内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

Summary

このプロトコルの目的は、decellularize し、めしマウス蝸牛組織工学用の足場として利用する効果的な方法を示すことです。

Abstract

哺乳類のヒアリング不足を再生する能力を促進する機械刺激受容の有毛細胞では、難聴の治療法を限られています。現在の再生医療戦略は、移植幹細胞や内耳難聴を修正する損傷した幹細胞の交換を奨励するためにサポート細胞を周囲の遺伝子操作に焦点を当てています。しかし、細胞外マトリックス (ECM) は誘導と有毛細胞の機能を維持する重要な役割を果たすこと、十分に調査されていません。人工内耳を使用して成体幹細胞を成長する足場として ECM 方法、組成と細胞外の環境のアーキテクチャにエイズ聴覚機能の維持の細胞に独特な洞察力があります。分離し、成体幹細胞灌流を受け入れる足場として使用するマウスからの蝸牛を decellularizing する方法をご紹介します。現在のプロトコルの蝸牛は安楽死させたマウス、脱と脱灰から分離されます。その後、臍帯から隔離された人間の Wharton のゼリー細胞 (hWJCs) は、各蝸牛に慎重に灌。バイオリアクター, として、蝸牛を用い、解析の処理を受ける前に 30 日間培養します。脱の蝸牛は個人の細胞外構造を保持が、細胞の存在や DNA の顕著なフラグメントを明らかにしなかった。蝸牛に灌流セルは蝸牛の内外面のほとんどを侵略し、30 日間の期間にわたって問題なく育った。したがって、どのように人工内耳の ECM の影響細胞発達や行動を研究する現在のメソッドを使用することができます。

Introduction

蝸牛は、側頭骨は、複雑なスパイラル構造です。外側の骨迷路と、同心の内側の膜迷路¹から成り立っています。膜迷路は、流体の 3 つのスペースで構成されています: Scala スカラー座 vestibuli メディア、およびスカラー座索¹。Scala メディア住宅感覚の上皮細胞の種類の多数で構成されているが、感覚有毛細胞 (HC)、神経インパルス²音波の機械的エネルギーを変換、特に重要です。音響外傷^3,4、5薬⁶疾患^7,8、および高齢化⁹への暴露は、すべての HC の死を介して聴覚機能障害で起因できます。哺乳類の毛細胞損失は傷害¹⁰後再生することができます鳥の HCs とは異なり、永続的なです。

様々 な現代的な研究努力を失われた HCs を復元する特定の実験的アプローチは異なるが求めています。感覚上皮における遺伝子発現の操作と体の外分化した幹細胞の注入、支配的なアプローチにおいて、蝸牛オルガノイドの幹細胞の分化を誘導方法がされているが^11,12,13を試みた。それぞれのアプローチは、直接幹細胞や幹細胞の発達の手がかりに依存ただし、2 番目は共有で、潜在的に重要な要素はそれ自体蝸牛の ECM^14,15。

ECM だけでなく細胞と細胞の接着、増殖、生存、および移行の面を含んでいますが、また HCs やらせん神経節報^{15,16 の開発に重要な役割を果たしている組織の物理的なサポートを提供します ,17}。自然発生する ECM は、細胞の表現型決定および/または細胞の接着・増殖・生存の¹⁸のガイドが誘導信号を提供します。その結果、脱蝸牛培養 hWJCs との組み合わせでの使用は、ECM と HC の再生の役割を探検するユニークな機会を提供しています。HWJCs は、間葉系幹細胞の¹⁹のように振る舞うひと臍帯由来容易に利用できる、非論争の携帯タイプです。HWJCs は、麻痺細胞系統^20,21を区別する能力を示しています。したがって、現在のプロトコル詳細分離、decellularization、および内耳組織工学用 hWJCs と C57BL マウスの死骸から蝸牛の血流を示します。

Protocol

カンザス大学医療センター (院長) で承認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のプロトコル (御急ぎでなかったら、#2014-2234) によると、動物の安楽死を含めたすべての処理を行った。

