方法論記事

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

DOI：

10.3791/56504

⸱

2017年11月6日

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

この記事について

サマリー

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クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。

要約

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成体マウス骨格筋構造蛋白質の含有量が高い物理的に抵抗性組織からクロマチンの準備のための効率的かつ再現性のあるプロトコルについて述べる。大人のマウスから切り裂かれた四肢の筋肉物理的、機械的均質化またはミンチと細胞ライセートのホルムアルデヒド固定前に低張性バッファー内の douncing の組み合わせによって中断されます。固定の核は機械的均質化または douncing 細胞の残骸を削除する連続ろ過のさらなるサイクルによって精製しました。精製された核は、すぐに、後の段階で凍結後する超音波に処理できます。クロマチンが効率的に超音波処理および転写因子、RNA ポリメラーゼ II、および共有結合のヒストンの修正のプロファイルによって示されているように、クロマチン免疫沈降実験に適した取得します。このプロトコルにより作製したクロマチンを使用して検出されたバインディング イベントは、主に筋線維核クロマチン繊維関連の他の衛星と血管内皮細胞からの存在にもかかわらずで行われているものです。このプロトコルはそのため成体マウスの骨格筋における遺伝子発現制御の研究に適応です。

概要

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クロマチン免疫沈降 (チップ) の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に結合し、転写を研究する選択の方法と様々 な組織における遺伝子発現のエピジェネティック制御高スループット シーケンス (チップ seq) となっています。細胞タイプ1。この技法は、ゲノムは共有結合性クロマチン修飾ヒストン バリアントの占有率、転写因子結合2,3プロファイリングできます。

培養細胞からチップを実行することが確立している哺乳類動物組織からチップのままより困難です。チップのクロマチンを準備、組織切片・細胞の種類ごとに最適化が必要ないくつかの重要な手順が含まれます。クロマチンは、培養細胞の細胞の溶解液や、原子核の次の浄化から用意できます。哺乳類ティッシュの場合効率的な換散、ホルムアルデヒド固定および核の精製は、クロマチンの最適な回復を確保するために重要です。また、その浄化の前後に核を修正するかどうかの選択は実験的に決定します。これらの障害にもかかわらず、肝臓、精巣、または脳4,5,6などの組織からチップに正常に行われています。骨格筋の場合このような物理的に抵抗力がある組織、構造タンパク質の含有量が高いと核の分離を表わすは特に困難です。この特異性を考えると、他の組織のために最適化されたプロトコルを与えない満足のいく結果骨格筋の。

ここで物理的に破壊組織、ホルムアルデヒド固定し核と超音波処理の分離を含むマウス骨格筋組織からチップ グレード クロマチンを分離するプロトコルについて述べる。様々 な転写因子や RNA ポリメラーゼ II、コバレントマテリアルのヒストンの修正7の qPCR チップとチップ seq を実行することによってこの組織からチップに適したクロマチンを準備するこの手法の有効性を示した.

この新しい技術が以前に報告されたプロトコル8時間、転写因子のゲノムのローカライゼーションの変更中に長いコラゲナーゼ消化手順を構成するよりもはるかに高速と遺伝子発現の変化が起こるかもしれない。速さを核隔離され、固定は、ここで説明する方法をより忠実にネイティブのゲノムの占有状態をキャプチャするクロマチンを準備する特に魅力的になります。また、筋肉組織からクロマチンの分離または蛋白質の抽出のための他の方法が記述されている8,9,10され選択した遺伝子、チップ seq チップ qPCR 実験用データは、それらを使用して報告されています。ここで報告メソッドは転写因子やヒストン変更チップ seq に適した、それゆえ必要があります 3/4 C や HiC クロマチン構造キャプチャ ・ アプリケーションに適しても。

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プロトコル

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マウスは、ケアおよび実験動物の使用に関する制度のガイドラインに従い、国立動物診療ガイドライン (欧州委員会指令 86/609/CEE; に従って保たれました。フランス語令 no.87 848)。フランス国民の倫理委員会で承認されたすべてのプロシージャ

