NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

サマリー

CAEBV 患者から NK と T 細胞クローンを取得するための簡単な方法は、IL-2 の低用量末梢血の少量と高効率開発されました。

要約

リンパ腫またはリンパ増殖性症候群の患者から NK/T 細胞ラインを確立する記述されていた方法の数。これらのメソッドは、フィーダー細胞、血液の限り 10 ml 精製 NK または T 細胞または高用量 IL-2 の採用。本研究では、組換えヒト IL-2 (以上より 2)、添加と周辺機器を培養 T 細胞と NK 行血単核球 (PBMC) の確立する強力かつシンプルな戦略と手法を提案し、2 ml 全血の少しを使用しています。細胞は 2 週間で簡単に増殖できるし、3 ヶ月以上維持します。この方法では、高い成功率での 7 NK または T 細胞ラインが設けられています。このメソッドは、単純な信頼性、および CAEBV または NK/T 細胞リンパ腫のより多くのケースから細胞株を確立することに適用できます。

概要

エプスタインバー ウイルス (EBV) は、ユビキタスと感染 B 細胞だけでなく、T とナチュラル キラー (NK) 細胞、NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患 (LPD) とリンパ腫/白血病、eb ウイルス関連血球貪食などの原因となります。症候群、hydroa 水疱症のようなリンパ腫、胃癌 NK/T 細胞リンパ腫、鼻型、アグレッシブ NK 細胞白血病^1,2,3。これらの中では重度の慢性アクティブ EBV (SCAEBV) 疾患、東アジアを中心にインシデントであるし、EBV 感染 T または NK 細胞^4,5,6,のクローン性増殖によって引き起こされる LPD にいえる⁷、伝染性単核症 (IM) に存在する明らかな免疫不全なし-高 eb ウイルス DNA と同様に、持続的または反復的に, 発熱やみ、リンパ節腫脹、肝機能障害を含む症状でロードのような末梢血^8,9。CAEBV 患者は、予後^10,11, とその病因を持ち、EBV の役割は明確。したがって、細胞由来の NK/T の eb ウイルス関連リンパ増殖性疾患、悪性リンパ腫は、白血病の発生率が高いと NK または T 細胞の増殖との関係を誘発する eb ウイルスの機構解明細胞モデルとして非常に役に立つかリンパ腫。

日には、さまざまなテクニック^{12,13,14,15,16}のいくつかの細胞株が設けられています。人間 NK 細胞ライン、NK-イースは、NK 細胞リンパ腫/白血病からフィーダーと 20U mL¹⁵あたりの濃度以上より 2 の存在下で、マウス間質細胞ラインと共培養によって設立されました。KAI3 は厳しい蚊刺アレルギー患者または自家リンパ芽球様細胞株 (LCL) と SCAEBV から別に樹立 NK 細胞フィーダー細胞と 100U/mL¹⁶以上より 2 の追加として、eb ウイルスによる B 細胞。SNK6 と SNT8 は、以上より 2 (700U/mL)¹²の高用量を追加することによって鼻 NK/T 細胞リンパ腫患者の腫瘍組織から派生しました。同様の手法で SNK 1 セルから CAEBV 患者の PBMC 培養 T 細胞を除去して 700U/mL 以上より 2^13,17を追加します。SNT13 と SNT15 は、cd 4 + および cd 8 + 細胞¹⁸の取り外しによって設立されました。これまでのところ、EBV-NK/T LPD 患者から他の T 細胞と NK の細胞株は、すべてこのメソッド¹⁹開発されました。

上記の既存の方法の欠点は、ためにクリニックでは非常に挑戦的な高用量 IL-2 や NK/T 細胞の浄化、限り 10 mL 全血の使用率の要件フィーダー細胞の雇用を含めるどの種類の細胞その EBV 潜伏を確認の必要性は、文化を始める前に感染します。主にアジアの子供たちに発生する CAEBV と、10 mL の血液はすべての地域で取得する容易ではないです。本研究では、フィーダー細胞せず rhIL2 の低用量と血中の 2 mL の量を使って CAEBV 患者 PBMC を培養 NK および/または T 細胞ラインを確立する高い成功率を持つ新しい単純なメソッドを開発しました。このメソッドの結果は、その高い効率性と時間の節約を証明しています。