注: HWJCs は、インフォームド コンセントを提供される患者が寄贈したひと臍帯から分離した、標本 (区 IRB #15402) カンザス大学人間科目委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されました。

1. 側頭骨収穫と蝸牛の分離

1. 外科はさみの鋭いペアで頭蓋骨と第一頚椎の間に切断によって適切に安楽死させた、15 週齢マウスの首をはねるし、(図 1 a) を消毒する 70% エタノールで頭をスプレーします。
2. 外科はさみ (図 1 bの-C破線) の同じシャープな対を用いた正中面で頭蓋骨を二等分します。
3. 鉗子 (図 1の矢印) のペアを使用して頭蓋骨から脳組織を削除します。
4. 存在の聴覚と前庭神経根 (図 1E-F矢印) 頭蓋骨と (図の矢印 1f) 外から外耳道の奥の頭骨を識別します。頭蓋骨 (図 1) の残りの部分から側頭骨を分離する頭蓋骨を慎重にカットします。
   注: いくつかのインスタンス可能性があります可能である繊細な加工を必要とせず頭骨から頭蓋骨の周囲の骨を詮索します。
5. ヒントは蝸牛に穴をあけるリスクはないので、外耳道 (図 1 H)、約 5 mm の開口部に微細鉗子を挿入します。優しくこじ開ける胞 (図 1 H、トップの赤斜線領域) の骨骨折 (1I を図、赤い点線線) ので。
   注: 必要に応じて、解剖顕微鏡役立つ可能性がありますこのプロセスの正確な配置や楽器の操作を確保するため。
6. 微細鉗子を使用すると、(図 1 j, 赤いブラケット) 蝸牛の骨迷路の公開側頭骨からブラの残りの部分で詮索離れて。
7. シャーレの頭骨を保持するために十分な大きさの場所 (例えば、30 mm 以上)、解離性の下にあるビューのフィールドを対象範囲し、満タンで十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 側頭骨 (例えば1、0.5 mL) をカバーします。
8. ブラ直面している蝸牛の楕円形や円形の窓が PBS で削除と側頭骨が水没します。
   注: 前庭系を操作して定位 (1I を図と図 2 b) 蝸牛の機能のためのハンドルとしても優れていますと、蝸牛から前庭系の除去する、必要はありません。
9. 鉗子の超微細のペアを使用して、あぶみ骨を通過するアブミ骨動脈を削除します。
10. 動脈渡される、アブミ骨のアーチを超微細鉗子の先端を挿入し、繊細な上向きあぶみ骨を持ち上げます。縫合のアブミ骨は卵円窓から持ち上げる必要があります。
11. 超微細鉗子の先端を使用して、楕円の穴をあけるし、windows のラウンドします。
12. 28.5 ゲージ注射器とチューブを充填 1 × PBS を使用する (内側直径 0.28 mm、外径 0.61 mm) 管の楕円形の窓を置きます、接続されている (図 2 a -B)。
    注: 管の開口部は、正確な配置を確保するため支援超微細鉗子を使用して操作できます。
    1. 各蝸牛に新鮮な注射器とチューブを使用します。
13. 2 mL の 10% 抗生物質抗真菌薬 (対策) と 10% ペニシリン-ストレプトマイシン (ペン-連鎖球菌) PBS で蝸牛の 5 分以上を外リンパを削除するを灌流します。あまりにも多くの圧力で速すぎる灌蝸牛内微細構造に損傷を与えます。
    注: 蝸牛を介して流体を灌流して手で注射器を手動で運転が効果的な灌流ポンプを代替として使用できます。
    1. 灌手動で場合は、側頭骨の前庭部分をつかんで灌蝸牛 (図 2 a) を安定させるために鉗子を自己終了の罰金ペアを使用します。
       注意: 必須ではありませんが、これは両手を自由に楽器を処理を残します1 つの手はチューブを配置できる他、注射器 (図 2 a) を運転できる適切に (図 2 b)。
    2. このステップから転送、空気に不必要に蝸牛を公開しないように注意してください。流体の循環をブロック流体の空間に空気の泡を導入、蝸牛内の微細損傷さらに乾燥します。
14. 削除し、残った微細鉗子を用いた筋肉組織や骨フラグメントを破棄します。
15. 必要に応じて、抗生物質溶液ごと 48 時間の定期的な変更で 7 日まで 10% 対策で PBS で 10% ペン連鎖球菌性ソリューション 4 ° C で分離の蝸牛を格納します。

