方法論記事

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

DOI：

10.3791/56443

⸱

2018年4月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., 2Department of Veterinary Science, University of Parma, 3Department of Molecular Genetics, Erasmus MC, 4Department of Molecular Genetics, Vascular Surgery, Radiation Oncology, Erasmus MC, 5Fluidda NV

この記事について

サマリー

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非侵襲的なマルチ モーダル イメージング ブレオマイシンの二重気管内投与によるマウス肺線維症モデルの縦断的評価のマイクロ CT と蛍光分子トモグラフィを用いた手法について述べる.

要約

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特発性肺線維症 (IPF)、肺機能、呼吸不全からのそれに続く死の大幅な悪化を引き起こす肺建築の進行性で不可逆的な破壊によって特徴付けられる致命的な肺疾患です。

ブレオマイシン投与による実験動物モデルで IPF の病態を誘導されています。本研究では、二重気管ブレオマイシン投与により誘導されるマウスの IPF のようなモデルを調査します。肺線維症を研究するために使用される標準的な組織学的評価は、ターミナルの侵襲です。この作品の目的は蛍光分子トモグラフィ (FMT) とマイクロ CT などの非侵襲的イメージングによる肺の線維化を監視、します。これら 2 つのテクノロジ組織学所見と検証は、IPF 疾患重症度と進行の実時間非侵襲的モニタリングのための革命的な機能アプローチを表すことができます。さまざまなアプローチの融合を表す IPF 病、どこ FMT と病的な状態で発生する分子のイベントを観察し、マイクロ CT でその後の解剖学的変化を監視できるを理解するための一歩

概要

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特発性肺線維症 (IPF) は慢性肺疾患肺機能を診断1の 4 年以内でしばしば致命的な残念ながら徐々 に減少。IPF の主な機能は細胞外マトリックスの沈着および線維芽細胞増殖が、発症機序はまだよくわかっていません。最もサポートされている仮説は間葉系細胞周期の増殖の変化、線維芽細胞の芽、誇張された蓄積につながる肺胞上皮細胞の破壊、肺傷害の複数のサイクルを引き起こすと増加マトリックス生産。マトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp) は、線維化開発人間 IPF、ブレオマイシン誘導動物モデルで調節不全を発見されている、これらのプロセスに関与するメディエーター。制御不能の MMP 生産は模倣した異常な傷修理1,2肺間質および肺胞腔内アンバランス コラーゲン沈着に します。

薬剤の発見および開発の主要な障害の 1 つは、人間の病態や病気の表現型を模倣するアクセス可能なマウス モデルの可用性です。異なるエージェントは、動物モデルにおける肺の線維化を誘導するために使用されている: 照射損傷、アスベスト、シリカ、fibrinogenic サイトカインやブレオマイシン3,4の管理の管理しかし、ブレオマイシンは最も使用されるマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ5または大きい動物 (人間以外の霊長類、馬、犬、反芻動物)6,7。ブレオマイシンは細菌放線菌ブレオマシシン8製抗生物質、抗悪性腫瘍剤9として使用されます。この理由、薬の一般的な副作用は、肺線維症、肺線維症を誘発するのに実験動物モデルで使用されます。

ブレオマイシン誘発肺線維症モデルにおける線維化病変にはブレオマイシン投与後 14-21 日が発生します。提示された作品でダブル ブレオマイシン気管内投与によるマウスにおける肺の線維化を誘導するのに新しいプロトコルを使用しました。ブレオマイシン マウス モデルは新しい薬が確立された線維化病変を評価する必要があるため非常に時間がかかるが、抗炎症作用と抗線維化効果を区別するテストします。

コラーゲン含有量、形態計測学的および組織学的解析の生化学的定量は、ポスト解析、同じ動物の疾病の発症機序に続く可能性を制限することに基づいていた。これらのパラメーターは、線維化の評価のためのゴールド スタンダードが考慮されたが彼らいない線維化病変の頒布時間や空間を提供して病気の進行のプロセスを調査する方法を排除します。10

最近では、非侵襲的イメージング技術は、モニター気道リモデリング、炎症、そしてマウスモデルで線維化の進行に適用されている: 磁気共鳴イメージ投射 (MRI)、マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT)、蛍光分子トモグラフィー (FMT) と発光 (結合)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21。縦、ブレオマイシン挑戦22後別の時間ポイントで FMT とマイクロ CT による肺線維化の進行を監視する非侵襲的イメージング手法を提案する.