プロトコル

本研究は、遺伝学研究所・発生生物学、中国科学院の倫理委員会によって承認され、プロトコル人間福祉機関のガイドラインに従います。

メモ: ワークフローの模式図の図 1を参照してください。

1. CAEBV 患者の PBMC の分離

1. 勾配 (例えば、Ficoll プラーク) による CAEBV 患者の全血の 2 mL からプライマリ PBMC を浄化する遠心分離の製造元の指示に従います。また、雪解けは RPMI 1640 培地と液体窒素から PBMC を凍結しました。
2. 細胞を染色し、細胞カウンター プレートに懸濁液を転送細胞の濃度と自動化された細胞カウンターと生存率を測定 3 分待つ、18 μ L 細胞懸濁液 2 μ L のトリパン ブルー色素 (0.4%) を追加します。
3. 2-3 × 10⁶セル/mL の 20% ひと血清 (56 ° C で不活化熱)、2 mM L-グルタミンを含む完全な RPMI 1640 培養液を添加した密度の細胞懸濁液を準備、抗生物質 (100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 U/mL ペニシリン)。24 ウェルの細胞培養皿によくあたり PBMC を懸濁液の 1 mL の種子。
4. ウェルあたり 150 U 以上より 2 を追加します。
5. 37 ° C で 5% CO₂インキュベーターで培養皿を配置します。
6. 2 日目、(200 倍); 顕微鏡下で細胞の形態を観察します。明るく丸い細胞が行き届いています。

2. 細胞および実行可能なセルを番号の拡大

1. (200 倍)、顕微鏡下で細胞の形態を観察し、媒体を変更する前に、セルの番号付けによって細胞の成長の条件を監視: 18 μ L 細胞懸濁液にトリパン ブルー (0.4%) の 2 μ L を追加し、セルの濃度を計算 (1.2、参照してください図 2)。
2. 24 ウェル プレート中の 500 μ L を破棄し、500 μ L の新鮮な完全な文化媒体を追加します。ウェルあたり 150U 以上より 2 を追加します。
3. ステップ 2.2 のように週に 2 回媒体を変更します。
4. 細胞成長曲線 (図 3) を描画します。
5. 実行可能な細胞の濃度が 5 × 10⁶/mL を超えたら、各ウェルに 1-2 × 10⁶セル/ml の濃度で新しい井戸にセルを分割します。このプロセスは 2-4 週間かかります。

3. 細胞のフローサイトメトリーによる表現型解析

1. セルが展開されている場合は、細胞の表現型を決定する 1 × 10⁶細胞を収集します。遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 240 x g細胞 (NK/T 細胞を管の下部に沈殿させる)。
2. 7 mL の PBS を追加することによって降水量を洗い、上澄みを廃棄します。常温 240 x gで 5 分間遠心します。もう一度繰り返します。
3. 各管に 200 μ L の血清を追加、よく混合し、室温で 10 分間インキュベートします。
4. 室温で 5 分間 240 x g で細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、再 1 × 10⁶/mL と冷たい PBSA (PBS+0.2%BSA) で細胞を中断します。5 チューブ、各チューブ 2 × 10⁵セルを含むセルに分割します。
5. 4 ° C で 5 分間 240 × g で遠心分離細胞上澄みを廃棄し、再 PBSA バッファーまたは PBSA 10 μ L PE (または PE Cy7) を含むセルを中断し、10 μ L FITC 標識抗体は、図 4で示されるように氷の上の T または NK の細胞の細胞の受容体を染色します。PBSA バッファーで中断のセルは、ネガティブ コントロールとして使用されます。
6. 暗闇の中で氷の上の 20-30 分のための抗体を持つ細胞を孵化させなさい。
7. 冷たい PBSA で二回セルを洗浄して、300 μ L で細胞を再停止冷たい PBSA。
8. 流れの cytometer 細胞表現型を分析します。
   1. 「ワークシートを作成する」の状態での流れの Cytometer を設定します。側方散乱 (SSC) 対前方散乱 (FSC) を表示するドット プロットを持つ実験的テンプレートを設定します。
   2. FSC と SSC の電圧を最適化するアイソタイプ コントロール チューブをロードし、興味のセル人口を妨げることがなくゴミを除去するために FSC のしきい値値を最適化します。FSC、SSC、FITC、PE と PE Cy7 以外のすべてのパラメーターを削除します。
   3. 各 2 カラー解析グループにおけるアイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を用いる補正を実行します。
   4. サンプルを読み込むし、HLA-DR 対 CD19、セルの異なる人口を示す CD4 対 CD8、CD56 対 CD16、CD3 対 CD16 のドット プロットを作成します。
      注: PBMC 負/アイソタイプ コントロールと 1 つの肯定的な制御を使用して補正を行うに使用されました。流れの cytometer で 2 色を蛍光抗体法は、表面マーカーの発現を分析する日常的に使用されました。次の抗体が含まれている: 抗 CD19 PE Cy7 と共役、フィコエ リスリン (PE) と共役 CD3 抗 CD16 かに (FITC)、抗 CD8 抗 CD56 共役抗 CD4 抗 HLA-DR。

