密閉システムで脳スライスの長期培養中に正確にローカライズされた、反復的な断続的なイメージングのため変更されたロール チューブ法

Summary

提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips に再配置する正確に何週間もかけてスライスの齧歯動物の脳の断続的な高分解能イメージング。神経細胞の生存とスライス形態も維持されます。細胞型特異的発現ウイルスを用いたこの完全に囲まれたシステムのアプリケーションを提供しています。

Abstract

培養齧歯類脳スライスは、ニューロンとグリア通常体内の相互作用の多くを保持する環境での細胞および分子の挙動を調べる場合に役立ちます。蛍光顕微鏡による高分解能イメージングのためさまざまなトランスジェニック マウス線または蛍光付けられた蛋白質または野生型脳スライスのレポーターの発現ウイルスベクターの使用から得られたスライスを許可します。イメージング脳スライス、スライス培養を組み合わせて実行する機能のいくつかの方法が開発されているが、長時間にわたりライブ スライスの特定のセルの繰り返しの高分解能イメージングは、問題を提起しています。最高ユーザーを保護し、交差汚染を防ぐためにクローズド システムで行われるため外因性タンパク質の発現ウイルスベクターを使用、これは特に当てはまります。密閉システムで何週間もかけてスライスの繰り返しの高分解能イメージングを可能にするローラー管脳スライス培養法は、単純な変更が報告されます。フォトエッチング coverslips にスライスを養殖を迅速かつ正確には、さまざまな治療法の前後に時間をかけて同じフィールドをイメージするステージを再配置する基準マークの使用できます。特定の神経細胞の染色し海馬スライスのアーキテクチャの変化を観察するための式、蛍光蛋白質のウイルスによる神経発現とコフィリン病理学の発展と組み合わせてこのメソッドの使用方法の例が表示されます。アルツハイマー病 (AD) の海馬におけるアミロイド β (a β) ペプチドのオリゴマーをスライス処理に応答, 以前。

Introduction

齧歯動物の頭脳の地域から解離細胞の初代培養はレスポンスを病理組織学的に観察する研究者によって使用される重要なツールに刺激が関与しています。ただし、このような研究は、ニューロンだけ 2 D で、グリア サポート システムを見ての欠点を持っています。さらに、それの非常に高密度化 (640 ニューロン/mm²または表面積の約 16%) の条件下で栽培しない限りなります短い距離以上の海馬はその細胞体から樹状突起や軸索のランダムな副産物を従うことができません。神経細胞生存率 4 週間以上¹、加齢に伴う病態の拡張研究解離文化の使用を制限する著しく低下しました。齧歯動物の脳から調製したスライスの養殖は、数週間または数か月の組織細胞と生存率を維持することでこれらの制限を克服する魅力的なオプションです。スライス培養における齧歯動物の脳の多くの異なる領域を維持するための条件は、説明²をされています。

2 つの主要な方法は広く使用される長期培養脳スライス:³の気液界面膜を培養または密封された管内 coverslips に培養通気⁴を提供するためにローラーのインキュベーターで回転できます。膜上で培養したスライスの正立顕微鏡と水浸漬目標⁵を使用して高解像度蛍光顕微鏡による直接イメージを作成できます。また、膜上で培養したスライスは、倒立顕微鏡⁶を使用して樹状突起スパインの良好な分解能を達成するためにガラス底培養皿に転送されています。ただし、膜上に成長したスライスを画像の両方の方法は媒体の変更を必要とし、多くの場合抗真菌剤や抗生物質を使用して回避または低減汚染^5,6オープン ・ システムです。優れた形態や生存率、空気中の界面膜上のスライスを維持が高倍率で反復的なイメージ投射の間の正確な位置に戻るは非常に難しい実験は細胞の唯一の小さなグループに続く蛍光マーカーを表現します。膜上に成長したスライスは、ウイルスによる発現遺伝子^5,6で使用されている、バイオ セーフティ プロトコル必要がありますに使用される特定のウイルスのベクトルに囲まれた文化システムが採用されます。蛍光を表現するタグ付きのタンパク質や細胞生理学記者。さらに、浸漬の目的は文化⁵に続いて、サンプル間の除染を必要とします。膜インターフェイス文化の 1 つの主要なアプリケーションは、単一の時間ポイント⁷で電気生理学と高分解能イメージングを組み合わせることです。