多くの経路が確立と線維化の開発に関与しているし、あまり知られています。これらのプロセスのより深い理解だけを診療所に転送可能性がありますより多くの創薬ターゲットに変換でした。縦マイクロ CT で肺の二次性変化の検出に結合された蛍光分子トモグラフィにより MMP の活性化を監視する機能は、治療への臨床応答にアクセスするため、将来的にされる可能性があります。

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プロトコル

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記載すべての動物実験は、学内 Chiesi Farmaceutici とエラスムス MC プロトコル番号の下の動物実験動物福祉委員会が承認した: ヨーロッパの指令 2010年/63 UE の遵守 EMC 3349 (138-14-07)イタリア D.Lgs 26/2014 年と改訂」ガイドのケアと使用の実験動物」23。

注意: 使用前にローカル ビバリウムの条件に、少なくとも 7 日間順応された女性の近交系 c57bl/6 (7-8 週古い) マウス (部屋の温度: 20-24 ° C; 相対湿度: 40 ~ 70%; 12 時間の明暗サイクル)、標準的な齧歯動物の食事への無料アクセスを持っていることと軟化の水道水。

1. 気管内治療ブレオマイシンをマウスの

  1. イントラ気管内投与12,13,14のための機器を準備します。
  2. 酸素と混合 2.5% で設定イソフルラン気化器に接続されている麻酔室にマウスを置きます。つま先ピンチ応答の欠如によって麻酔の深さを確認します。3-5 分後に麻酔の効果が発生しました。
  3. 挿管プラットフォーム上麻酔下のマウスの位置、その前歯にぶら下がってワイヤー上に配置。
  4. 喉頭鏡をオンに、鈍い期鉗子のペアを取る、鉗子または喉頭鏡のヒントを使用して、ゆっくり口を開きます。
  5. 舌を抜くし、鉗子で側にそれを保持します。気管の開口部は可視化まで、口の奥の喉頭鏡ブレードの場所、場所で喉頭鏡を保ちます。
  6. もう一方の手で、三方バルブを回転、気管に PE チューブのエンドに接続分配チューブを挿入します。ブレオマイシン (0.020 μ g/マウス) の 50 μ L を実現します。後、窒息を防ぐために気管チューブをすばやく削除します。数秒間マウスを直立した握る。
    1. 0 日にブレオマイシン気管を管理し、日 4 (図 1) を繰り返します。
  7. 挿管のプラットフォームから、マウスを削除し、(完全に麻酔から回復に必要な時間) で 30 分間マウスを監視します。
  8. 生体内イメージング FMT とマイクロ CT によるマウス肺の 7、14、21 日にダブル ブレオマイシン投与後を実行します。

2 蛍光分子トモグラフィー法によるin vivoイメージング。

注: は、あらかじめ MMP 敏感な蛍光基板の 680 食塩 (塩化ナトリウム 0.9%)、およびストアに使用する前に 4 ° C で光から保護 6 nmol/mL の新鮮な在庫ソリューションを準備します。それは 4 ° C で最大 6 ヶ月安定MMP の動物に注入する前に部屋の温度平衡に造影剤を許可します。

