飽和脂肪酸は、セラミド関連マクロファージの細胞死を誘導します。

サマリー

骨髄細胞からマウスのプライマリ マクロファージを派生させるストレートなメソッドを示すし、BSA 脂肪酸を準備する簡単な方法が抱合体します。示す飽和脂肪酸がマクロファージの細胞死を引き起こすことができる、このような細胞死はセラミド レベルの細胞集積に積極的に関連付けられました。

要約

マクロファージは高い表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪の脂肪酸結合蛋白質を表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能の調節に重要な役割を担う。様々 な脂肪酸が飽和している数多くの研究が示しているなったり不飽和、細胞の成長と機能に関する別の影響を持っています。しかし、脂肪酸の準備に使用する方法が異なります、非生理学的な結果につながる可能性があります。脂肪酸石鹸の毒性を最小限に抑える哺乳類細胞における脂肪酸関数を勉強する共役脂肪酸のナトリウム塩との複合体を形成するため、血清アルブミン、哺乳類の末梢血液中の脂肪酸のための自然なキャリアをお勧めします。したがって、単純な比較的短時間加熱・ sonicating メソッドの開発・ BSA 脂肪酸の酸の共役形成はここで説明しました。飽和脂肪酸、特にステアリン酸マウス骨髄由来マクロファージにおける深刻な細胞死を誘導するためを使用してプロトコルについて述べる。さらに飽和脂肪酸が誘導する細胞死が積極的に蓄積された細胞のセラミド レベルに関連付けられていることを示します。このメソッドは、他の哺乳類細胞の脂肪酸の影響の研究を拡張できます。

概要

脂肪酸は、異なる種類の細胞膜リン脂質の合成、エネルギー代謝に重要な役割を果たします。脂肪酸には、低水溶解度があります。脂肪酸の適切な準備は、哺乳類細胞における脂肪酸の生物学的機能を研究するため非常に重要です。脂肪酸はエタノールを使用して、多くの脂肪酸が比較的低濃度¹でも細胞膜への有毒な石鹸 (洗剤) 影響が表示されます。血清中遊離脂肪酸の自然、主要なトランスポーター、血清アルブミンは脂肪酸配信体外用脂肪酸機能試金^2,3,4良いキャリアが考慮されます。しかし、脂肪酸組成と血清アルブミンの共役の準備の詳細通常ご利用いただけませんにもかかわらず、脂肪酸を使用して多くの研究論文が公開されています。

マクロファージには、表皮の脂肪酸結合蛋白質と脂肪脂肪酸結合タンパク質^5,6,7,8高い表現します。彼ら積極的に吸収飽和と不飽和脂肪酸、免疫機能を調節する可能性があります。マクロファージや他の細胞に脂肪酸の影響を研究するには、脂肪酸の準備のさまざまな方法は応用^1,7,9.生物学的意味のあるデータを得ることは非常に重要です適切に準備された脂肪酸/血清アルブミン複合体を使用して、マクロファージに脂肪酸の影響を調査します。マクロファージに脂肪酸の影響に関する研究は、基本的な知識とマクロファージが関与する疾患における脂肪酸代謝に関する潜在的な治療上のターゲットを提供できます。

プロトコル

プロトコル制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ルイビル大学の承認されました

。

1 です。 マウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs)

