視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

サマリー

このプロトコルでは、視床皮質軸索分岐およびシナプス形成の脊髄共培養系における視床と大脳皮質の同時イメージング法について説明します。個々 の視床皮質軸索とその神経終末は、下流と GFP タグ シナプトフィジン単細胞エレクトロポレーション法による可視化します。

要約

軸索分岐とシナプスの形成は、精密な神経回路を確立するための重要なプロセスです。開発中には、感覚視床皮質 (TC) 軸索は大脳皮質の特定のレイヤーで枝とシナプスを形成します。にもかかわらず、軸索分岐とシナプス形成間明白な相関、因果関係はよくわかっていません。この問題に対処するため、我々 は最近脊髄共培養系における軸索 TC 個々 の分岐とシナプス形成の同時イメージング法を開発しました。

このプロトコルでは、切片培養とエレクトロポレーションの組み合わせから成っている方法について説明します。層構成などの特徴的な構造を維持する軸索のプロセスの遺伝子操作と観測の視床と大脳皮質脊髄共培養系を促進します。エンコードした DsRed と EGFP タグ シナプトフィジン (SYP EGFP) 2 つの明瞭なプラスミドはエレクトロポレーション法による視床のニューロンの数が少ないに cotransfected だったこのメソッドでは、個々 の軸索組織の TC ニューロンとシナプス前サイトを同時に可視化することができました。メソッドには、軸索分岐およびシナプス形成の因果関係を明らかにした長期的な観測も有効になります。

概要

哺乳類の脳 (TC) 視床皮質投射は、軸索ガイダンスとターゲットのメカニズムを検討する適切なシステムです。開発時に TC の感覚軸索は皮質骨板やフォーム枝や大脳皮質^1,2の一次感覚野のシナプスで優先的に層 IV で育ちます。基本的な接続の確立後も環境の変化^3,4によって軸索のアーバーおよびシナプス終末が改造されています。ただし、TC 軸索形態を動的に変更する方法がよくわかっていません。主な理由の 1 つは、単一細胞レベルでの構造変化を観察する適切な方法がないです。2 光子顕微鏡などの顕微鏡の最近の進歩は、生活皮質ニューロンの生体内での直接観測を許可している、全体的な TC の軌跡^5,をキャプチャするためまだ技術的な限界があります。⁶。 したがって、体外TC 軸索のライブ イメージング法は、軸索分岐およびシナプス形成の構造解析のための強力なツールを提供します。

初めて私たちのグループは、透過膜⁷静的スライス培養法を設立しました。このメソッドを使用すると、ラット脳スライスされた感覚視床ブロックと遊走し、ラミナ特異 TC 接続されたこの脊髄共培養系^7,8で締めくくっています。蛍光タンパク質を持つスパース ラベリングさらに TC の軸索の成長や枝の形成^9,10,11を観察するができました。最近では、我々 は分岐の同時可視化手法を開発しているし、切片における個々 の TC の軸索のシナプス形成 cocultures¹²。TC 軸索およびシナプス前のサイトを同時に視覚化するには、下流と EGFP タグ シナプトフィジン (SYP EGFP) は切片培養電気穿孔法による視床のニューロンの数が少ないに cotransfected でした。現在のメソッドは TC 軸索の形態素解析を容易に、軸索分岐およびシナプス形成の因果関係を示すため使用できます長期観察できます。

プロトコル

すべての実験は、大阪大学・日本神経科学学会動物愛護委員会によって確立されたガイドラインに従って行われました。

1. 脊髄共培養系視床と大脳皮質の

メモ: 手順については、オリジナルの出版物^7,8,13を参照してください。すべてのプロシージャは、無菌条件の下で行わなければなりません。Sprague-dawley (SD) ラットは、神経細胞の培養に使用されます。