プラスチック製のチューブ内 coverslips にロール チューブ法、coverslip を削除せず電気生理学または高分解能イメージングを許可しません。したがって、このメソッドは、最も頻繁に⁸のポスト固定観測が実施された長期的な研究に適用されています。ここで説明した、ローラー チューブ培養技術を利用して、文化として長い間繰り返しイメージを作成することができます coverslips にスライスと掘削を管に維持される方法です。囲まれたシステムは、イメージングの中型の変更を必要としないと、フォトエッチング coverslips イメージング高倍率、数日または数週間後で以前のイメージを作成する正確なフィールド許可基準マークを提供するために利用します。

齧歯動物の海馬は、記憶と学習に関与する主要な脳の領域に変更を検討する本手法に適用します。齧歯動物の海馬は、認知障害⁹広告で発生したなどの開発中に病理組織学的、または加齢に伴う変化のためのモデルとしてよく勉強しました。本手法は特に広告⁸の特徴である a β ペプチドの増加などの環境の変化に対応で時間をかけて 1 つのスライス内で開発の病理学的変化の研究に適しています.コフィリン アクチン凝集体の存在である人間と齧歯動物の AD 脳に関連付けられている 1 つの病理学、ロッド、コフィリンとアクチン フィラメントの後者含まれているバンドルは、1:1 モル比^10、11,12. ロッド固定スライス a β 投与ラット海馬だけでなく、コフィリン gfp 低酸素⁸を受けるライブ齧歯動物脳スライス内で観察されているし、広告に見られるシナプスの機能不全に貢献するかもしれないストローク。ここで我々 は時間コースと別のウイルスによって導入された表現された外因性キメラ蛍光蛋白質のスライス内の分布を観察するのにこの新しい培養方法を使用します。コフィリン ロッドと海馬スライスにおける可溶性 a β オリゴマー (a β_o) による治療への応答の集計の病理学の発展に従ってくださいコフィリン記者構造、神経特異的発現し利用します。

Protocol

動物の使用に続く承認された繁殖と動物使用プロトコル準拠する動物愛護とコロラド州立大学の使用のガイドラインの。

注: 以下のプロトコルは準備と文化法長期潜伏と海馬スライスの断続的なイメージングをについて説明します。単一の海馬スライスは凝固血漿を使用して特別に作られたフォトエッチング coverslip に接続されているし、coverslips はローラーのインキュベーターで維持するドリル アウト ローラー管の平らな側面にシールが。プラズマの塊は、蛍光タンパク質の発現と高分解能イメージングのためのウイルス感染前にプラスミンにディゾルブされます。蛍光神経の重要な染料を使用して、スライス内のニューロンをイメージします。

1. ローラー管ラックの作製

1. 図 1に示すようにテンプレートを使用は、スケール バーを表示サイズに印刷。、釘を使って穴の中心にテンプレート (細かい点のマーカーのできる大きさ) 小さな穴をパンチします。
2. 15 cm 培養皿 (14 cm の呼び径) の下部にテンプレートを設定し、穴の位置をマークします。2 番目の料理にこの手順を繰り返します。
3. プラスチック用ドリルのビットで穴の中心、皿の端から 2.5 cm の六角形配列 (4.8 cm-の中心) の各皿の上 6 の 1.5 cm 直径の穴をドリルします。図 1Aのようにより大きい穴の 2 つの間に等間隔に配置されている端から 12 mm 3 穴 (直径 3 mm) をあけます。
4. 各皿の底に、2 番目の平ワッシャーを一枚続く小さな穴のいずれかを介して平ワッシャーと 2.5 インチ長いビス (直径 3/16 インチ) を配置、お互いに直面してポリエチレンのチューブ (スペーサー、4.7 cm)、別の平ワッシャー、2 番目の細胞培養用ディッシュ、別の平ワッシャー、ロック洗濯機およびナット。
5. 2 つのマシンの他のネジとすべてのビスは、場所までだけ緩く締め 1.4 手順を繰り返します。しっかりとナットを締めます。
6. 取得最終ローラー管ラック底皿の穴にグロメット (5/16 インチ厚、5/8 インチ穴径) を動作 (図 1Bの場所に 2 つの管と示されて)。一意の番号の各ラックにステッカーを配置します。