1. 安楽死 CO ₂ を使用して 6-8 週齢、健康の野生型マウス。発泡ボードにピンし、それがずぶぬれになるまで、70% エタノールをスプレーします。鉗子、はさみで脛骨・大腿骨骨を削除します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 5 ml 1 シャーレに入れてください。生殖不能の条件の下ですべての手順を実行します
。
2. カット滅菌のティッシュ文化フードのハサミで脛骨・大腿骨骨の両端オープン。15 mL チューブに PBS + 2% ウシ胎児血清 (FBS) 25 G 針と骨をフラッシュします
。
3. 500 x g、5 分のための 4 ° C で骨髄細胞を遠心分離
4. は、1 分未満 9 mL の 1x PBS ですぐに Dilute 赤血球 (RBC) を溶解して 1 mL 赤血球細胞換散バッファーの細胞ペレットを再懸濁します。手順 1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします
。
5. 10 mL の 1x PBS で細胞ペレットを再懸濁します、細胞破片/塊を削除する別の 15 mL チューブに滅菌 40 μ m ナイロン メッシュを通して細胞懸濁液をフィルタ リングします。1.3 のように再度遠心します。培養上清をデカントします
。
6. 15 mL ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 1640 5 %fbs と 10 μ g/mL ゲンタマイシン、浮動取り出す 60 分ゆっくり旋回、皿の 37 ^o C インキュベーターで 100 mm 培養皿の細胞板細胞ペレットを再懸濁します。細胞し、それらをカウントします
。
7. 10 ng/mL 遺伝子組換えマウスのマクロファージ 12 mL マクロファージ メディア (5 %fbs と 30 %l929 エアコン メディア ¹⁰ 混合 10 G/ml ゲンタマイシン RPMI 1640) を区別すると 100 mm ディッシュの 6 x 10 ⁶ セルを板します。2 日間のコロニー刺激因子 (M-CSF).
8. 5% CO ₂ と 37 ° C の定温器で 2 日間培養後 6 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化と各料理をフィードします
。
9. 5 日セルを妨げないでを古いメディアの 8 mL を取るし、10 mL の新鮮なマクロファージ 10 ng/mL M CSF でメディアの差別化を追加します
。
10. 7 日セル リフターを使用して骨髄由来マクロファージ (BMDMs) を収穫します
    。 注: 接続されているマクロファージにも分離 5 mL 1 mM EDTA 5 〜 10 分の 1 × PBS のフロートのセルを削除し、5 mL の 1x PBS で 2 回プレートを洗浄した後。手順 1.3 のように細胞を遠心分離機します。 新鮮なマクロファージ、メディアの差別化でそれらを再懸濁します、診断に数を数えます。
    1. 確認、BMDMs ' としてフローサイトメトリーによる表現型に ⁵ が記述されています。次の研究の特定の濃度でマクロファージ由来のマウスを準備します
    。

2。BSA 脂肪酸酸共役準備

1. 準備 2 mM BSA 滅菌 PBS。たとえば、50 mL まで多くの PBS を追加、6.65 g BSA に溶かすために、30 mL の 1x PBS を追加重量を量る 1x PBS で 2 mM BSA をするコンポーネントをスケーリングします
。
2. 2 mM BSA の脂肪酸の準備 5 mM 個々 のナトリウム塩。必要に応じて、37 ° c 以上の熱し、透明な溶液が得られるまで 2 mM BSA の混合物および脂肪酸のナトリウム塩を超音波照射します
   。 注: に比べて不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸必要があります高温、超音波処理に多くの時間を溶解するため
。
3. フィルター脂肪酸酸 BSA ソリューションを通じて、0.22 μ m フィルター、因数に 1.5 mL 滅菌遠心チューブ、短期使用のための 4 ° c または長期保管のための-20 ° C で保管します。冷蔵庫で 4 ° c の貯蔵の後の沈殿物必要がありますられなかった
。

3。飽和脂肪酸誘導細胞死マウス骨髄由来マクロファージの

1. メディアの差別化マクロファージ 10 ⁶/mL × 0.4 で 24 ウェル培養プレートに BMDMs をプレートします
。
2. は、0.4 mM パルミチン酸とステアリン酸 5% CO ₂ と 37 ° C の定温器で 16 ~ 24 時間のセルを扱います。負の制御として BSA を使用します
。
3. 治療後セル リフターと細胞を収穫し 500 x g、4 ° C、5 分で細胞をスピン
4. アネキシン V アレクサ 488 と 100 で 7 aminoactinomycin D (7 AAD) で細胞を染色アネキシン V 結合バッファー室温で 15 分間 μ L.
5. 200 μ L のアネキシン結合バッファーでサンプルを希釈、優しく、ミックスし、潜伏期間後に氷のサンプルを維持します
。
6. は流れ cytometry ⁵ によってできるだけ早く陽性細胞を分析します。アネキシン V アレクサ 488 が FITC チャンネルで検出され、PerCP/PerCP Cy5.5 チャネルで 7 AAD が検出された
。