。

1 です。 筋肉組織分離

頚部転位によって
  1. 犠牲 1 つアダルト 6 に 8 週齢マウス。Sterlise 70% エタノールで洗浄によって肢細かい点はさみと鉗子を使用して後肢の筋肉 (大腿四頭筋腓腹筋、脛骨前方) を解剖と
    。 注: 1 つのマウスの組織の約 500 mg をもたらすべきである
    2. 。
  2. 1 mL の小型の同種の準備に冷たい低張性バッファーを含む 2 mL 試験管に筋肉をミンチ (< 2-3 mm 3) を使用して個はさみの罰金し、5-10 分のための 4 ° C でベンチ トップ アジテーターに関する振動管を残す

2。組織溶解

注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください

。
  1. 14 mL 丸底チューブにホモジュネートを転送し、5 mL の冷たい低張性バッファー (EDTA 無料プロテアーゼ抑制剤のカクテルそして PMSF) で再懸濁します。
    1. Homogenise 14 mL の丸底チューブに 15-30 秒の緩い dounce (3 分以内 20 30 ストローク) または機械的組織ホモジナイザーを使用してみじん切りにした筋肉組織
      。 注: この段階では光学顕微鏡検査によって評価される換散の効率と追加の中断を行うことが必要な場合です
      2. 。
  2. 15 mL チューブに磨砕液を転送し、冷たい低張性バッファーを使用して 10 の mL にボリュームを埋めます。次のマウスに進む前に以下のように磨砕液を修正します
    3. 。

3。固定

  1. ホルムアルデヒドを最終濃度が 1% に加え、室温で 10 分間振る
    2. 。
  2. 固定と室温で 5-10 分間揺れを停止する各管で 0.125 M の最終的な集中にグリシンを追加します
    3. 。

4。核の準備

注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください

。
  1. Homogenise 固定ライセート使用緩い dounce (5 〜 10 ストローク).
    1. 核および細胞残骸を取得する 15 mL チューブ 1,000 x g で 4 ° C で 5 分間遠心し転送します
      2. 。
  2. 上澄みを除去し、5 mL の新鮮な低張バッファーでペレットを再懸濁します。70 μ m 携帯こし器を通って 50 mL のチューブに液をフィルターします。再濾液を 40 μ m セル ストレーナー フィルターします
    3. 。
  3. は、核のペレットを取得する 4 ° C で 5 分間 15 mL チューブ 1,000 × g で遠心分離し濾液を転送します
    。 注: この段階で核することができますがすぐに超音波処理、またはスナップ乾燥ペレットとして液体窒素で凍結し、-80 に格納されている ° C

5。超音波

  1. 核ペレット (機械と dounce の両方の均質化のため約 50 μ L) の容積を査定するパックされた核容積の 4 回に 3 まで超音波処理バッファーでそれを再懸濁し、超音波、超音波発生装置を使用しての 4 ° C で 10-15 分の。
    注: クロマチン (6) 下記のとおりただちに分析または凍結して格納できます-80 で ° C

