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方法論記事

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

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DOI：

10.3791/56512

⸱

2017年10月30日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, GA-PCOM

この記事について

サマリー

ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド グラスから抽出されました。

要約

この手順の目的は、ECM 式と管のアーキテクチャを評価するために雌の未経マウスから #4 腹部乳腺を収穫するためだった。ここでは、皮膚の下の小さなポケットは、マヨはさみ、基になる腹膜から皮下組織内腺の分離を許可するを使用して作成されました。腺の可視化は、3.5 の使用によって助けられた x R 外科用マイクロ ルーペ。ペルトは逆になったし、ヘアケアのままの乳腺の脂肪パッドの識別。#4 腹部腺の皮下層と腺の間メスの刃を横方向に摺動によって切開しぶっきらぼう。、収穫後すぐに腺 10% 中性緩衝ホルマリン後続のティッシュの処理のために置かれました。それは主に膵管上皮細胞と部分生検で見逃される可能性が他のアイソレータケージ細胞集団の重要な組織全体の相互作用を除外するリスクを排除するため、全体の腺の切除は有利です。方法論の 1 つの欠点は、腺内の個別の場所に管の形態形成および蛋白質の表現の分析を制限する固定組織から連続切片の使用です。など、3 次元 (3 D) で管のアーキテクチャおよび蛋白質の表現の変更は容易に獲得可能ではないです。全体的にみて、手法は全体そのままマウス乳腺発達性膵管の形態や乳房癌など下流の調査のために必要とする研究に適用されます。

概要

乳がんは、実質的な組織線維症1,2,3,4度が特徴です。ECM と呼ばれる、この非携帯電話エンティティはすべての組織に様々 な程度で発見され維と非フィブリル型コラーゲン、エラスチンのに加えて、様々 なシグナル分子の糖タンパク質の複雑な網目の主に構成されていますこの行列で隔離。恒常性の条件の下で成膜と ECM の劣化が厳しく管理します。5乳腺腫瘍、ECM の沈着と分解のバランスが中断されます。そのため、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン-C 他の中など豊富な ECM 蛋白質を表現する乳腺腫瘍が報告されています。6マトリックス架橋の増加パターンに加えてこれらの蛋白質の異常発現は乳房腫瘍の進行・転移・治療抵抗1,の3、を促進するために記載されている4,7,8,9。

ECM 組成および膵管の形態を評価するためにそのまま乳腺の分離を行った。ここでは、我々 欠乏未メスマウス カベオリン 1, 内在性膜タンパク質は積極的にリンクされている乳房の腫瘍署名10、11,12、女性未 B6 を制御マウス。組織学的処理およびこれらのティッシュの汚損、管形態の特性と共にいくつかの ECM タンパク質の同定を許可しました。

全体的にみて、全体をそのまま乳腺の分離は、研究者に, 外的あるいは内的要因に応答して発生する組織全体の形態や細胞の変化を調査する機会を与えます。技術の欠点は、膵のツリーの複雑な形態のより完全な画像をもたらすと 3 D 視点とは対照的の 2 次元 (2 D) 組織切片の解析に関連付けられます。乳腺で行われる細胞と細胞外マトリクスの相互作用の複雑さを考えると、全体、そのまま腺の分離が効率的にマウス乳腺の様々 な地域で膵管の形態とタンパク質発現の分析に有利です腺。

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プロトコル

すべてのテクニックは厳密の下で実施された、このプロトコルでは動物を対象とする手順が審査し承認機関動物ケアおよび使用委員会フィラデルフィア オステオパシー医科大学の倫理的な指針