  1. プローブ注入
    1. MMP のプローブ溶液の静脈内投与のための機器を準備します。事前マウス尾を加熱する 50 ° C で水を温めます。
    2. マウスの首筋をしっかりと把握するには、尾でそれを取るし、ケージの蓋をつかむことができます。動物の肩に、マウスを押したまま、尾を 4 尾皮膚の熱損傷を防ぐために最大 8 s 熱損傷のための暖かい水ビーカーに入れてください。 簡単に可視化、針挿入腫れ静脈を確認します。
    3. 注入中には、それを安定に保つと背面の特別な穴から尾を引いてプラスチック落にマウスを置きます。尾輪のどちら側でも 2 つの尾静脈を見つける尾の下側に動脈ではないです。
    4. 1 mL の注射器の針 (26 G) を静脈に挿入します。針を正しく配置すると、注入は簡単、プローブ溶液は容器に流れが。
    5. 10 mL/kg で MMP プローブ溶液を注入します。
    6. 針を破棄します。
      注: 最適な撮像時間ポイント MMP プローブ注入後プローブによってアクティブにするために必要な時間だから 24 h があります。縦断的研究を実行すると、マウスからエージェントの完全なクリアランスによって、7 日が、最適な再注入時間。
  2. FMT イメージング
    注: が起動する前に、必ずここの散乱体内吸光度を避けるために、胸に、イメージを作成する、動物のエリアのあちこちに毛皮を取り外してください。
    1. マウスを麻酔、麻酔室に入れて誘導の 2.5%、保守の 2% にイソフルラン ダイヤルを回します。
    2. データ集録ソフトウェアを初期化し、実験データベースで新しい研究を開きます。
    3. 開始する前に、fmt、イメージングは、イメージングのカセットにマウスを転送します。FMT のビューのフィールドの使用を最適化してカセットを画像の真ん中に麻酔下のマウスを置きます。イメージングのカセットの両方の windows に対してマウス フラット、安全で優しく圧縮をしてください。カセットのノブによって高さを調整し、ドッキング ステーションにスライドさせます。
    4. スキャン ウィンドウの件名をクリックし、ライブ画像を表示するプレビューをクリックします。
    5. 蛍光の予想される周辺組織がキャプチャされるように、十分な大きさのスキャン領域を描画します。25 スキャン ポイント保証の合計を含む肺野領域は完全スキャンになります。
    6. 投資収益率が表示されたらまず復興キューに追加] をクリックして、マウスのイメージをスキャンをクリックします。確認正しいレーザー 680 nm を選択。
    7. 画像の取り込みが完了したら、そのケージにマウスを配置します。それは完全に麻酔から回復することを確認します。
    8. ROI ツールを使用して分析ソフトウェアの解析ウィンドウで蛍光の picomoles を定量化し、およそ 700-800 mm3肺野領域からの信号に投資収益率を減らします。肝臓の信号を除外するように注意します。次元で類似のそれらを持って、各動物のイメージで彼らの位置を調整する他の科目に ROI をコピーします。
    9. 画像を jpg ファイルとしてエクスポートします。

3 マイクロ CT による生体内イメージング。

注意: 始める前に、常に金属製のジュエリーや削除、x 線の散乱を避けるためにイメージング領域の近くの金属の物体。

注: 放射線誘発肺線維症は放射線の中に一般的な検索による肺傷害24 です。マイクロ CT 派生指標も肺線維症に関連する所見イメージング セッション、x 線量がマイクロ CT 中に動物に配信されることを示す 4 つのマイクロ CT を受ける 21 日に生理食塩水処理制御マウスに存在していた試験は、調査結果に影響を与えるのに十分でした。

