このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

9.4K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/56528

⸱

2018年1月28日

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

この記事について

サマリー

このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。

要約

DNA 染色法、生物医学研究のため非常に重要です。色の沈殿物の形成によって肉眼に目に DNA の可視化を可能にする簡単な方法を考案しました。それは、アクリルアミドを浸漬、または agarose DNA ゲル 1 x (2.0 μ M に相当) の溶液に SYBR グリーン私 (SG 私) と紫色を作り出す 0.20 mM ニトロ ブルー テトラゾリウム塩日光に露出されたときの沈殿または具体的に青色のライト。また、提案手法を用いた染色 agarose のゲルにアンピシリン耐性プラスミドを用いた DNA 回復試験を行った。コロニーの大きい数はより伝統的な手法で得られた SG を使用して染色私は紫外光照射。説明メソッドは高速、特定、および、transilluminator なし「肉眼で見える」生体分子の可視化をできるように DNA 検出のための非毒性を安価でフィールドでの使用に適した。これらの理由から、私たちの新しい DNA 染色法の研究と業界の両方に潜在的な利点があります。

概要

生物化学および分子生物学の発展に伴い、DNA を含む研究は DNA を分析する優れたテクニックが必要。DNA 染色する最初の方法は銀染色、非常に敏感であるが、欠けている選択性および回収はできません。その後、DNA を蛍光染色の開発許可サンプル回復の可能性のある DNA の選択的定量です。DNA の定量化に使用される最初の蛍光染料の一つは、変異2エチジウム ブロマイド1、だった。しかし、今は、安全 GelRed、SYBR グリーンなどの機密性の高い蛍光染料類の改善私 (SG 私)3;しかし、すべてこれらの蛍光染料の紫外線 (UV) transilluminator または蛍光を使用する必要があります。

4メチレン ブルーとクリスタル バイオレット5,6,7,8,9, など目に見えて、DNA を染色する方法がありますが、これらのすべてに苦しむに対する感度を下げると選択性。テトラゾリウム塩有機化合物減少に影響を受け、この場合彼らは不溶性を形成し、色塩沈殿10,11。最近では、DNA の正テトラゾリウム リング12のためにバインドするいくつかの二価テトラゾリウム塩を示されています。

最近文書13を汚し、ポリアクリルアミドゲルの DNA の定量化手法を表示する方法を提案、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) と GelRed、臭化エチジウムなど蛍光色素と呼ばれる二価テトラゾリウム塩の還元SYBR グリーン私とサイバー金。青色のライトや日光の存在下で勤務し、品質向上と回収を許可この反応と比較して SG の使用に私 UV transilluminator。本稿の目的は、テトラゾリウムを用いた染色技術の詳細なプロトコルを提供する塩です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. 準備とゲルの実行

  1. Sambrook とラッセルの14が、SDS の代わりに水を用いたナトリウム Dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) レシピを使用して 12% のポリアクリルアミドゲルの非変性ゲルを準備します。
    1. 解決のゲルの 5 mL の準備、TEMED 0.002 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.05 mL の 1.5 M トリス pH 8.8 1.3 mL アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 2 mL 1.7 mL の蒸留水を使用します。
    2. 準備スタッキングのゲルの 2 mL は 1.5 mL の水、アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 0.33 mL、1 M トリス pH 6.8 の 0.25 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.02 mL、TEMED 0.002 mL を使用します。ゲルのサイズは 7.3 cm × 8.2 cm 0.075 × cm (w x d x l)。
      注:感度を最高厚さ 0.75 mm の 15 も櫛を使用します。
  2. 読み込みバッファーと DNA サンプルを 1.5 mL 遠心チューブ (例えば5 μ L の DNA のサンプルを 6 x の読み込みバッファーの使用 1 μ) x 6 の適切な量を追加します。
  3. 垂直電気泳動室にゲルを配置します。
    1. 2 ゲルを実行する 1 x TAE バッファーの 750 mL で部屋を満たします。50 の 1 L を準備する x TAE、トリス基地の 442 g、氷酢酸、57.1 mL と 0.5 M EDTA pH 8 の 100 mL を使用します。1 L の最終巻に蒸留水を追加します。
    2. ゲルのサンプルをロードします。2 h の 100 V でゲルを実行します。
  4. また、Sambrook14のレシピを使用して 1 x TAE agarose のゲルを準備します。
    1. 1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 V で 45 分のためのゲルを実行します。

