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方法論記事

マウスの腹部大動脈 Myointimal 過形成を誘導するために気球を利用した傷害

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DOI：

10.3791/56477

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2018年2月7日

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1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University Heart Center, 2Department of Surgery, Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, University of California San Francisco (UCSF), 3Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK German Center for Cardiovascular Research, 4Cardiovascular Surgery, University Heart Center

この記事について

サマリー

この記事は、大動脈バルーン傷害の後 myointimal 過形成 (MH) の開発を研究するマウスモデルを示します。

要約

動物モデルの使用は、MH、動脈狭窄症の主要な原因の 1 つのより良い理解のために不可欠です。この記事では、大動物で確立された容器損傷モデルに匹敵するマウス バルーン侵食モデルを示しています。バルーン カテーテルを大動脈侵食モデルは臨床設定を模倣し、匹敵する病態と生理学的な変化に 。簡潔に、実行後水平切開腹部大動脈で、バルーンカテーテル、血管に挿入、水増し、逆行性導入します。バルーンのインフレは内膜傷害と容器の overdistension に します。カテーテルを抜去後、大動脈切開は単一 stiches を閉鎖します。この資料に示すモデルは再生可能で、行うには、簡単、迅速かつ確実に確立することができます。特に経済的な方法で適用することができます高価な実験的治療剤の評価に適しています。別のノックアウト マウス系統を用いた MH 開発の別の遺伝子の影響を評価できます。

概要

冠動脈および末梢動脈における動脈狭窄患者1の死亡率と罹患率に大きな影響があります。1 つの根本的な病理メカニズムは myointima 過形成 (MH)、増加増殖、移行、および血管平滑筋細胞 (SMC)2からの細胞外マトリックス蛋白質の合成によって特徴付けられる。SMC は容器のメディア層にあり、内腔の表面への刺激に移行します。刺激信号は成長因子、サイトカイン、細胞間連絡、脂質、細胞外マトリックス成分、機械的せん断をストレッチ力3,4,5,6あります。病理学的または医原性、血管壁の損傷血管内皮細胞と平滑筋細胞の損傷を引き起こすと炎症反応を刺激し、MH7につながります。

異なる動物モデルが現在利用できる myointima 増殖症動脈損傷を研究です。豚のような大型の動物や犬共有同様の動脈と冠動脈解剖学人間の利点を持っているし、特に血管形成技術、手順、およびデバイス8を調査し研究に適しています。ただし、豚モデルは、犬のみが軽度の血管傷害11レスポンス高い血栓9,10の欠点を持っています。さらに、特別な住宅、機器、およびスタッフは、高コストで接続されているし、常に、教育機関で利用されていないすべての大型動物モデルが必要です。実験動物は、ラットやマウスに含まれます。ラットと比較して、マウスは、低コストの利点とさまざまなモデルをノックアウトの存在があります。このビデオで説明されているモデルは、アポ-/-マウス西部飼料動脈硬化血管12血管形成術の臨床設定を忠実に再現すると併用できます。以前のモデルは、ワイヤー傷害13、流体乾燥14、春15、またはカフ傷害16を介して血管損傷を誘発しました。開発と MH の憲法にけがの性質に大きく影響するので臨床場面を模倣する最良の方法は、バルーン カテーテルを使用して血管損傷を誘発します。

この記事ではマウスのバルーンカテーテルと MH を誘導する手法について述べる.RX ポート (図 1 a) バルーンカテーテル (1.2 mm × 6 mm) の使用する内膜層のと同時に、船の overdistension の誘導にこする。これらの要因の両方が MH の開発のための重要なトリガーです。このモデルの観測時間は 28 日17歳です。

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プロトコル

動物実験動物の原則のためのガイドに準拠した人道的なケアを受けて、実験動物資源の研究所でを準備、健康の国民の協会によって公開されました。動物のすべてのプロトコルは、(「Amt こだわり健康を祝して und Verbraucherschutz、ハンザ (健康および消費者保護のためのオフィス)」) 責任がある地方自治体によって承認されました。

1. カテーテルの準備

注: はカテーテルについては材料の表を参照してください。

  1. カテーテルをカテーテル ホルダーから取る。
  2. うち遠位ポートを通して内腔からガイドワイヤーを引き上げます。
  3. カテーテルの遠位端にシアノアクリ レート系接着剤のドロップを置きます。
    注意: は、ラテックスやニトリル手袋を着用します。
  4. カテーテルの RX ポートにガイドワイヤを置き、遠位のポートに内腔進みます。その後、ガイドワイヤ少し引き終わりに 〜 5 mm のスペースを残して。
  5. 乾燥して接着剤を許可する 5 分を待ちます。
  6. ガイドワイヤを移動、それは修正される必要があります。まだ携帯電話の場合は、手順 1.3-1.6 を繰り返します。
  7. 1.5 mL 0.9% 生理食塩水 3 mL シリンジを入力し、バルーン膨張ポートに接続します。
  8. バルーンの膨張をテストするシリンジのプランジャーを押してください。0.6 mL のシリンジに生理食塩水を残します。