2. 蝸牛処理

1. Decellularization
   1. 各蝸牛の塗りつぶし 1% ナトリウム ドデシルと 20 mL ガラス シンチレーション バイアルの硫酸塩 (SDS) 水溶液のイオン (DI) の水があり、蝸牛を decellularize するために使用。
   2. 開口部は十分な大きさを通過する蝸牛のかみそりの刃を使用してプラスチック製の 7 mL 転送ピペットの先端をカットします。
   3. 転送ピペットを使用して、ゆっくりと引いて、蝸牛ピペットにのでそれは数ミリでカットオフ端を渡します。
   4. 1 %sds ソリューションいっぱいシンチレーション バイアルに蝸牛を追放します。
   5. 転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛 (DI) 脱イオン水に 1 %sds の 2 mL を循環します。
   6. 、ローテーターにシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。
      1. 72 時間の期間にわたって、1 %sds ソリューションすべての 24 h を変更します。決して空気に蝸牛を公開する SDS を変更するとき注意してください。
   7. 3 回の DI 水で各 30 分の蝸牛を洗います。

SDS 料金; 同じシンチレーション バイアルの洗浄を行うこの段階では、蝸牛が脱です。

脱灰

1. 蝸牛を維持するのに十分なだけを残して水没、シンチレーション バイアルから残りの DI 水を削除します。
2. 脱灰を開始するには、蝸牛を含むシンチレーション バイアルに DI 水で 10% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.02 M) 5 mL を追加します。
3. 転送ピペットを用いたシンチレーション バイアルに蝸牛を純水で 10 %edta の 2 mL を循環します。
4. 回転子に戻るシンチレーション バイアルを置き、部屋の温度で 72 時間 10 rpm で回転するシンチレーション バイアルを許可します。72 時間の期間にわたって 10 %edta 溶液のすべての 24 h を変更します。蝸牛が空気にさらされないようにソリューションを変更するときに注意します。
5. すすぎ 3 回 1 × PBS です。 で、2 h の蝸牛この段階では、蝸牛が脱灰します。

ストレージ

1. 72 h までの蝸牛溶液中で保存、10%、反反 10% ペン連鎖球菌 PBS で 4 ° C で
   注: ストレージ期間を長く可能性があります抗生物質溶液; の定期的な変更が可能ただし、加工の蝸牛の拡張記憶域は、このプロトコルでは検証されていません。

3. 調達と hWJCs の拡大

1. 以前に発行されたプロトコル²²によると hWJCs を分離します。簡単に言えば、3 cm のセクションにへその緒を分割します。
2. 慎重には、メスで浅い切開縦各臍帯のセグメントを広げるし、臍帯ワルトンを公開します。血管を削除するのに鉗子を使用します。
3. 組織が水没する (例えば、40 mL で 60 mm のペトリ皿) 十分な PBS で 2 回臍帯セグメントを洗います。メスで組織のセグメントを細かくみじん切り。100 mm ペトリ皿消化中の 50 mL の組織を消化 (0.2 %2 型コラゲナーゼ、低グルコース環境における 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM))。
4. 5% CO₂、37 ° C のインキュベーターで一晩 50 回転軌道シェーカーの中の消化に組織を配置します。次の日、1:16 pbs は、抗生物質抗真菌 2% の割合で消化中を希釈し、室温で 500 × g で遠心分離によって細胞をペレット (~ 27 ° C) 10 分破棄上清の。
5. 細胞と間葉系幹細胞成長培地 (MSCGM) にペレットを再懸濁します。プレート細胞培養の 7 x 10³セル/cm²の密度では、T-75 フラスコを扱われます。文化の MSCGM、HWJCs、通路 5 実験用に展開します。
   注: HWJCs がサブ培養される大きい T フラスコに (例えば、T-150、T-300) 継 hWJCs 実験のための収穫を増加するとき。