2. NBT SG (図 1) を汚す私。

  1. アクリルアミドゲル染色します。
    1. ソリューションの準備: 0.1 w/v NBT と 1.2 SG x 私。
      注:エチジウム ブロマイド、GelRed、SG ではなくサイバー ゴールドを使用することが可能だけど、SG の最高のパフォーマンスをしていた。
    2. 1.2 16.75 mL を注ぐ x SYBR 緑のソリューションに適切なサイズの容器。
      注:我々 は、コンテナーとしてピペット チップ ボックスの蓋を使用し、これらのボリュームは、このコンテナーを使用してゲルをカバーする計算されます。その寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。
    3. ソリューションをジェルします。3.25 mL 0.1 %w/v NBT 液 0.2 mM NBT を与えるための追加と 1 x (2.0 μ M に相当) SG 私最終濃度。
    4. プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。
      注:プラスチック フィルムは、飛散防止のため、染色液にアルミ箔の反応を避けるために使用されます。
    5. 25 分 60 rpm で軌道シェーカーを振る。
    6. アルミとプラスチック製のカバーを取り外します。最大 90 分のための日光にさらします。興味のバンドが表示されるまでは、5 分ごとに確認してください。
    7. 青色光を使用するには、3 光発光ダイオード (LED) と併せて使用を準備し、ゲルの表面 (LED 光源の強度に依存します必要な時間として、継続的に染色チェック) から約 5 mm の Led を配置します。
  2. Agarose のゲル染色します。
    1. 準備と 1% の agarose を実行するゲルの 1.4 節で説明した後 (サイズが 1 cm × 6.2 cm × 7 cm; l x 幅 x 奥行)、2.1 は、これらの変更と同じ手順に従ってください。
    2. 1.2 41.9 mL を注ぐ SG x 私ピペット チップ ボックスのふたにソリューションその寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。8.1 mL 0.1 %nbt ソリューションを追加します。
    3. プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。
    4. 1 h 60 rpm で軌道シェーカーを振る。

3. データ分析。

  1. NBT SG 私検。
    1. 1200 dpi でスキャンすることによって、ゲルの画像を取得します。
    2. 画像解析ソフトウェアをオープン。イメージ エディターを使用してイメージをまっすぐにします。画像密度測定を実行します。
    3. 曲線の下の領域を計算します。DNA 濃度対最大のグラフを準備します。

4. DNA の回復。

  1. 1 に 1% の agarose のゲルの準備のレシピを使用して x TAE が見つかりました Sambrook14。
  2. 1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 ng/μ L pDJ10015プラスミッドおよび DNA ラダー図 2に与えられる方式を次の 4 μ L をロードします。100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。
  3. マークし、2 つの 2 mL 遠心チューブの重量を量る。
  4. 真ん中 2 つの同じ部分を持つためにゲルをカットします。それぞれには、はしごと異なる染色法を比較するサンプル プラスミドを含める必要があります。概略図は、図 2にあります。
  5. ステイン 1 つ NBT SG と半分ステップ 2 のように。
    1. きれいなメスを使用してプラスミッド バンドをカットします。1 つの管でゲルの部分を保存し、重量を量る。
  6. SG とゲルの他の部分を染色私 1 の 50 mL の SG x 私ソリューションと暗闇の中で (60 rpm) 1 h のためのゲルをゆっくりと振る。
    1. ジェルを transilluminator ときれいなメスを使用してプラスミッド バンドを 2 分カットを公開します。
    2. 他のチューブにゲルの部分を保存し、重量を量る。
      注:プロトコルは-20 ° C でチューブを維持しながらここで一時停止できます。
  7. 商業ゲル抽出キットを使用してプラスミッドの抽出を行います。

5. プラスミド正規化されます。

  1. 1.5 mL 遠心チューブに抽出されたプラスミドの 10 μ L と 60 μ L の水の種類を追加します。ミックス 60 μ 石英キュベットに譲渡または直接、Nanodrop で 2 μ L を使用します。
  2. 230 に 320 の吸収スペクトルを測定 nm。次の数式を使用してサンプルのプラスミド濃度を計算します。
    figure-protocol-1
    Dは適用される希釈率 (この場合は 70/10) x nm の吸収であり、50 は、dsDNA の μ g/mL への換算係数Ax 。
  3. 9.1 ng/μ L のサンプルを希釈します。
  4. エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 有能なセル (例えばXL10 ゴールド) を変換次の希釈サンプルの 5 μ L を使用して井上変換手順16 。
  5. ペトリ皿のコロニーの数をカウントして、希釈します。次の数式17:とコロニー形成単位 (CFU) を計算します。
    figure-protocol-2
    Dは初期の文化から適用される希釈係数です。
  6. 対になっていない t 検定を実行します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