2. マウス作製

  1. 重さ約 30 g 14 週齢で雄マウスを取得します。
    注意: 動物実験動物研究所からの取得を使用しています。我々 はここで c57bl/6 j を使用しました。
  2. Anaesthetize 2.0 2.5 %isofurane (500 mL/分の酸素流量) とマウスに誘導室を使用します。
  3. 加熱パッドの上にマウスを置くし、マウスの鼻と口を覆うマスクで麻酔を維持します。後部のフィートと反射の不在を確認する尻尾をつまんで麻酔の十分な深さを確認します。
  4. 髪トリマーを使用して腹部の毛を削除します。
  5. 後肢の足を広げ、テープを使用して自分の位置を修正します。
  6. 続いて 80% エタノール、ポビドン ヨードを使用して腹部領域を消毒します。この手順をさらに 2 回繰り返します。
  7. 手術部位は汚染を取得されないように手術用ドレープを使用します。に沿って皮膚や筋肉層を開く、リネア アルバシザー (またはメス) 腹部の臓器を公開します。
  8. 0.9% 生理食塩水うるおい手袋で腸を置くし、湿潤を保つためにラップします。
  9. 腹部大動脈上脂肪組織を除去するのに 2 つの微細鉗子を使用します。
  10. インスリン注射器 (30 G) を使用して、下大静脈 (IVC) にヘパリン溶液 (50 U/mL) の 250 μ L を注入し、全身の分布の 3 分を待ちます。ヘパリンが止血を抑制し、手術中に不要な凝固を防ぐ。
  11. 2 つの鉗子を使用すると、その分岐とその発信の分岐血管まで高齢者大動脈を解剖します。
  12. 高温師と固定の領域に配置すると予想される側血管を縛る。
  13. 腎動脈のすぐ下に上行大動脈のクランプによって血流を停止します。
  14. 遠位大動脈分岐のすぐ上に 2 番目のクランプを配置します。
  15. 小さな水平切開血管に沿ってクランプの間の中間点にはさみを使用してを実行します。
    注: 切開の大きさは船のまわりの 3 分の 1 に相当する必要があります。
  16. 切開 (30 G) 針と注射器を挿入し、250 μ L ヘパリン溶液 (50 U/mL) と大動脈をフラッシュします。
  17. 10-0 縫合糸を使用して、切開の各側に 1 つの単一の結び目を配置します。
  18. 大動脈を切開に容器ガイドワイヤーを挿入して広げるし、容器を少し広げます。2 ~ 3 回拡張を繰り返します。
  19. 0.9% 生理食塩水をカテーテルに潤いを与えます。
  20. 大動脈に平面的なバルーンカテーテルを挿入し、大動脈に近位のクランプの方それを進めます。
  21. 近位部のクランプに達し、慎重に近位のクランプを開き、~0.6 mL の生理食塩水を注入することで血液の漏出を防ぐためにバルーンを膨らませます。
    注: 血管にバルーンを膨らませての比は 1.5: 1 です。
  22. 約 2 cm の逆行性のカテーテルを進めます。
  23. 注射器を外して少しバルーンをしぼませるながら戻って、拡張カテーテルを引き出します。
  24. カテーテル大動脈切開に達するとは、近位部のクランプを接続し直します。完全にバルーンを収縮し、それを削除します。
  25. 30 G の注射器を使用して 250 μ L ヘパリン溶液 (50 U/mL) と大動脈をすすいでください。
  26. 10-0 縫合糸を用いた大動脈切開を閉じる。場所は、腹側に 1 つか 2 つのステッチに続いて、各側面にステッチを中断しました。
  27. 遠位クランプを開きます。出血の場合、クランプを閉じて、追加ステッチを配置します。
  28. 慎重に近位のクランプを開きます。
  29. それをサポートし、任意の出血を止める縫合に 2 つ綿棒を配置します。
  30. それを維持するために縫合を吸収性止血剤を配置します。
    注: 大動脈脈が切開部から遠位表示されます。
  31. 腹部に腸を配置します。
  32. あらかじめ 37 ° C に加温されている滅菌生理食塩水 0.9%、腹腔内を洗浄します。
  33. 6-0 実行縫合糸を使用して腹部の筋肉層を閉じます。
  34. 5-0 実行縫合糸で皮膚を閉じます。
  35. 目を覚ますには、マウスを許可する前にカルプロフェンの 4-5 mg/kg を皮下注入します。それは意識を得ていますまで、動物を監視、胸骨の横臥を維持します。完全な復旧までケージの中だけで動物をしてください。
  36. 3 日間の鎮痛薬として飲用水 (50 mg/100 mL) に Metamizole を追加し、毎日動物を監視します。通常甘いようなマウスは metamizole の味し、手術後すぐに飲み始めます。優先、徐放性注射剤は metamizole の代わりに使用できます。
    注: このモデルの観察期間は 28 日です。