2. ローラ チューブと Coverslips の準備

1. ローラ チューブの孔あけ治具を作る
   1. 8 cm 1.5 cm 穴をあけるような角度で 5.5 インチ木製ブロック x 4 x 2 のセンター側にブロックを挿入するとほぼ平行する意志をローラの平らな面に管 (図 2A)。
   2. 穴を広げるし、テーパ管挿入できるように穴の両方に丸い木製のファイルを使用してを拡大 (ローラ チューブ、キャップ エンド付近の径大きめ) (図 2B)。
   3. ブロックの側から 5.5 cm 1.5 cm 直径垂直穴をドリルし、側の穴 (図 2C) を中心としました。
   4. 側孔は十分なテーパーは、中央のスライスの穴と 1.5 cm の垂直穴でマークしたスポットを中心としたのでチューブを配置する目的のスポットでマークされているローラ チューブを挿入します。
   5. チューブを削除し、スポットからチューブの端までの距離を測定します。治具で穴の中心からこの距離をマークし、(図 2Cの矢印) を掘削管を適切に配置する停止を提供するために爪を挿入します。
   6. けがを防ぐために木製のブロックの表面を持つフラッシュを爪を切断するのに弓のこを使用します。
   7. ドリル出版物であることができるスロットを固定 (図 2D黒矢印) がある場合は、治具の下にスプリング クリップを追加します。それ以外の場合、ドリル出版物にしっかりとジグを保持する C-クランプを使用します。
2. 治具を使用して保持し (図 2A) を平らな面にフラット両面 11 cm プラスチック培養管の位置、センター下から 1.0 cm と 6 mm 径の穴をドリルに上記し、チューブの側面間の中央に。
   注: プラスチック用ドリルビットを使用する必要があります。
3. 回転式バリ取りツールで穴 (図 2E) の端を滑らかにし、内側に 4 本の溝を作る穴の縁 (図 2E、インセット) 回転中に穴の排水を容易にします。
4. 12 mm の穴パンチ、非毒性ダブル両面接着シリコン ラバー シートから 12 mm 径ディスクをカットします。標準的な 1 つの穴紙パンチ (6 mm 径) を使用して、各ディスクの中心の穴を作る。
5. 70% エタノールで掘削管を洗浄、空気は生物学的安全キャビネットでそれらを乾燥し、滅菌チューブと生物学的安全キャビネットに UV ランプ (30 70 cm 平均距離で W) で 40 分パンチ接着ディスク。
6. チューブとディスクをすべて露出した表面が滅菌されているので 20 分後再配置します。無菌条件下で白の接着剤のディスクからバッキングをはがし、穴 (図 2F) を合わせ、チューブの外側にシリコン ラバーを貼る。
   注意: 紫外線暴露を避けるためには、眼の保護具を着用して、UV ランプの電源を入れる前にキャビネットを閉じます。
7. 12 mm 径フォトエッチング (100 番号センター 1 mm 正方形) ドイツのガラス coverslips をクリーンアップします。鉗子で優しく、coverslips を保持、エタノール、水、エタノールが続いて再び、続いてディップし、最後にエタノールを燃焼させる炎の coverslips をディップします。クールに coverslips を許可します。
8. Coverslips 鉗子で純水を coverslips 10 s. リンス 2 %3-アミノプロピルトリエトキシシラン アセトンに浸しし、乾いた空気で乾燥させて。
9. キャビネットの中に生物学的安全滅菌フィルター紙の上、coverslips を設定、UV 光を入れます。20 分間 coverslips のそれぞれの側を公開します。
   注意: 紫外線暴露を避けるためには、眼の保護具を着用して、UV ランプの電源を入れる前にキャビネットを閉じます。

3. 海馬スライス標本

1. 解剖を開始する前に組織のチョッパーの両刃かみそりの刃の部分を準備します。ブレードを慎重に指で縦に折り、半分にはめ込みます。
2. 無水エタノールで処理した後、それらをきれいにし、乾燥空気に綿棒を使用してアセトンでブレードの半分をすすいでください。