紫塩沈殿物 (質量13によって確認される) DNA があるが表示されます。実験では, DNA の梯子は較正曲線 (図 3) に読み込まれました。アクリルアミドと agarose のゲルのプロトコルが動作しますが、低強度があり agarose の長い時間がかかります。しかし、agarose のゲルの使用により、市販のキットを使用してサンプルの回復、それは抽出と干渉しません。青色 Led でこのメソッドを使用して回復したサンプルに SG に比べると質の向上がある私は transilluminator (図 4) を使用しています。

figure-results-1<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

感受性と小説 DNA 染色法は NBT が減少し、私はこの記事で紹介した SG の使用に基づいています。このプロトコルの重要なステップは、NBT SG でゲルのインキュベーション時間私ソリューションおよび NBT の濃度。Agarose のゲルのより大きい厚さのために agarose のゲルの染色時間はアクリルアミドゲルよりも長くなります。このメソッド、NBT が接触して析出物も SDS 存在下で働きません。ゲルは、紫色の背景を取得した場合別のゲルを準備することをお勧めし、露光時間を短縮します。Agarose のゲルを染色、十分な感度がない場合は、露光時間を長くことをお勧めします。感受性の欠如があり、乳白色の沈殿はゲル中に存在する場合、これは SDS 汚染の結果かもしれない。その場合は、新しいゲルを準備し、染色試薬を追加する前にそれをすすいでください。

青色 LED や太陽の下で当然のことながら青い光現在の光によって提供されるかどうか、青い光による沈殿物が発生します。このため、手法の限界は、光源です。ある光源、青の光源を使用する必要はありません、光源が均一ではない場合は、比較を行う...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、フォンド ナシオナル デ開発 Científico y Tecnológico (Fondecyt)、チリ、(CW) にプロジェクト 11130263、プロジェクト チリ + NERC エイトによって支えられた (CW) に Colaboración インターナショナル PCI PII20150073 と U-inicia Vicerrectoría デから危惧デチリ (CW) します。

芸術 Químicas y 博士ホルヘ バーブルと参考については、原稿やリオイバニェス デ extensión デ ラ Facultad デ改正ロバート ・ レッシュ サンディエゴ キロガ ロジャー、このプロジェクトの初期の段階で助けタチアナ ナランホ パルマ行きのおかげでください。チリ大学から Farmacéuticas。ビデオを編集するためのマルセロ ・ ペレスとニール · スティーブンスのナレーションを提供するテキストとエロール ・ ワトソンを修正するためにあまりにも感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
に使用されるニトロブルーテトラゾリウムゴールドバイオテクノロジー298-83-9
SYBRグリーンI 10000XThermo-FisherS7563試薬 染色
ゲル抽出キット試薬 QIAGEN28704インテグリティアッセイのゲルからプラスミドを抽出するために使用される
DNAラダーThermo-FisherSM 1331検量線の作成に使用され、インテグリティアッセイのカットバンドの参照として使用されます
寒天培クLB-アンピシリン培養プレートの作成に使用されました 
メルク塩化ナトリウム1064045000LB-アンピシリン培養プレートの製造に使用されています 
酵母抽出物ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー212750、LB-アンピシリン培養プレートを作るために使用されました 
LB-アンピシリン培養プレートの製造に使用されるメルク72161000ペプトン
ポリアクリルアミドゲルの製造に使用されるTEMEDAMRESCO761
過硫酸アンモニウムCalbiochem2310ポリアクリルアミドゲルの製造に使用される
アクリルアミドinvitrogen15512-023ポリアクリルアミドゲルの製造
ビスアクリルアミドシグマ146072アクリルアミドゲルの製造に使用される
トリスベースメルク1083821000TAE緩衝液および非変性ポリアクリルアミドゲルtris-HCl緩衝液の製造に使用
EDTAJ.T.ベイカー8993-01TAE緩
酢酸メルク1,000,632,500TAE緩衝液
アガロースメルク16802TAE緩衝
液分光光度計DNAプラスミド
の定量に使用 Tecan infinite 200 pro水浄化ユニットメルクエリックス100、分光光度法で使用される水タイプ1(ASTM)を作るために使用し
、培地、染色、および一般的な溶液
HClJ.T.ベイカー9535-03、非変性ポリアクリルアミドゲルトリスHCl緩衝
液6X DNAローディング染料モフィッシャーR0610
完全性アッセイ5 mm青色LEDJinyuanエレクトロニクスSP-021
 
9 VバッテリーDuracell-LEDに電力を供給するために使用
Biorad1704486EDUインテグリティアッセイでアガロースゲルを製造および実行するために使用されます
垂直電気泳動キットBiorad1658002EDUポリアクリルアミドゲルを検量線で実行するために使用されます
電源Biorad1645050 電気泳動の動力源として使用
染色試薬 で使用される地メルは社のはの に使用される ポリ衝液の製造に使用 の製造に使用 の製造に使用 は、ゲルはサーを作るために使用されます。プロトボードKANDH KH102光源のサポートと回路で使用される光源の水平電気泳動チャンバー

参考文献

  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

SYBR Green IニトロブルーテトラゾリウムアガロースゲルポリアクリルアミドゲルDNA回収プラスミド抽出コロニーカウント
DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。