6。次の超音波クロマチンのフラグメント サイズを評価する

注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください

。
  1. デ-架橋、クロマチンの 30 μ L を 1.5 mL の試験管に取る 5 M 20 μ L を追加し、塩化ナトリウム。500 μ L にボリュームを完了し、65 ° C で一晩インキュベートします。
    1. 次の日、処理を 1 μ L, プロテイナーゼ K を (20 mg/mL 在庫)、42 ° C 実行フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出で 1 時間 0.5 M の EDTA の 10 μ L 2 M トリス pH 6.8, および 10 μ とナトリウムの acetat の 1 つのボリュームで DNA を沈殿させるe (3 M) と 1 時間-80 ° c または-20 で一晩 100% エタノールの 2 つの容積 ° C
  2. 13,500 x g で 15 分間、上清をデカントでの遠心分離で DNA をペレットし冷たい 70% エタノールや 5 分上清をデカント、再び遠心分離で徹底的にペレットを洗浄し、ペレットを風乾します
    3. 。
  3. は、TE バッファーの元のボリューム (30 μ L) でペレットを再懸濁します。260 nm/280 nm の吸光度によって分光光度計で DNA 濃度を測定します。クロマチンのフラグメントのサイズを評価するために電気泳動を行いピペットの 1.5% の agarose のゲルの別のレーンに DNA のサイズの梯子とともに DNA の 500-1,000 ng
    。 注: フラグメント サイズは 200-500 塩基対の間にする必要があり、対応するまたは悪い-断片化されていない DNA 検出の高分子量フラグメントはないはず。クロマチン ソリューション (手順 5) の長い時間再超音波し、再分析が最適なサイズになるまで上記のようことが必要な場合です
    4. 。

7。クロマチン免疫沈降 (チップ)

注: すべてのバッファー組成の 表 1 を参照してください

。 早かった 1 mL のエタノールで 50% スラリーによる
  1. 蛋白質 G ブロック セファローズ ビーズ。ペレット、ベンチトップで 1 分間 400 × g で遠心分離によるビーズ遠心 400 x g で TE バッファー遠心の 1 mL で洗いし、ワシントンを繰り返す
    1. 酵母 tRNA (在庫 10 mg/mL) の 2 回目の遠心分離、BSA (株式 20 mg/mL) の 25 μ L で希釈バッファーを内蔵の 1 mL に再停止と 20 μ L 後。4 回転 (40-60 rpm) によって、少なくとも 2 h 使用する前にビーズをブロック ° C
    2. クロマチン (手順 5) の希釈 50 μ g 8 〜 10 回チップ希釈バッファーを使用しています。ブロック ビーズ スラリーの 50 μ L を追加し、4 回転 (40-60 rpm) 2 時間インキュベート ° C. 遠心済みクリア クロマチンを取得して新鮮なチューブに移転 4 ° C で 400 x g で
      3. 。
  2. 免疫沈降、一次抗体 (例えば クロマチンの 10 μ g あたり 1-2 μ g) の適切な量を追加し、4 回転で一晩インキュベート ° C
    注: 最適な抗体の量は製造業者によって推薦されるかもしれないまたは最適な濃縮が観察されるまでさまざまな量の抗体を持つチップ qPCR を実行することによって、経験的に決定できます。蛋白質 G セファローズ可能性があります使用される抗体のサブタイプによって蛋白質 A セファローズに置き換えることも
    3. 。
  3. 次の日ブロック ビーズを追加し、4 回転 (40-60 rpm) で 1 時間インキュベート ° C. 遠心ビーズをペレット、上清を除去し、チップを開始する 20-30 s の 400 x g で洗うです
    4. 。
  4. チップの洗浄: バッファーが次の洗浄を実行: 低塩バッファーに一度し LiCl バッファーで 2 回、高の塩バッファーで 2 回、そして TE バッファーで 2 回。
    1. 4 ° c (40-60 rpm) 回転で 10 分間各洗浄を行い、ベンチトップ遠心分離機で 20-30 s の 400 × g で遠心分離によって洗うたび間ビーズをペレットします
      2. 。
  5. 溶出、削除最後の洗浄と揺れながら室温で 15 分間 (新鮮な) 250 μ L 溶出バッファーのビードを再懸濁します
    6. 。
  6. 遠心分離機 x g と収集新鮮なチューブで溶出液 400 で。この 2 回のステップを実行して実行・ デ ・架橋溶出液 20 μ L NaCl 5 M と 1 μ L RNase A で一晩 (10 mg/mL)、扱うプロティナーゼ K のあり、フェノール/クロロホルム クロロホルム バキューム手順 6 のように行動します
    7. 。
  7. TE バッファーの 50 μ L で再懸濁します、チップの品質をチェックする標準プロトコル 15 に従ってチップ qPCR の因数を使用します
    8. 。