組織チョッパー半分ブレードに固定する前に 70% のエタノールで洗浄して滅菌します。

機関動物ケアおよび使用委員会; 承認プロトコルに従ってください。イソフルラン麻酔後斬首で 4-7 日古いマウスまたはラットの子犬を安楽死させるし、ハサミやギロチンで頭を削除します。
注: 脳スライス培養のプロトコル、マウスまたはラット系統または遺伝子型依存しません。異なる遺伝的背景を持つ多くのトランスジェニック マウスの線を使用しています。

70% エタノール, 頭をすすぎ、60 mm シャーレ内に置きます。ローラ チューブに脳スライスの最終的な取り付け、まで次の手順のすべては無菌性を維持する層流フードで実行されます。

#21 外科ブレードを使用して、皮膚と頭蓋骨の矢状切断面を作る。#5 ・ デュモン鉗子で皮膚と脳を公開する頭蓋骨をはがします。

閉じた鉗子で優しくを引き出す全脳脳幹、小脳の後ろに鉗子でつまんでそれを解放します。4 ° C Gey バランスの取れた塩 Solution/0.5% グルコース (ブドウ糖/GBSS) 滅菌 60 mm ディッシュに脳を配置します。

解剖顕微鏡を使用すると、(図 3A) 脳を可視化する、脳背側を上に置き、外科ブレード (図 3B) と脳や小脳のフロント 3 番目カットします。

1. 鉗子、安定用シャーレの側面に対して後方側を上にトリミングされた脳と腹側を保持します。優しく矢状面の正中線を離れて髄膜をいじめるし、微細先端・ デュモン #5 鉗子 (図 3C、破線の円内) による中脳組織を削除します。
2. それは開いている (図 3C破線) を広めるため脳の側に沿って 2 つのカットを作る。脳には、背側を下、しゅろ、配置されます、一度海馬の割れ目が見えるはず (図 3D矢印)。
3. Polychlorotrifluoroethylene プラスチック フィルムの部分に広がり開いて脳を転送し、スライス組織チョッパーのステージ上の位置します。GBSS/グルコースとブレードをウェットし、海馬を ~ 300 μ m の厚さのスライスに切る。
4. 転送ピペットと GBSS/グルコース (図 3E) を含む新鮮な 60 mm ディッシュにプラスチック フィルムをスライスした脳をフラッシュします。優しくピンチオフし、罰金の先端の鉗子、残り髄膜スライス (図 3G, H) から他の非海馬組織 (図 3F) といじめます。

4. めっきスライス

1. スライスを取得すると、準備された coverslip のフォトエッチング側のセンターに鶏プラズマの 2 μ L を配置します。わずか 3 〜 4 mm 径スポットを達成するためにプラズマを広めます。
   注: フォトエッチング側はその数字が正しい向きで解剖顕微鏡を通して見るとカバーガラスの上にあります。
2. 1 脳スライスを滅菌狭い先端ヘラ (図 4A) でプラズマ スポット (図 4B) に転送します。GBSS/グルコースからスライスを持ち上げながらヘラの先端で、スライスを維持して閉じ鉗子を使用します。
3. プラズマ閉じ鉗子と、coverslip のスポットにヘラをタッチ、coverslip の上にスライスをプッシュします。
4. 別のチューブでトロンビンの 2.5 μ L でプラズマのミックス 2.5 μ。(図 4B) それをミックスする、優しくこの混合物とスライスと上下のピペットの 2.5 μ L をすばやく配置します。
   プラズマがので、これはすぐに行う必要があります 10-15 秒内で凝固する注:。スライスの接着が問題 5 μ L で 5 μ L の血漿をミックス スライス、スライス、coverslip の上に平らになるように混合した後いくつかの取り外しで 4-5 μ L を使用してください。
5. クリアパーツ以前ローラ チューブに貼付シリコーン系粘着剤の露出側からカバーを取り外し、穴 (図 4C) 内のスライスを合わせ接着剤に脳スライス coverslip。
6. 密着性を確保するため、ソフト、coverslip を均等に押しそれ約 1 分の生物学的安全キャビネットに転送しながら親指で coverslip にも圧力を適用されます。
7. 生物学的安全キャビネットで各管 (図 4D) に完全な Neurobasal の培養液 (材料表) の 0.8 mL を追加します。
8. クランプが保有する安全に滅菌綿接続パスツール ピペットで 5% CO₂95% 空気混合を流れ。ガスの混合物をローラ チューブをフラッシュし、それがピペットの周りから引き出されると急速にチューブをキャップします。
9. チューブをスライス番号とラベルし、数をラックします。幾何学的均衡を保っていることを確認、ローラー ラックにチューブを挿入します。チューブの数が奇数がある場合は、バランス チューブを追加します。
10. ローラーについてでローラー ラックを回す 35 ° C のローラー インキュベーターでラックを配置 10 13 RPH (図 4E)。チューブの底に培地を維持、インキュベーターの傾きは、ボード上のフロントを上げることによって約 5 ° をバックアップします。
11. スライス トリートメントや観測の日付のすべての情報を記録に使用されるスプレッドシートにスライスと管の番号を入力します。
12. 上約文化では、6 日目は、各管にアクティブ プラスミンの 1 μ L (0.002 U) を追加。
13. 血栓が完全に溶解した後 (通常数時間以内)、メディアを取り出して、プラスミンせず新鮮な媒体を置き換えます。必要であればスライスをプラスミンで夜通し孵化することができ、媒体変更次の日。
14. スライスは、通常の実験で使用する前に、少なくとも 7-10 日間孵化します。培地を吸引し、7 日目とその後 7 日ごとに再び 3 または 4 日に換えます。