。

1 です。 サンプルの調達・加工

  1. 選択適切な動物の対象と CO 2 室に場所。この実験では、8-10 週を使用して古い女性未 B6。Cg-Cav1tmMIs/J ・ C57BI/6 j.
  2. 30-40% にガスの流れをオン。約 2 分後に動物が目に見えて意識なく、追加分の完全な圧力にガス栓をあけて
    注: は、10 分の期間のための CO 2 配信停止後 (例えば 胸の動き) を呼吸の兆候を観察することによって動物の死を確認します。動物がまだ生きている場合は、CO 2 チャンバーに戻されます可能性があります。頚部転位も使えますが血液が乳腺の解剖結果と干渉して集まるよう勧めできません
    3. 。
  3. 次の犠牲、仰臥位で死体をピン留めし、70% エタノールで飽和します
    4. 。
  4. 鉗子を使用して恥骨のすぐ上毛皮をピンチし、小さな手術ハサミ ニックします。移動腹側正中線に沿ってペルト仙骨頭蓋にカットはさみを回転します
    5. 。
  5. 大きいはさみや、止血、にべもなく解剖皮下筋膜両側、腹膜を穴をあけることは注意を使用しています。切開の両方の遠位端の水平方向の余白に沿って裁断します
    6. 。
  6. ピン ペルト フラップを開き、70% エタノールで再度スプレーします
    。 注: 70% のエタノールの使用には、腺と周囲の皮下組織の間よりよい視覚的な効果が認められて、このソリューションの使用の結果として組織の乾燥を避けるために注意します。乾燥を避けるため、4 分を超えない時間内腺を削除します。捜査官として 70% のエタノールの代わりに、組織の乾燥を避けるために、1 × PBS などの一般的な分離バッファーを置き換えることも
    7. 。
  7. 乳腺と関連付けられた皮膚脂肪真皮から自由を切断、ペルト フラップの内側に沿って #4 メスのブレードをスライドさせて、関心の乳腺を検索します
    。 注: 外科用マイクロ ルーペ x 3.5 は腺の簡単に可視化に役立つ可能性があります
    8. 。
  8. はすぐに新たに単離した腺 10% 中性緩衝ホルマリン 24-48 h. のための 10:1 ソリューション組織ボリュームを含む円錐管を水没
    注: 依存研究の意図が、多くの代替の定着剤を使用できますパラホルムアルデヒド、ゲノム研究と市販の RNA のバッファーを保持するためにエタノールなど
    9. 。
  9. は、パラフィン包埋用機関のプロトコルに従う、埋め込み処理、ベンダーにサンプルを提出、スライス/スライド マウント。5 μ m で組織をセクションします
    。 注: 余分な脂肪の周囲腺による区分および染色する前に組織の 100-200 μ m の削除を検討します
    10. 。

2。組織染色

パラフィンを溶かす 1 h の 58 ° C で
  1. ヒート ブロックに染色される 免疫組織化学
    1. 場所のスライドを設定します
      。 注意: は、スライドをオフに実行可能性がありますパラフィン ワックスを溶融します。密接に監視または流出ワックスをキャプチャするスライド下のワイプを配置します
      。 注: この手順は必須ではない、スキップする場合があります。この一歩を追加する可能性があります結果を向上させる結果が期待されていない場合
      2. 。
    2. 加温スライド スライドで jar 含むの 100% キシレン 30 分完全な水没を確保するためです。もう一度繰り返します
      。 注: この時点で、目視検査対象となる脂肪組織のパラフィン切片が頂けますように。追加脂肪やワックスが明らかの場合、キシレンでスライドする必要があります再冠水しました。これは組織の収縮を引き起こす可能性があるキシレンに加えられた露出を最小限にする注意を使用します
      3. 。
    3. 10 分 100% のエタノールを含むスライド jar rehydrate 組織をもう一度繰り返します
      4. 。
    4. 10 分 95% のエタノールを含むスライドに移動スライドをもう一度繰り返します
      5. 。
    5. スライド、スライド瓶含む 75% のエタノールの 5 分に移動
    6. スライド、スライド瓶含む 50% エタノールに 5 分間を移動します。
    7. 10 mM クエン酸ナトリウム溶液 (pH 6.0) ホット プレートや電子レンジを茹でて Coplin jar に注ぐ
      。 注意: 慎重に加熱しながらソリューションを監視、上の沸騰を避けるために世話をします。コンテナーは、とても暑くなるでしょう。やけどをしないように保護を使用します
      8. 。
    8. ゆっくり Coplin に場所スライド瓶、完全な水没の確保とエピトープを取得する 10 分間 100 ° C で孵化させなさい。削除し、慎重にスライドをドライします
      9. 。
    9. は、疎水性のマーカーと組織のまわりで障壁を描画します。十分な内因性酵素の阻害剤を追加 (過酸化水素とアジ化ナトリウム、利用可能な商業的) 組織を被覆し、10 分間インキュベート
    10. サブマージ スライド 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 10 分間
    11. は、組織を被覆し、加湿チャンバーに室温で 1 時間インキュベート 1x PBS で十分な 10% ロバ血清を追加します
      。 注: 実験をここで休止して一晩 4 ° C で加湿チャンバ内のスライドを保存することによってできます。ロバ血清最適な染色結果が得られることがわかった、最適な結果を決定するための馬の血清やヤギ血清ウシ血清アルブミン (BSA) など異なる血清をテストする調査官しれません。捜査官が使用する前にこの新鮮なを準備する必要があります BSA を使用している場合
      12. 。
    12. は、スライドから余分なブロッカーを捨て、組織がソリューションで均等に覆われていることを確保するスライドに直接 1% 血清中正しく希釈した一次抗体を追加します。加湿チャンバーに室温で 30 分間インキュベートします
      。 注: この手順続けられるかもしれません時間期間が長くなると湿気のある商工会議所の 4 に格納されている ° c. をこの段階で適切なネガティブ コントロール スライド (例えば ない一次抗体、抗原陰性組織等 を知られているとスライド) を含めるようにしてください
      13. 。
    13. 慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート
    14. 過剰 PBS を捨て、ティッシュをカバーし、加湿チャンバー内で 30 分間インキュベートする十分な西洋わさびペルオキシダーゼ ラベルを追加します
      。 注: この手順では、捜査官が蛍光蛍光共役二次抗体を用いた染色へ進学を希望する可能性があります。次の手順を適宜変更する必要がありますこれを希望する場合
      15. 。
    15. 慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート
    16. は製造元の推奨比率に従ってクロモーゲン ソリューション プラス ジアミノベンジジン (軽打) を行い渦によるミックスします
      。 注: 多くの既製のキットは別にこのプロトコルで使用される市販
      17. 。
    17. デカント過剰スライドからバッファーし、組織に直接発色染色の 2 〜 3 滴 (10-50 μ L) を追加し、湿気の多い部屋で 5 分間インキュベートします。慎重に組織を流れる約 1 mL 式行先方向 2 O でスライドを洗うです
      。 注意: DAB 発色は非常に有毒です。有害廃棄物を皮膚や収集のフローで汚れの直接接触を回避します
      18. 。
  2. ヘマトキシリンとエオシン (H & E)
    1. 1-2 分の水道水の下で軽く 2 〜 2.5 分リンス スライドのハリス ヘマトキシリンでスライドを水没クロモーゲン インキュベーション後最終すすぎ、次
      注: 組織の上に水の直接噴流を避けるために世話します
      2. 。
    2. 埋没スライド分化溶液 (70% エタノール 100 mL に塩酸の 0.25 mL) 2-3 s 用。約 1-2 分間水道水で優しくスライドをリンス
    3. の 95% のエタノール 30 の 60 s. リンス スライド ブルー エージェント (pH 9.4 を水道水 100 mL で 4.5 mg 炭酸カルシウム) のスライドを水没 s.
    4. アルコール エオシン Y 2-3 分で埋没、スライド
    5. 脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織
      6. 。
    6. Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更
    7. - リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします
      。 注: 異なる染色法が選ばれた場合、メディアを別のマウントが、要求されるかもしれない。例えば、調査官が蛍光標識二次抗体を場合、水性マウントより理想的である
      8. 。
    8. 室温で一晩を設定するスライドを許可します
      9. 。
  3. Picrosirius 赤 (PSR) 染色
    1. 染色、免疫組織化学プロトコル手順 6 (50% エタノール浸漬) に従うスライドを選択します
      2. 。
    2. 1 h. の PSR の埋没、スライドを染色
    3. 染色を区別するために 2 回の 1-2 秒の 0.5% 酢酸のスライドが水没します
      4. 。
    4. 脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織
      5. 。
    5. Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更
    6. スライドをオフに簡単にについての 100% キシレンの沈没によって 3-4 s ・
    7. - リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします
      8. 。

