 日後再生のカルスはすっかりブリッジ (

ディスカッション

本研究では、ラット骨延長、創外固定器を除去した後動物に生理学的な荷重を許可する詳細な手技と適切な創外固定器設計を構成する再現性のあるプロトコルについて説明します。私たちはプロトコルは、機能的な再生骨につながった。統合の 47 日後自家製創外固定器と 2 日間動物に生理学的な荷重の除去は、再生のカルスのいずれかの骨折を誘発しなかった。マイクロ CT 再構成のおかげで完全なブリッジの証拠は、再生のカルスが機能したことを確認しました。以前の研究は明らかに石灰化架橋の存在と再生のカルスが¹⁹を維持できる負荷には正の相関を示した。また再生のカルスの発見 vBMD controlateral 下肢²⁰から大腿骨骨幹部の発見 vBMD の約 67% であった。また、前述の値に近かった再生カルスの平均 vBMD²¹を発見します。これは効率的な骨修復につながる創自家製外によって作成された安定した環境を強調表示します。さらに、創固定器は動物によってよく容認されました。位置決めと創外固定器の軽量化は、手術直後に歩くこ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Kéタミン	Renaudin	578 540-2	動物の家
Méによる供給。déトミジン	ビルバック	6799091	動物家による供給
セボフルラン	セントラベット	567 477-2	動物家
による供給 ブプレノルフィン	インド フランス	3400932731060	動物家による供給
エンロフロキサシン	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	動物家による供給
ピエゾトーム	サテレック アクテオン	F57510
ヒーティングペットパッド	Therasage	AL8365936	動物家による供給
歯科用X線	S.A.R.LイノベーションMÉdicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
Micro-CT system	nanoScan SPECT/CT	GEIT-31105EN (05/14)	IVTV中央による下請け Lyon
Micro-CT分析ソフトウェア	phoenix datos X2 reconstruction	none フリー	ソフト
電気カミソリ	Brawn	GT415	動物屋による供給
センsのretractors単語	の精密器械	501718	鈍器版
Betadineの解決	Mundipharmaの医学の会社	D08AG02	動物の家によって
供給される吸収性縫合糸(5.0)	Ethicon	JV1023	家
Rugineによって供給 Rugine	単語の精密器械	503406
メイヨーヘガーの針ホルダー	単語の精密器械
金属ドリル	ボイターロック	V020944018003
マイクロオルセン・ヘガー ニードルホルダー	ワード精密機器	501989
メイヨーシザー	ワード精密機器	501752
メス	ワード精密機器	500236
スプレイグ・ドーリー	ジャンヴィエ	なし	12弱者と男性