5. 遺伝子発現ウイルスベクターの準備

注: スライス培養神経細胞における遺伝子の発現により遺伝子組み換え齧歯類から脳を使用してか、遺伝子を導入することにより組換え複製欠損ウイルスによる感染。(AV) アデノ ウイルス、アデノ随伴ウイルス (AAV) および組換えレンチ ウイルスのベクトルがすべてで使用されて私たちの海馬スライス培養脳スライスのキメラを異なる蛍光タンパク質の発現。

1. ^13,14法によると利息の RNA を表現するため欠乏 AV は別記レプリケーションの準備します。価としてウイルス発現蛋白に対する抗体を用いたシリアル希釈法による感染 U/mL にウイルス説明¹⁴。コフィリン集計およびコフィリン アクチン ロッド形成を観察するには、コフィリン R21Q mRFP cDNA (プラスミド #51279)¹⁶を利用します。
   注: サイトメガロ ウイルス プロモーターは多くの細胞タイプ¹³で高発現レベルを駆動するために役に立つに対し、synapsin 1 プロモーターは神経細胞特異的発現¹⁵に最適です。
2. 興味の遺伝子を含むプラスミドと担当者/キャップ プラスミド、ヘルパー プラスミドの有無は転送の共トランスフェクションによる AAV を上記^17,18としてウイルス E1 遺伝子を供給する HEK293 包装セルに準備します。
   注: 組換え AAV は、ターゲット ホスト細胞ゲノム¹⁹挿入用も作ることが。転送プラスミド C 末端 mRFP1 蛍光タンパク質タグ (プラスミド #50856) synapsin プロモーターを含む AAV プラスミド下流からカルシウム センサー GCaMP5G²⁰にクローン人間コフィリン 1 を使用します。P2A 割自己ペプチッド シーケンスを符号化する DNA の断片が GCaMP5G とコフィリン RFP の PCR による単一 AAV トラン スクリプト²¹から両方の蛋白質の表現を提供するために転送プラスミッドの準備の間に挿入されます。
3. 遺伝子または分割ウイルス ギャグやポル、rev、vsv g 遺伝子上に混合物を包装第 3 世代レンチ ウイルスと共に、関心と統合信号の cDNA を含む伝達プラスミドの共トランスフェクションによる組換えレンチ ウイルスのベクトルを準備します。3 つの独立したプラスミド^22,23。
4. 転送プラスミド シングル ステップ システム²⁴のクローン作成を使用して synapsin プロモーターとコフィリン R21Q mRFP cDNA (プラスミド #51279) から pLKO.1 GFP (プラスミド #30323) を synapsin のプロモーターとコフィリン-R21Q-mRFP、hPGK の交換にまとめるプロモーターと GFP cDNA、それぞれ。
5. 使って、最終的なプラスミド HEK293T 細胞にカルシウム リン酸によって前述²³として。
6. 10 cm の 4 つの料理から媒体を収集、150 K カットオフ遠心コンセントレーターを使用して 500 μ L に集中およびクイック液体窒素で凍結後、小さい因数で-80 ° C で最終的なレンチ ウイルスを保存します。細胞に感染した 1 回だけ因数を解凍します。
7. 各型のウイルス量は感染後ウイルスの様々 なボリュームと、遺伝子の表現に従う文化別のスライス数を設定して必要な式の程度を達成するために準備を経験的決定します。
   注: 通常、ウイルスの 1-10 μ L は、1 スライス当たり使用されます。