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結果

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核を分離するには、18,000 と 22,000 の rpm (材料の表を参照) で、15 または 45 s のため解剖とみじん切りにした筋肉組織の力学的均質化を行った。すべての条件で核組織破片から分けることができるが、収率は低い速度 (図 1 aB) を使用して最適です。核は、3-5 分 (図 1 aと示されていないデータ) の douncing によってまた準備でしたが 15 ほどで核の最適な収穫が得られる、機械的均質化選択の方法である s、特に場合は、時間の重要な利得を許可します。複数のサンプルがなければならない (図 1 b) を処理します。使用してこのプロトコル 2.7 × 10 する組織 (1 マウスの組織に相当) の 500 mg から7核はクロマチンの 100 μ g を生成する分離できます...

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ディスカッション

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ここでアダルト マウス骨格筋このクロマチンは筋線維核内転写因子結合と共有結合のヒストンの修正を検出チップ実験に適しているショーからクロマチンを準備するための新しいプロトコルについて述べる。このプロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。最初の dounce または機械的剪断によって実行することができます組織混乱です。機械的剪断はより速くより再現性の高い、したがって選択法。それにもかかわらず、適切な装置が利用できない場合混乱をまた実行 douncing、固定の手順に進む前に、顕微鏡下での換散の効率の評価を勧めによってできます。単離核の固定ではなく、全体組織ライセートの固定小さいボリュームで、短期間のより再現可能な超音波処理を許可しました。また、前述のトマスらによって選んだ中断前に組織を修正するのではなく、中断の後 lysates を修正するには10組織をあらかじめ固定均質化の減らされた効率で起因しました。機械的剪断に基づくこのプロトコルも提案など他のソリューション、コラゲナーゼの消化力、37 ° C8時解剖組織の長期培養...

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

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我々 は特に IGBMC 動物施設のスタッフのスタッフ IGBMC 高スループット シーケンス機能、「フランス Génomique」コンソーシアム (ANR10-INBS-09-08) のメンバー、IGBMC のすべての一般的なサービスをありがちましょう。この作品は、CNRS、INSERM、AFM、リーグ国立 contre le 癌からの補助金によって支えられた、フランスの国営ラベル ANR-10-アイデックス-0002-02、Labex INRT ANR-10-アイデックス-0001-02 Investissements d'Avenir プログラムの下で ANR を通じて基金とANR-AR2GR-16-CE11-009-01。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。S.J にミニステール デ期リーグ国立 contre le 癌と ANR-AR2GR-16-CE11-009-01、V.U によって支えられらデ ラ凝った。ID は 'デフランス labellisée' リーグのナシオナル contre le がんです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
T 25 デジタル ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
プロテアーゼ阻害剤 カクテル-EDTA フリーロシュ診断11873580001
プロテイン G セファロース ビーズSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
プロテイナーゼ KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
細胞ストレーナー 70umCorning BV431751
細胞ストレーナー 40umCorning BV352340
ホルムアルデヒド EMグレードEuromedex15710-S
RNase Aフィッシャー サイエンティフィ12091039
フェノール:クロロホルム:イソアミル アルコール 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
酵母 tRNAsigma-aldrich chimieR5636
グリコーゲンブルーAMIBIONAM9516
Pol II ChIP 抗体Santa CruzSC-9001
H3K27ac ChIP 抗体Active Motif39133
Tead4 ChIP 抗体Aviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220焦点超音波処理装置Covaris E220
名前会社カタログ番号コメント
その他のアイテム
はさみ
ルーズダウンス
15mlと50mlのファルコンチューブ14ml
丸底チューブ
1.5mlと2mlエッペンドルフチューブ70
μm と 40 μm細胞ストレーナー(コーニング)
ック

参考文献

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  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

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DNA ChIP

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