  1. 緑色の電源ボタンを押してオンにマイクロ CT と x 線源を暖めるソフトウェアを起動します。マウス イメージング用小口径と動物のベッドを使用します。
  2. 新しい 1 つの新しいデータベースをクリックしてデータベースを作成し、ビルド ブラウザー実験では、マウスの数に基づいて、または既存のデータベースへの接続を以前に作成したデータを保存する] をクリックします。
  3. スキャンを開始する前にソフトウェア コントロール ウィンドウのアクイジション ・ パラメーターを選択: x 線管電圧 90 kV;CT x 線管電流、160 μ A;ライブ x 線管電流、80 μ A;FOV、36 の mm;ないのゲーティング技術;スキャン技術は、高解像度 4 分。
  4. マウスを 3% イソフルレンの吸入麻酔し、麻酔薬の一定した供給を提供する鼻の円錐形の穴に挿入されてベッドの上に置きます。テープ公開する胸を許可するようにベッドの上でマウスの足を固定します。
  5. 楽器ドアにスライドしてキャプチャ ボタンを押すとリアルタイムでマウスの位置を表示するライブ モードをオンにします。視野 (FOV) 直接 CT 装置にあるボタンを使用して、胸を合わせて動物のベッドに移動します。センター; マウスのスキャンそうでない場合は CT 装置にある左右の矢印の位置を調整します。
  6. 90 °を選択し、設定をクリックして、ガントリーを回転させることにより最適なベッドの位置を確認します。FOV 内イメージ領域に完全に存在することを確認します。
  7. すべてのゲーティング技術を適用しないし、 CT スキャンボタンをクリックしてスキャンを開始します。はいx 線源をオンになることを通知するメッセージをクリックします。
    注: x 線をオンに、楽器の上にオレンジ色のランプが点灯、引き戸はオペレーターの安全のために開くことが可能になります。スキャンが完了すると、2 D ビューアー ソフトウェアの新しいウィンドウが表示され、トランスアキシャル、コロナと復興の矢状のスライス表示。
  8. 画像の品質を確認し、麻酔の低レベルのための動きからの画像がぼやけているしないでください。必要に応じて、スキャンを繰り返します。
  9. 動物ケージに戻し、必ず彼らは完全に麻酔から回復します。

4. 気管支肺胞洗浄

  1. 腹部大動脈からの出血によって 3% イソフルランと犠牲動物を麻酔します。
  2. はさみを使用して、胸郭と首を公開します。気管を公開、バル手順を 1 mL 注射器針なしの 21 ゲージ洗浄チューブを実行するを許可するように小切開を加えます。気管を切らないように注意してください。
  3. BAL を実行する 0.6 ml の滅菌溶液の 1 mL 注射器針なしを入力 [10 x ハンクの平衡塩溶液 (HBSS); 100 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic 酸 (HEPES); 蒸留水]。
  4. 洗浄チューブを気管切開挿入しゆっくり注入し、その後の分析のため BALF の最適なコレクションを許可する第 3 の撤退に一時停止 3 回ソリューションを撤回します。

5. 組織と強度

  1. 公開し 10% 中性緩衝ホルマリンの 0.6 mL で穏やかな注入によってそれらを気管カニューレと膨張肺を取り出して室温 24 時間サンプルを保管します。
  2. 脱水アルコール溶液 (60% のエタノールの 1 h、1 h、90% のエタノールの 1 h、2 h の 95% エタノール 70% エタノールと 2 h の 100% エタノール) の濃度の増加で別の通路を通ってサンプル自動ティッシュ プロセッサを使用しています。
  3. それらを半透明に 2 h のキシレンに試験片を配置します。脱水の最後に、3 h の 60 ° C でパラフィンのサンプルに潜入し、自動化されたプロセッサに埋め込みます。
  4. 5 μ m 厚連続切片をミクロトームを使用してを取得します。
  5. Deparaffinize エタノールの降順の等級のスライドを水分補給し、自動ティッシュ プロセッサを使用してマッソンの Trichrome で染色します。
  6. 手動でスライド スキャナーを使用して 20 倍の倍率でスキャン、肺のスライスに焦点を当てる、451 nm/ピクセルの解像度で閲覧ソフトを使用して全体の肺セクションのデジタル画像をキャプチャします。
  7. とおりの半定量・定量パラメーターによって線維化肺損傷形態学的評価します。
    1. アシュクロフト スコアを決定します。アシュクロフト10 Hübnerらによって変更によって定義されたスケールに従って肺セクション半定量的グレード形態の変化25 0-8 のシステム使用する肺セクションのすべての柔組織を評価するスコアします。
    2. コラーゲン含有量を決定します。顕微鏡画像解析ソフトによって線維症10、25の程度を定量化します。10 倍の倍率は、各スライドごとに 3 つ・ ロワをランダムに選択します。色のしきい値設定の標準化、緑色に塗られた領域としてコラーゲンを検出します。
    3. 肺胞の空気領域を決定します。線維症の10、25の間接パラメーターとして肺胞の空気領域を定量化します。同じソフトウェアおよび線維症割合の適用・ ロワ、白しきい値を使用して Roi 内の空気領域を検出します。