3. 病理組織学的

  1. 2.2 に 2.9 の手順で説明するように、マウスを準備することによって、28 日後バルーン損傷大動脈を収穫します。
  2. はさみを使用してバルーン損傷大動脈 (間分岐と腎血管上 0.3 mm) を削除し、その心を切り出してマウスを安楽死させます。
  3. 0.9% と血管の内腔を洗い流す塩化ナトリウム。
  4. 一晩 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で収穫された容器を修正し、5 時間の 2 時間、2 時間、1 時間の 80% エタノール、95% エタノール 70% エタノールで始まるエタノールそして 100% のエタノール濃度の増加で脱水します。その後、孵化させなさいキシレンのサンプル 2 時間 3 回、サンプルはパラフィンを浸透させる前に。
    注: 0.9% の収穫の容器をフラッシング代わりに、塩化ナトリウム 4% とフラッシュすることが PFA。
    注意: PFA とキシレン有毒である、特別な注意して処理する必要があります。
  5. パラフィン サンプルを埋め込み、ミクロトームを用いた 5 μ m 厚のスライスに切る。
  6. 5 分間 3 回キシレンとスライドを deparaffinize します。
  7. エタノールの減少シリーズを使用して組織スライドを水分補給します。100% のエタノール 2 回の 95%、80%、70% のエタノールの 3 分後、5 分で開始します。
  8. 説明18としてマッソンのヒアリン染色でスライドを染色します。
  9. 2 回 10 分ずつの 100% エタノールで汚されたスライドを脱水します。2 回 10 分ずつのキシレンでクリアし、メディアをマウントでマウントします。
  10. 明視野顕微鏡でスライドを表示します。概要図や詳細な観察のための 0.35 の開口と 20 x 倍率とレンズの 5 倍の倍率と 0.12 の開口レンズを使用します。

4. 蛍光顕微鏡

  1. エタノールの減少シリーズを使用して組織スライドを水分補給します。100% のエタノール 2 回の 95%、80%、70% のエタノールの 3 分後、5 分で開始します。
  2. 20 分間蒸し器で抗原検索ソリューション内のスライドを加熱することによって抗原検索を実行します。
  3. 室温までスライドを冷ます。
  4. スライドをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回洗浄した後に、30 分のセクションにブロッキング液の抗原を適用します。
  5. 3 回 PBS で 5 分用のスライドを洗います。
  6. 一次抗体の希釈剤で希釈した一次抗体とのセクションを孵化させなさい。
    注: 右の濃度と潜伏期間は、各抗体で別々 に選択する必要があります。
  7. 3 回自由な抗体を削除する PBS で 5 分用のスライドを洗います。
  8. 二次抗体の希釈剤で希釈済み共役二次抗体とセクションを孵化させなさい。
    注: 右の濃度と潜伏期間は、各抗体で別々 に選択する必要があります。
  9. 5 分用のスライドを 3 回洗浄することにより非連結抗体を削除します。
  10. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 分; を使用して細胞核を counterstain します。最終的な DAPI 濃度が 350 をする必要があります nM。
  11. 蛍光抗体法対応ソリューションを装着でのスライドをマウントします。
    注: は間違って実装ソリューションを使用して蛍光信号が見えなくなります。
  12. 蛍光顕微鏡でスライドを表示します。1.3 の開口で 40 倍の倍率を使用します。

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結果

バルーン侵食は、マウスで MH の開発研究に適したモデルです。動物手術から回復を示し、優れた物理的な条件術後。このモデルは、50 マウス外科的処置のための 3% の死亡率よりも少ないに設立しました。図 1 b-Cは、主な手術手順を表示します。に沿って皮膚切開後、 linea alba、腹部大動脈を識別します。顕微鏡視下クランプ (図 1 b) を配置します。大動脈の真ん中に小さな切開を行う、容器とスライド (図 1) の血流の方向に対して、それが逆行性にバルーンカテーテルを設定します。膨らんだバルーンの動きは、内膜のと同時に、容器の overdistension を削りにつながります。大動脈切開は、単一 stiches に閉鎖されます。大動脈脈は、切開部から遠位に見えるはずです。

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ディスカッション

この記事は、myointimal 過形成の開発を研究するマウスモデルを示し、根本的な病理学的プロセスの探査と新しい薬や治療法のテストをことができます。

このプロトコルでは最も重要なステップは、大動脈の剥離です。特別な注意は、過剰な侵食が動脈瘤の形成とモデルが失敗につながる、このステップの間にお支払いください。その一方で、侵食が十分に実行された場合、少なすぎる myointima を開発します。したがって、侵食ステップの強度は、結果とこの動物モデルの成功にとって重要です。