4. 脱蝸牛への hWJCs の注入

1. 脱の蝸牛を準備します。
   1. 無菌技術を使用して、3 回の 30 分の 1 × PBS でストアドの蝸牛を洗浄します。
   2. 24 ウェル プレートの別の井戸に蝸牛を転送し、37 ° C の 1 つの mL を追加 MSCGM で加温します。
   3. 蝸牛 5% CO₂セルの注入の前に 1 時間の最小値の 37 ° C 細胞文化インキュベーターで孵化させなさい。
2. HWJCs を切り離して、再懸濁します
   1. 37 ° C と洗浄 hWJCs 前回 1x PBS を温めた。
   2. 十分な 37 ° C を追加セル容器表面に 0.5 %edta でトリプシンで加温します。
   3. HWJCs 5% CO₂、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで最大 5 分間インキュベートします。
      1. 細胞の 90% が倒立顕微鏡の下のセルを表示することによって表層文化から切り離されることを確認します。
         注: 移動文化容器を軽くタップすると、細胞をデタッチします。静止したとき、細胞が分離されていません。
      2. さらに添付された細胞を取り除くためフラスコの側面が軽きます。
   4. 無菌技術を使用して、トリプシンのボリュームに MSCGM の同等のボリュームを含む 50 mL の円錐管に培養器から転送 hWJCs はセルを分離するに使用されます。
   5. 常温 500 × g で遠心分離によって、hWJCs をペレット (~ 27 ° C) 5 分。
   6. 上清を吸引し、500,000 細胞/ml の濃度で MSCGM で hWJCs を再懸濁します。
3. 蝸牛を灌流します。
   1. 転送ピペットを使用して新しい 24 ウェル プレートに蝸牛を転送します。
   2. 任意の蝸牛が乾燥するを防ぐために各の蝸牛に MSCGM のドロップを追加します。
   3. 繊細な楕円形や円形の窓を向いているように超微細鉗子を使用して蝸牛に合わせます。
      注: は、際は蝸牛が簡単に破損している各蝸牛を直接取り扱いに細心の注意を取る。
   4. 接続チューブ、滅菌 28.5 ゲージ インスリン注射器の使用を再停止される 0.2 mL hWJCs (100,000 細胞) を描画します。
   5. 滅菌微細鉗子を使用して、楕円形の窓にチューブを置きます。
   6. 繊細かつゆっくり 0.2 ml ポリエチレン チューブに接続されている 28.5 ゲージ インスリン注射器を使用して再懸濁の hWJCs の蝸牛を灌流 (外径: 0.61 mm、内径: 0.28 mm) で約 5 分。
   7. 後、0.8 mL 37 ° C の追加も 1 mL に井戸の総容積をもたらすに蝸牛を含む、MSCGM で加温します。
   8. 各蝸牛、新鮮な注射器を使用して、各時間をチューブの 4.3.3-4.3.7 の手順を繰り返します。
   9. 5% CO₂、37 ° C 細胞文化のインキュベーターで灌流の蝸牛を置き、週 3 回のメディアを変更します。

5. 蝸牛収穫と保存

注: 蝸牛培養があります、任意の時点で収穫まで 30 日後灌流。

1. 蝸牛を保持するには、ロッキング プラットフォーム上の 4 ° C で一晩 1x PBS で 4% パラホルムアルデヒドで修正します。
2. 固定後、3 回各 5 分の 1 × PBS と蝸牛を洗います。
3. 徐々 に脱水エタノールと蝸牛とのパラフィン包埋する前に脂肪族炭化水素溶剤でクリアします。
4. セクションは、ミクロトームを使用して 10 μ m の厚さにサンプル、ガラス顕微鏡スライドをマウントします。
   注: サンプルはする準備が整いました組織学的や免疫組織化学的処理の標準プロトコルを使用して。