4. 拡大と NK/T 細胞の凍結保存

1. 細胞表現型解析が完了したときは、メディアを変更します。慎重に上澄みの半分を削除し、プレートの底で細胞を触れないでください。セル板に 300 U/mL 以上より 2 を含む新鮮な培地の同じボリュームを追加します。
2. 培地の半分を変更するセルまで (2.2) として 3 日ごとクラスターは、(図 2) 顕微鏡の下ではっきりと見える。通常、このプロセスは 2-3 週間かかります。
3. 同じ系統の別の井戸を混合後 24 ウェルのプレートからコート t25 フラスコ培養フラスコにセルを転送します。培地量二重媒体のボリュームまで黄色に変わり、10-15 mL に展開します。150 U/mL の濃度以上より 2 を追加します。
4. 成長し、2-3 週間後に固定する前に中の 24 時間を変更するときセル質量を肉眼で観察できます。細胞カウンター細胞濃度を測定します。
5. 240 x g で 5 分間細胞懸濁液を遠心し、再 5 10 10⁶セル/mL 90% 牛胎児血清と 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む冷凍原液で倍の密度で細胞ペレットを中断します。-80 ° C に毎分 1 ° C の割合で凍結し、液体窒素に直接転送。

結果

3 日間は、細胞株の確立の間に文化、多形性細胞 (図 2) が表示されますを開始します。7 日後セルにつれてすぐに数と細胞の生存率が高い (図 3) で増加しています。細胞の小さなクラスターが成長、細胞濃度を超えることは 3-6 × 10⁶時 10-14 日後明確に表示されます。この期間で細胞培養プレートの分割 2 つまたは 3 つの井戸拡張する必要があります。一ヶ月後、一度セル数に達すると 3-5 × 10⁷カウントは保全のために十分に高い。

もう一つの重要な問題は、細胞が正常に培養されているとき表現型を決定します。我々 の結果はセルにつれ 3 ヶ月以上良好な状態で T (L196) と NK (M296) 細胞を (図 4)、上...

ディスカッション

このプロトコルでは NK/T CAEBV 患者の全血から細胞を確立するための新たな手法を開発しました。既存の手法と比較して, この方法の主要な利点はそのシンプルさとその要件への血液の量が少ないの高い成功率と細胞生存率の良い条件を発揮します。さらに、eb ウイルスの定量法として、事前に潜伏感染細胞の種類消費より多くの血液と培養開始前に、の時間を考慮せず PBMC を培養 NK/T 細胞株を確立できます。また、細胞を分析して細胞ライン設立後フローサイトメトリーによる細胞の異なった表現型を浄化することが。その上、メソッドは以上より 2 の低用量を使用し、フィーダー細胞を必要としません。この方法で 8 CAEBV 患者から 7 細胞を開発し、1 ヶ月内でそれらを凍結しました。細胞ラインに開発されていないものは生きている重要な増殖なし 5 ヶ月以上維持することができ、この背後にある理由は、さらに調査を必要があります。

細胞の成長は、以前レポート^20,21; と一致している遺伝...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Hu HLA-DR FITC	BD		560944 FACS用
Hu CD4 FITC	BD FACS	555346	抗体
Hu/NHP CD8 PE	BD FACS	557086	抗体
Hu CD3 PE	BD	555340	FACS用抗体
Hu CD16 FITC 3G8	BD	FACS用555406	抗体
Hu/NHP CD56 PE MY31	BD		FACSに対する556647抗体
hu/CD19 PE-Cy7	BD	560728	FACSに対する抗体
IL-2	ロシュ	11147528001
ヒト血清	MRC	CCC118-125
CO2 インキュベーター	三洋遠心
分離	機 Techcomp	CT6T	遠心分離
顕微鏡	OLYMPUS CKX53	CKX53
自動セルカウンター	Countstar	IC 1000	細胞計数用
24ウェル細胞培養クラスター	コーニングインコーポレイテッド	3524	ポリスチレンプレート
25cm2 細胞培養フラスコ	ネスト	707001	ポリスチレン
FBS	Gibco	10270	細胞培地の成分
RPMI 培地 1640	寿命	22400089	細胞培地用
L-グルタミン	アムレスコ	374	細胞培地の成分
100 x ストレプトマイシン ペニシリン溶液 BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	細胞培地の成分
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	リンパ球のin vitro単離用
DMSO	Sigma	D2650	細胞
の凍結用フローサイトメーター	BD	BD FACSAria II
soft ware	BD	BD FACSDiva soft ware	FACS analysis