6. スライス トリートメント

1. ウイルスに感染しているスライス
   1. ベクトルの適切な生物学的安全性レベルのウイルス仕事のため承認された生物学的安全キャビネットでの作業、ウイルス (通常 1-10 μ L) の因数を 0.8 mL の完全培に混ぜてください。
   2. 漂白剤を含むコレクション トラップに滅菌パスツール ピペットを使用してスライスから培地を吸引します。最初のトラップと真空源間二次トラップを使用常にします。
   3. この媒体に置き換えて実施上ウイルス含む因数、ラックに培養管を戻り、インキュベーターに配置。
   4. ウイルスの生物学的安全キャビネットとスライスの培養の 2-5 日後転送滅菌ピペットでウイルスを含んでいる媒体を削除し、ウイルスを殺すために承認された抗ウイルス剤が含まれているボトルに入れます。
2. 重要な染料とニューロンの染色
   1. 準備しクイック因数 100 μ M の濃度で液体窒素中で凍結 4 μ L で神経の重要な色素²⁵の因数を格納し、-20 ° C でこれらを格納ないフリーズ/フリーズ解除染料 2 回以上。
   2. ラベルの蛍光顕微鏡による可視化のためのニューロン、神経の重要な染料の 1 つの因数を解凍し、完全 Neurobasal 培地で 4 mL に希釈する (最終的な色素の濃度は 100 nM)。
   3. 誤嚥によって (または転送ピペットの中にウイルスが含まれている場合)、スライスからメディアを取り出して、0.8 ml 100 nM の神経の重要な染料を含む培地の交換します。スライスをインキュベーターのローラー装置に戻ります。
   4. 2 h のスライスをインキュベート後色素含有培地を吸引し、0.8 mL の生物学的安全キャビネットで新鮮な完全培と置き換えます。
      注: 分類の重要な染料を使用してスライスにおける神経細胞の培養のいくつかの時間が必要です。最初の画像は通常、色素治療後 24 時間を取られます。ニューロンにラベルを付ける特に神経イメージングよりを与えるため 2-3 日間の下落背景の蛍光性があります。72 時間後重要な染料の強度が低下します。
   5. スライス形態変化を時間の経過に従って、スライスごとに 7 日間のラベルを書き換えます。

7. スライス画像

1. 倒立顕微鏡上のスライスを表示します。明るい蛍光イメージング、イメージング、前に 24 h のフェノールレッド pH インジケーターせず完全 Neurobasal A 培地と培養液を交換します。
   注: にとってはここで報告した実験、スライスは線形エンコードを搭載した倒立回転のディスク共焦点レーザー蛍光顕微鏡で見ている x, y ステージ ピエゾ z コントロールと敏感な高解像度デジタル カメラ。
2. ローラ管装置から、coverslip を垂直に保つためにステージ アダプター (図 5B) に配置されている特注チューブ ホルダー (図 5A) にイメージを作成するスライス培養管を転送します。目的および長い間隔で反復的なイメージング セッション中に同じ方向にスライスを維持します。
3. ステージ アダプター (図 5B) の位置に管を保持するためにチューブに対してタイトなスライダーにプッシュします。

暖房ストリップとカスタムメイド ステージ アダプター (図 5C) に組み込まれている体温調節コント ローラーの使用によって、イメージング中に 35 ° C でスライス温度を維持します。
注: チューブ ホルダーの詳細ステージ アダプターとヒーターにアクセスできる: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/。