3。サンプル分析

  1. 管解析
    1. 選択スライド染色 α SMA。20 倍の倍率で代表的な画像を収集カメラ マウントの目的を搭載光学顕微鏡を使用しています
      2. 。
    2. 使用 ImageJ (NIH) を区別し、各画像のダクトをカウントします。これらは手動で列挙することができます。 または 1 つは個々 のダクトに数値のスコアを割り当てる可能性があります。数値スコアを割り当てる、ImageJ を開き、プラグインを選択します。次に分析を選択し、ドロップ ダウン メニューからセルのカウンターを選択します。初期化をクリックし、ダクトのラベリングを開始するタイプ 1 をハイライト表示します。完了したら、管のカウントを表示する結果を選択します
      。 : 注意して構造が乳管癌と血管がないことを確認します。
    3. で ' 設定測定 ' オプション、チェック ' 境界 ' と ' エリア " です
      4. 。
    4. 筋上皮区画 (α SMA 汚れ援用可視性) で各ダクトの周りに線を描くフリーハンド多角形ツールを使用して。選択 ' メジャー ' 境界と領域を記録します
      5. 。
    5. 再び内部に内腔の上皮の根尖側に沿ってラインを描くフリーハンド多角形ツールを使用しています。選択 ' メジャー ' 境界と領域を記録します
      6. 。
    6. は、上皮のまわりを得るために筋上皮区画の境界から内腔の区画の境界を減算します。上皮の領域を取得する上皮区画の面積から内腔の区画の面積を減算します
      7. 。
  2. 免疫組織化学分析
    1. ImageJ やフィジー スイートなどの分析ソフトウェアに明視野画像をアップロードします
      。 注: このプロトコルは ImageJ と IHC ツールボックス プラグインを使用して分析の汚損のため手順をについて説明します
      2. 。
    2. は、プラグイン メニューから IHC ツールボックスを開きます。" モデルの選択 " 適切な染色を選択コンボ ボックス (すなわち H-DAB、PSR、等)。選択、" 色 " 汚れを分離します。結果ウィンドウが表示されます
      。 注: 興味の蛋白質細胞外や細胞内スペースにある血しょう膜にバインドされている場合、このメソッドは適切です。興味の蛋白質が核の場合を選択する " 核 " 積極的に汚された核の画像を分析するプラグインが要求されます
      3. 。
    3. 色選択スライドを使用して、背景の追加または過剰な染色除外せず汚れの適切な分離を確保するためです
      。 注: 自動モードは汚れを検出することができるまたは許容範囲の画像は発生しません、正方形を描く関心領域 (ROI) 識別上領域を染色します。IHC ツールボックス ウィンドウで、選択 " 鉄道 " 適切なターゲットにプラグインを直接にします
      4. 。
    4. は、画像を 16 ビットに変換します。画像 → タイプ → 16 ビット
      5. 。
    5. しきい値画像。画像 → 調整 → 自動しきい値
      6. 。
    6. は、長さを割り当てるイメージ スケール バーの上に直接ラインの投資収益率を描画することによって画像の計測スケールを設定します。スケール バーを設定するに移動 分析 → スケールを設定します。(例えば 120 ピクセル/50 μ m) の長さの単位あたりのピクセル数を入力します
      7. 。
    7. は、結果の領域を測定し、平均グレー値。分析 → 設定測定 をクリックして測定を収集し、分析 → 測定
      8. 。