Results

ここに提示されたメソッドを使用すると、蝸牛の成功した decellularization は、4' を介して DNA の存在有無を調べることで評価された 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色します。Decellularized 蝸牛内 DNA が識別されなかった場合、蝸牛を完全に decellularized と考えられていた。Decellularization または脱灰を受けていない以前の実験からネイティブ蝸牛は、構造と伝統的 C57BL マウス蝸牛に存在する細胞を示すために肯定的な制御として使用されました。任意の hWJCs の注入はありませんでした、脱脱蝸牛は、ネガティブ コントロールとして使用されました。任意組織切片 (図 3) の領域で定量化可能な DAPI 染色細胞核は認められなかった。2 つの蝸牛脱脱灰, し、現在のプロジェクトの hWJCs を注入します。HWJCs と灌流脱脱灰の蝸牛が多数 DAPI 染色蝸牛および蝸牛 (表 1

Discussion

我々 は正常に蝸牛の複雑な三次元組織足場としての使用を可能にする decellularization プロセスを介して蝸牛からネイティブ蝸牛細胞を削除できることを実証しました。サンティら。¹⁵ decellularizing の蝸牛の最初のメソッドを開発し、光シート顕微鏡²³の助けを借りてを通じて多くの人工内耳構造のボリュームを正確に推定しています。このような初期の作品は、組織エンジニア リングと細胞培養の技術がここに提示のための強固な基盤として提供しています。脱蝸牛は正常に、細胞融合とすることができ、培養期間を延長。動物の広い配列からの蝸牛は、細胞の種類の同様に広い配列との組み合わせで理論的に利用できます。これらの組み合わせにより組織工学感覚上皮の開発¹⁴を調べて、薬の新規医薬品薬^{のテスト アプリケーションなど多数の可能な実験設計に活用するここでテクニック24}、²⁵モデルの蝸牛神経...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アレグラX-14R遠心分離機	ベックマンコール	ターB08861
イントラメディックセミリジッドチューブベ	クトンディキンソン	427401
ニューブランズウィックイノーバ2000オービタルシャラー	エッペンドルフ	M1190-0002
外科用ハサミ	ファインサイエンスツール	14060-10
ファインフォーセプス	ファインサイエンスツール	11370-40
超微細鉗子	ファインサイエンスツール	18155-13
50 mL コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	12565271
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィ	FB087579B
U-100 インスリンシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	14-829-1B
シンチレーションバイアル	フィッシャーサイエンティフィ	03-341-73
ローテーター	フィッシャー・サイエンティフィ	88-861-049
トランスファー・ピペット	フィッシャー・サイエンティフィ	22-170-404
カミソリブレード	フィッシャー・サイエンティフィック	12-640
抗生物質・抗真菌薬	フィッシャー・サイエンティフィック	15-240-062
ペニシリン・ストレプトマイシン	フィッシャー・サイエンティフィ	15-140-122
24ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィ	07-200-84
スーパーフロストプラスガラス顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	22-170-404
プロロングゴールド退色防止マウンタント DAPI	フィッシャーサイエンティフィック	P36935
クリアライト3	フィッシャーサイエンティフィック	22-046341
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 インキュベーター	Fisher Scientific	13-998-078
間葉系幹細胞増殖培地	Lonza	PT-3001
Trypsin-EDTA	Lonza	CC-3232
TPP T-75 培養フラスコ	MidSci	TP90076
TPP T-150 培養フラスコ	MidSci	TP90151
TPP T-300 培養フラスコ	MidSci	TP90301
解剖顕微鏡	ニコンインスツルメンツ	SMZ800
ニコンエクリプス TS2R-FL 倒立顕微鏡	ニコンインスツルメン
NuAire クラス II、タイプ A2 バイオセーフティキャビネット	NuAire	NU-425-600
1X PBS	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
1% SDS ソリューション	Sigma-Aldrich	436143-100G
10% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884-100G