低消費電力を使用して (例えば.、4 X) 客観的かつ明るいフィールド透視、スライスの下フォトエッチング グリッド パターン (図 6A) に焦点を当てます。初期イメージング セッションの迅速に高倍率の画像が必要な様々 な地域の番号を記録してスライスの周りをスキャン (例えば、コルニュ ammonis (CA) 1、CA3,歯状回 (DG) 等)。

関心の領域を含む最初のグリッドの正方形にステージを移動します。空気目的 X 20 に切り替え、フィデューシャル マークを探します (e.g。、エッチングの数のヒント) (図 6B)。

高い発電の目的 (40 X 60 X) に切り替えると、ローカライズ フィデューシャル マークと、レコード x ステージの y 位置。名所近くとレコード フィデューシャル マーク (図 6B矢印) からの x および y オフセット フィールドを見つけるためのステージを移動します。必要な場合、他のグリッド領域で繰り返します。
注: これらのオフ設定位置基準マークから許可スライスのイメージを作成するとき、同じ coverslip 場所の一貫性のある特定元 x, y 基準マークの設定変更されてもいつチューブまたはステージ アダプター取り外して交換します。

利用可能な場合は、顕微鏡客観的コントロールまたはピエゾ ステージ コントロールのいずれかを使用して選択した各フィールド内のイメージ Z スタックをキャプチャします。
注: 画像は一般サイズと画像特徴の目的の解像度に応じて、2 μ m の 0.5 μ m の間隔で取得されます。品質の 3 D 画像を構築する必要がありますイメージ機能拡張買収、複数の平面上の小さな機能を視覚化するより小さい間隔、平面間で必要な。

イメージングの各スライスを可能な限り短い時間合計を維持します。
注: ほとんどのイメージング セッション報告ここで 18 分/スライスの下にあった。ただし、回数とも、以上のいくつかのスライスをイメージしてスライスの長期的な生存率の明らかな害がなく、単一のセッションで 40 分と長い。

Results

フィディシャル マークを正確にどのように判断に活用できる時間をかけて同じフィールド内で同じセルを減らせる、フォトエッチング coverslips (図 6A) 上に成長したスライスを調べた。ニューロンは重要な染料との汚損によって視覚化された (100 nM の 2 h のため非神経細胞に染色されません)、²⁵の細胞を傷つけることがなく時間をかけてニューロンから消えます。我々 識別する基準ラベル付け後に重要な色素標識細胞 24 h の領域を見つけた 1 つのグリッドの正方形 (図 6A, B) でマーク記録 x と y オフセット基準マーク (図 6B) からの位置および収集60 × 対物 4 日間連続でイメージングを繰り返し、この地域の共焦点画像の...