4。セラミドの細胞内染色

1. 脂肪酸処理後ステップ 3.3 のように細胞を収穫します。30 分 4% パラホルムアルデヒドでセルを修正し、
2. 1 mL の 1x PBS でサンプルを洗って、スピン ・ ダウンとしては 3.3 では、ステップし、上清をデカントします
。
3. 30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで対策セラミド一次抗体 (希釈 1: 200) と細胞を染色
4. 洗浄とスピン ダウン ステップ 4.2 のようにもう一度セル
。
5. 30 分の 100 μ L 1 x 透過バッファーで抗マウス igm 抗体二次抗体 (1: 500 希釈) と細胞を染色
6. 洗って、スピン ステップ 4.2 のように再びセルをダウンします。250 μ L 1 × PBS を追加し、流れの cytometry の ⁵ によって染色の細胞を分析します
   。 メモ: は、機器や試薬のテーブルの詳細な試薬リストを参照してください
。

結果

肥満では、血清中遊離脂肪酸濃度を増加させます。プロの食としては、マクロファージは、ホストの恒常性を維持するために積極的にで脂肪酸を取る。これらのプロセスの間にオーバー ロードされた脂質は、マクロファージの細胞死を引き起こす可能性があります。このためには、我々 BMDMs 培養体外肥満レベルの脂肪酸と流れフローサイトメトリーによる染色を使用して測定されたマクロファージ細胞死。BSA の制御、飽和脂肪酸と比較して特にステアリン酸、死んだ細胞はアネキシン V と 7 AAD (図 1 ab) に染まる二重肯定的な集団として示されていた BMDMs の重要な細胞死誘導。注記のうち、不飽和脂肪酸は重要なマクロファージ細胞死⁵を誘発しなかった。生体内で飽和脂肪酸の増加レベルの毒性の影響が示唆されました。

ディスカッション

脂肪酸ソリューションの適切な準備は、脂肪酸の生物学的機能を研究する非常に重要です。脂肪酸の中和は、水溶液中での溶解性を増加します。ただし、特に飽和脂肪酸、脂肪酸のナトリウム塩は、水または PBS に難溶のまだ見ました。1 つの方法は、脂肪酸¹を溶解するために 95-100% エタノールを使用することです。このメソッドを使用して、高い細胞毒性毒性が低く不飽和脂肪酸の低濃度でもなることがあります。脂肪酸ソリューションを準備する別の方法は、配信システムとして、脂肪酸がある最適な条件は、そのフォーム単量体^9,11溶液メチル-β-シクロデキストリンを活用することです。このような法により作製した脂肪酸登場、正常な機能を持っているが、複雑な方法の実施です。細胞増殖に対するメチル-β-シクロデキストリンの影響は、高濃度が細胞死¹²につながる可能性です。飽和のステアリン酸とパルミチン酸可溶化⁹を支...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CPX超音波浴	ブランソニック	モデル2800
パルミチン酸ナトリウム(PA)	Nu-Chek Prep、Inc.	S-1109	M.W. 278
ステアリン酸ナトリウム (SA)	Nu-Chek Prep, Inc.	S-1111	M.W. 306
ウシ血清アルブミン(BSA)、脂肪酸フリー	Fisher Scientific	9048-46-8
マウスマクロファージコロニー刺激因子(mM-CSF)	Cell Signaling Technology株式会社	5228
RPMI 1640	VWR International	71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate	Fisher Scientific	A13201
7-AAD	BD Biosciences	559925
モノクローナル抗セラミド抗体 (マウス IgM)	Sigma	C8104-50TST	クローン: MID 15B4
ヤギ抗マウス IgM 抗体, & マイクロチェーン, FITCコンジュゲート	Sigma	AP128F
Fixation buffer	Biolegend	420801
Permeabilization buffer	Ebioscience	4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer	Sigma	11814389001
Annexin V Binding Buffer	BD Biosciences	556454
L929 cells	ATCC	CCL-1
Corning セルリフター	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-364
注:M.W.は分子量です。