外科手術に関して、縫い目がはがれて血管の開存性の初期故障につながる可能性がありますを設定することにより容器の 2 つの壁にピアスされていない重要です。マウス18腹部大動脈の血管狭窄、誘導されるマウス モデルは前述しました。ただし、これと他のほとんどのモデル、分析、組織の非常に少量がのみ。この方法の利点は、(~ 1 cm 容器セグメント) を得られる組織の比較的大きなされています。単一の容器の移植を複数の部分に分か...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者はクリスティアーネ ・ Pahrmann の彼女の技術的な援助をありがちましょう。

社殿は、最大 Kade 財団によって支えられました。両手を使った受信助成他 Kröner 財団 (2012_EKES.04) とドイツ研究振興協会 (DE2133/2-1 _。S. s. は、ドイツ研究振興協会 (DFG; から研究助成を受けてください。SCHR992/3-1、SCHR992/4-1)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10-0 エチロン縫合糸エチコン2814G
3 mL シリンジBD メディカル309658
37% HClシグマ-アルドリッチH1758
5-0 プロレン縫合エチコンEH7229H
6-0 プロレン縫合糸エチコン8706H
アシッド フクシンシグマ-アルドリッチF8129-25Gトリクローム染色
抗原賦活化液ダコS1699
アゾフロキシンウォルデック1B-103トリクローム染色
ベパンテン 目鼻軟膏バイエル1578675眼軟膏
ベタジン溶液ベタジン パデュー製薬NDC:67618-152
C57BL/6Jチャールズリバー品番 000664
クランプ アプリケーターFine Science Tools18056-14JAW DIMS: 4 x 0.75 mm 長さ: 13 mm
コラーゲン 3abcamab7778抗体
DAPIサーモフィッシャーD1306
ロバ抗ヤギ IgG AF555InvitrogenA21432二次抗体
ロバ抗ウサギ IgG AF488InvitrogenA21206二次抗体
ロバ抗ウサギ IgG AF488InvitrogenA11055二次抗体抗体
ロバ 抗ウサギ IgG AF555InvitrogenA31572二次抗体
エタノール 70%Th. Geyer2270
エタノール 96%Th. Geyer2295
エタノール絶対Th. Geyer2246
FAPabcamab28246抗体
鉗子 ファインサイエンス ツール11251-20
鉗子標準ファイン サイエンス ツール11023-10
氷酢酸Sigma-Aldrich537020
バリカンWAHL8786-451A ARCO SE
ヘパリンRotexmedicaPZN 386234025.000 I.E./mL
高温焼灼キットBovie18010-00
Image-iT FX Signal EnhancerInvitrogenI36933ブロッキングソリューション
ライトグリーン SFWaldeck1B-211トリクローム染色
マイクロサージカルクランプFine Science Tools18055-04Micro-Serrefine - 4mm
MINI TREK 冠状動脈拡張カテーテル 1.20 mm x 6 mm / Rapid-ExchangeAbbott1012268-06U
モリブダトリン酸水和物メルク1.00532.0100トリクローム染色
NaCl 0,9%B.BraunPZN 06063042 Art. Nr.:3570160
ニードルホルダーファインサイエンスツール12075-14
バミンスルフォンRatiopharmPZN 03530402Metamizole
Orange GWaldeck1B-221クローム染色
パラフィンライカバイオシステム参考文献 39602004
PBS pH 7,4Gibco10010023
PFA 4%電子顕微鏡 Sciences#157135S
Ponceau S solutionServa Electrophoresis33427Trichrome staining
一次抗体希釈剤DakoS3022
Prolong Gold Mounting solutionThermo FischerP36930免疫蛍光染色スライド用マウントソリューション
交換可能なファインチップBovieH101
Resorcin-Fuchsin WeigertWaldeck2E-30トリクローム染色
リマジルファイザー400684.00.00カルプロフェン
ハサミファインサイエンスツール14028-10
ハサミ バンナススタイルファインサイエンスツール15000-03
抗体希釈剤DakoS0809
速効型接着剤MINIS 3x1gUHU45370シアノアクリレート
スライドラックTed Pella21057
SM22abcamab10135抗体
SMAabcamab21027
染色皿Ted Pella21075
手術用顕微鏡ライカM651
タボタンプ フィブリルエチコン431962吸収性止血剤
トランスポア サージカルテープ3M1527-1
U-100 インスリン注射器BD メディカル324825
血管拡張器ファイン サイエンス ツール18603-14
Vitro-CludLangenbrinck04-0001
Weigerts鉄ヘマトキシリンキットメルク1.15973.0002Trichrome染色
キシレンTh.ガイヤー3410
糸 ノトリ二次抗体

参考文献

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