Discussion

ここで説明したロール チューブ法は、長期培養とスライスした脳組織の高解像度のライブ イメージングします。ここで適用されるのスライス技術で一つの大きな問題は、取り付けとスライスのメンテナンスです。スライス接着をサポート Coverslip コーティング促進神経突起の伸長と細胞のスライスからの移動を高めることによってスライスが薄くなります。したがって、我々 はこれらの基板の使用を避けた。3-アミノプロピルトリエトキシシラン処理によるガラス上にアミノ基の挿入改善、スライスの付着が少なすぎる、またはあまりにも多く、coverslip 鶏プラズマもスライスの損失につながる遵守問題が発生します。適切な接着に必要な血漿量培養脳スライスのサイズに依存して、したがって、マウス脳切片よりも周辺地域で約 4 倍、ラット海馬スライス用大きく。あまりにも多くのプラズマは、スライスの下凝固、細胞接着、coverslip が障害、プラスミン治療は位置を変更または完全にデタッチするのでスライスを緩め。ただし、血栓のあまりにも小さなプラズマは、インキュベーターの回転の最初の数日中にスライス損失につながる可能性があります。39 スライスを含む最近の実験、3 つは失われたが...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 cmの培養皿VWR	サイエンティフィック	25384-326
フィリップスヘッド小ネジ(#10-32)	ACEハードウェア		長さ2.5インチ、直径3/16インチ
フラットワッシャー#10	ACEハードウェア
小ネジナット(#10-32)	ACEハードウェア
ゴムグロメット	ACEハードウェア		/16インチ、厚さ5/8インチ、穴径1.125インチ、OD
ポリエチレンチューブ(5/16インチ;外径、3/16インチ;ID)	ACEハードウェア		1.8インチの長さにカット
ワッシャー#10	ACEハードウェア
ドリルプレス、5速	Ace Hardware	ProTech Model 1201
Nunclon Delta フラットサイド チューブ	VWR	62407-076
ドリル ビット、3 mm、6 mm、15 mm	Ace Hardware	Diablo freudブランドの	プラスチックを切断するためのドリルビット。
木材用ドリルビット、1.5 cmおよび1 mm	スハードウェア
ウッドファイル、1/4 "ラウンド	エースハーウェア
スプリングクリップ、16 mmスナップホルダー	スハードウェア
スイベルヘッドバリ取りツール、5 "	エースハードウェア	26307
接着シリコーンシート(セキュアシール)	Grace Bio-Labs	666581	0.5 mm厚
6 mm穴パンチ	オフィス最大
12 mm穴パンチ	thepunchbunch.com
70%エタノール
フォトテックカバースリップ、直径12 mm	コガラス株式会社	1916-91012
ブンゼンバーナー
無水エタノール
ナノ純水
3-アミノプロピルトリエトキシラン	Sigma-Aldrich	A3648
アセトン	Sigma-Aldrich	179124
#5 デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11251-30
マキルウェインティッシュチョッパー	テッドペラ株式会社	10180
両刃カミソリの刃テッド	ペラ株式会社	121-6
Whatman Filter Paper	VWR	28450-182	直径 5.8 cm の円にカット
ポリ - クロロ - トリフルオロ - エチレン (Aclar)	Ted Pella, Inc.	10501-10	5.8cmの円にカット
#21外科用ブレード	VWRサイエンティフィック	25860-144
#5デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11251-30
スパチュラ、テーパーエンド付きステンレス	VWR	82027-518
のバランスの取れた塩溶液	シグマ-アルドリッチ	G9779
グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15023-021	25%(w / v)溶液、0.2 mmフィルター滅菌チキン
プラズマ	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	滅菌水で再水和し、2500 x g 30分で4°Cで遠心分離します。C、液体窒素でアリコートを急速冷凍し、 -80°C。
トロンビン、局所(ウシ)	ファイザー	トロンビン-JMI	液体窒素中の急速凍結アリコートは、希釈剤で 1,000 国際単位/mL で提供され、-80°C で保存されます。 250ユニット/mLでご使用ください。
セルローラーシステム	Bellco Biotech	SciERA
ローラーインキュベーター	Forma	Model 3956
N21-MAX	ThermoFisher Scientific	AR008
Pen/Strep (100X)	ThermoFisher Scientific	15140122
200 mM Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081
Glucose	ThermoFisherScientific	15023-021	25% (w/v) 溶液、0.2 mm フィルター滅菌
ニューロベースル A	ThermoFisher Scientific	10888-022	完全培地:48 mL Neurobasal A、1 mL N21-MAX、0.625 mL 200 mM グルタミン、0.180 mL 25% グルコース、0.250 mL 100x ペン/連鎖球菌
第3世代レンチウイルス包装	ライフテクノロジー	K4975-00
159 K カットオフ遠心フィルター (Centricon)	EMD Millipore
レンチウイルス クローニング システム (InFusion)	Clonetech
プラスミド 30323, 50856, 51279	Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO)	Stemcell technologies	1801	一度解凍し、4µで急速冷凍します。Lアリコート。-20°Cで保管します。C
倒立顕微鏡	オリンパス	IX83
顕微鏡対物レンズ	オリンパス	エア:4倍、20倍、オイル:40倍、60倍、
スピニングディスク 共焦点システム	横川	CSU22
顕微鏡 EMCCDカメラ	フォトメトリクス	カスケードII
リニアエンコード(x,y)、ピエゾz フラットトップステージ	ASI
顕微鏡レーザーと統合	インテリジェントイメージングイノベーション
HEK293T細胞	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-3216
ヒトプラスミン	シグマ Aldrich	P1867	0.002 U/mL 0.1% ウシ血清アルブミン (0.2 mm フィルター滅菌済み)、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。