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結果

雌マウス乳腺の 5 ペアがあります。具体的には、子宮頸部腺 (#1)、腹部腺 (#4)、呼吸器の腺 (#2 および #3) 1 組と鼠径腺 (#5) (図 1A) の 1 ペアの 2 つのペアの 1 つのペアがあります。ここでは、彼らは容易に識別可能、#4 腺を分離しました。状況によっては、#4 と #5 腺分離した一緒に両者の区別が困難です.そのまま #4 腹部を分離するには、乳腺、ペルトは固定され (図 1B) の矢印で示される #4 腺の場所を明らかに、基になる腹膜から慎重に分離します。#4 腺慎重に切除され任意の残留皮下または筋肉ティッシュの存在を検査します。私たちの分離腺 (図 1C) 個人を特定できるこれらがなかったら、我々 はフィブロネクチン ステンド腺を組織していた区分する前に削...

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ディスカッション

論文では, ECM 式および膵管の形態の下流組織学的解析のためそのままマウス乳腺を分離する方法を説明しました。膵管の形態の分析に関しては、この手法は、染色標本に基づいて管建築の迅速な調査を可能。 にします。管分析の他の方法は技術的に挑戦的で、時間がかかるかもしれない方法管のツリーの視覚化を有効にする染料の注射に依存します。

乳癌で ECM を異常と報告されています。1,2,6,9具体的には、ECM の豊かさおよび/または架橋結合パターンの変化腫瘍進行・転移・治療抵抗3,4,6,7 に影響...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、それぞれ動物の剖検と腺の分離について 4 月と博士ロジャー ・ Broderson を認めたいと思います。この仕事のための資金は、慢性疾患の高齢化のためフィラデルフィア大学整骨医学センターによって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
光学顕微鏡オリンパスBX43
顕微鏡カメラオリンパスDP73
画像解析ソフトウェアオリンパスcellSensエントリーソフトウェア
NIHImageJ
3.5x-R 外科用マイクロルーペローズマイクロソリューション研究者の好みで倍率
メイヨーはさみメドラインDYND04035
染色ラックフィッシャー・サイエンティフィック121
染色皿フィッシャー・サイエンティフィック112
コプリンジャーフィッシャー・サイエンティフィック19-4
ガラスカバースリップフィッシャー・サイエンティフィック12-550-15組織に適したサイズ
IHC EnVision+ キット (HRP、マウス、DAB+)ダコK400611-2
ピクロシリウス レッド キットアブカムAB150681
エオシン Y、アルコールシグマ アルドリッチHT110132
ハリス ヘマトキシリンシグマ アルドリッチHHS16
ロバ 血清EMD ミリポアS30
10% 中性緩衝ホルマリンシグマ アルドリッチHT501128
キシレン、試薬グレードSigma-Aldrich214736
エタノール、200 プルーフSigma-Aldrich792780分子生物学に適した
リン酸緩衝生理食塩水、1xGibco10010023
クエン酸ナトリウムFisher ScientificS279-500
炭酸カルシウムSigma-Aldrich202932
永久取付媒体コS1964
ユーキッツ 取付媒体シグマ・アルドリッチ3989
フィブロネクチン抗体アブカムAB23750
テネイシンC抗体アブカムAB108930
アルファ平滑筋アクチン抗体アブカムAB124964
ダコ・エンビジョン デュアルリンクシステム HRPダコK4065
ダ

参考文献

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