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結果

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肺線維化病変の自然消退は、3 週間後に単一ブレオマイシン投与と適度な構造変化はこのモデルの限界を強調表示を観察しました。臨床実習17を表さない狭い治療ウィンドウによる予防治療のみを実行でした。

ここでは、ダブル ブレオマイシン気管内投与の私達のプロトコルがマウス18長期的な肺線維症を開発することができることを示します。図 119,20,21は、実験的なデザインを示しています。本研究の目的は、非侵襲的イメージング技術を持つマウスの肺線維化の進行を見てすることです。ブレオマイシンは気管内投与を 2 回 (0、4 日で都...

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ディスカッション

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現時点では多くの研究グループ新しい薬の開発に焦点を当てて IPF を治療するために、にもかかわらずに、2 つだけは患者に使用できるが。より効果的な療法7を見つけることの緊急医療の必要性があるだけ肺 transplantationis 4-5 年の26の生存を延長することができます。トランスレーショナル医学と新しい薬の開発のための必須の前提条件は、IPF のどの介入研究がクリニックでの成功の予測の機能を模倣する動物モデルの可用性です。ただし、既存の肺線維症の動物モデルの有用性はまだ物議を醸す27です。ブレオマイシン18図 1で説明したようの二重注入を必要とする肺線維症の新しいマウス ・ モデルを開発します。イメージング技術は、病気の進行と治療への薬理学的反応を可視化する強力なツールです。この動物モデルよりよく締めくくっている IPF の人間の機能と非侵襲的技術は臨床設定と臨床

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開示事項

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著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

謝辞

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著者は、技術的なヘルプ博士ダニエラ ポンピリオとロベルタ Ciccimarra を感謝したいです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
FMT 2500 蛍光断層撮影システムパーキン・エルマー社エクスペリメンタルビルダー
MMPsense 680Perkin Elmer Inc.NEV10126光から保護し、プローブを4°Cで保管します。C
TrueQuantソフトウェアPerkin Elmer Inc.
雌近交系 C57BL/6San Pietro NatisoneHorst, オランダ (UD), 使用前に、動物は少なくとも5日間、局所的なビバリウム条件に順応させました
イソフルランESTEVE spa571329.8しないでください
自動セルカウンターDasit XT 1800JExperimental Builder
生理食塩水、0.9% 塩化ナトリウム (NaCl)Eurospital15A2807
Quantum FX Micro-CT スキャナー パーキン・エルマー株式会社
Streptomyces verticillus由来のブレオマイシン硫酸塩 シグマ B2434 
自動ティッシュプロセッサー ATP700 Histo-Line LaboratoriesATP700 
埋め込みシステム EG 1160 ライカバイオシステムズEG 1160
ロータリーミクロトーム Slee Cut 6062
デジタルスライドスキャナー NanoZoomer S60、浜松ホトニクス
NIS-AR画像解析ソフトウェア ニコン
マッソンs Trichrome StainingHisto-Line Laboratories
10% 中性緩衝ホルマリンSigmaHT5012-1CS
ペンセンチュリーモデル DP-4M ドライパワーインファフレーターペンセンチュリーDPM-EXT
PE190 マイクロメディカルチューブ2biological instruments sncBB31695-PE/8
注射器 針なし 5mLテルモSS*05SE1はさみでピストンのボードをカット
ハミルトン 0.10 mL (モデル 1710)ガスタイト81022
ディスコフィックス 3 ウェイ ストップコックブラウン4095111
針付きシリンジ 1 mLPic solution3,071,260,300,320針なしで使用
プラスチック供給チューブ 18 ga x 50 mm2biological instruments sncFTP-18-50先端を斜めにカット 
吸入

参考文献

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タグ

CT FMT CT

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