1. 試薬の調製
   注:次の試薬のボリュームは、1 匹のラット脳です。
   1. 変更された N2 サプリメント x 10 の準備¹³: インスリン (50 μ g/mL)、プロゲステロン (200 nM)、ヒドロコルチゾン (200 nM)、亜セレン酸ナトリウム (300 nM)、トランスフェリン (1 mg/mL)、プトレシン (1 mM)、グルコース (60 mg/mL)
   2. 準備血清を含む培(10 mL): 85 %dmem/f12 キー、変更 10 x N2 サプリメントは 10%、5% ウシ胎児血清 (FBS)
   3. 準備無血清培(20 mL): 90 %dmem/f12 キー、10% 変更 10 x N2 サプリメント
   4. ラット尾コラーゲン溶液0.5 mL を準備します。簡単に言えば、無菌条件下でのラットの尾からの柔らかい繊維を取り、酢酸溶液で一晩インキュベートします。遠心分離の後上澄み (数 mg/mL) を集め、冷蔵庫¹³します。
2. 培養皿の準備
   1. 35 mm のペトリ皿に膜挿入を配置します。
   2. 膜にラット尾コラーゲン溶液の 40-50 μ L を追加し、中心の周りのコラーゲン ソリューションを普及します。
   3. 空気は、クリーン ベンチで完全に膜を乾燥させます。
   4. 膜媒体でビショビショですように、皿に 1.5-2 mL の血清を含む培養液を置きます。
   5. めっき前にインキュベーター (37 ° C、加湿の 95% の空気と 5% CO₂) で培養皿を配置します。
3. 皮質の準備
   1. 10 分以上、70% エタノールですべての手術器具を滅菌します。
   2. 生後 (P) 2 からすぐに全脳を解剖 (氷片に数分間浸漬) 冷たい麻酔下ラット。
   3. 場所を 100 mm ペトリ皿冷たいハンクスの 100 mL を含む脳は平衡塩類溶液です。
   4. 微細鉗子で脳から pia 問題を削除し、顕微鏡下のハサミで視覚と体性感覚野から皮質スライス (300-400 μ m 厚) をカット (詳細については、図 1を参照)。
      注:双眼顕微鏡の下のグリッドのスケールでは、皮質の厚さはおよそ。
      注:また、皮質無菌条件下で vibratome を作ることができます。
   5. 使い捨てプラスチック ピペットと膜挿入にいくつかの皮質スライスを転送します。
   6. (詳細についてを参照してください^8,13) 火磨かれたパスツール ピペットで文化挿入の中心近くスライスの位置を調整し、挿入から余分なメディアを削除します。
      注:スライスは、ガスとメディアの両方の十分な供給を受信できるように、スライスの表面の下にわずか媒体のレベルを調整します。これはセル実行可能性にとって重要です。
   7. 視床のブロックを取られ、それの隣に置かれた前に 1 日だけで加湿の 95% 空気と 5% CO₂と文化の環境で 37 ° C で血清を含む培地のスライスを維持します。
4. 視床のブロックの準備
   1. 10 分以上、70% エタノールですべての手術器具を滅菌します。
   2. ペントバルビ タール (50 mg/kg) を麻酔薬の入った腹腔内投与による妊娠ラット (15 日) の麻酔します。
   3. 子宮角からそれぞれの胚を解剖し、100 mm ペトリ皿冷たいハンクス平衡塩溶液の 100 mL を含む胚を配置します。
   4. 双眼顕微鏡の下でそれぞれの胚から脳を削除し、核複雑と外側膝状体 (約 0.5 mm × 3)⁷ (図 1参照) 顕微鏡のはさみを使用してを含む主に視床のブロックをカットします。
5. 文化し、脊髄共培養系を維持
   1. パスツール ピペットを使用して、メンブラン フィルター上に配置されている皮質スライスの心室の表面の横にある視床ブロックを配置します。
   2. 加湿の 95% の空気と 5% CO₂の環境で 37 ° C で血清を含む培地の共培養系を維持します。
   3. 2 日間の培養後培養の無血清培地での培地の半分を交換します。その後、2 〜 3 日ごと媒体を交換します。
      注:媒体のレベルは、細胞の生存のために重要であるメディア交換後チェック必要があります。

2. エレクトロポレーション

すべてのプロシージャは、無菌条件の下で行わなければなりません。

注:エレクトロポレーション 1 日後、ブロックの離脱を防ぐために視床のブロックの準備を実行します。

1. プラスミド
   1. プラスミドの混合物を次のようにすること: pCAGGS 下流 2 μ g/μ L。pCAG-SYP EGFP の 3.5 μ g/μ l。
      注:エンドトキシン フリーの Maxiprep キットを使用して両方のプラスミッドの浄化し、ハンクス平衡塩溶液中で溶解します。
2. エレクトロポレーション機器のセットアップ
   刺激物やアイソレータなど電気計測器は、図 2に示すように接続してください。
   1. 相性アイソレータに刺激を接続します。
   2. 電極 (銀線 0.2 mm 径) をアイソレータの負の端子に接続します。
   3. 電極 (銀線 1 mm 径) をシリーズに 100 Ω 抵抗とアイソレータの肯定的なターミナルに接続します。
   4. オシロ スコープ電流増幅器で電圧を測定することによって抵抗の両端で渡されるかどうかを監視するためにアンプを接続します。
3. ガラス ピペットの準備
   注: ガラス ピペットの 2 種類は、プラスミド溶液の排出と電気パルスの応用に使用されます。
   1. 電極引き手とガラス管からピペットを作る。
   2. (先端径が 20-50 μ m であるべき) 放出ピペットの先端を破る。
   3. 挽くし、サンドペーパー火研磨 (内径は 50-200 μ m であるべき) 続いて電極ピペットの先端を研磨します。
      注:それ直接組織に触れると、電極先端部は平らで滑らかでをする必要があります。
4. 電気穿孔法の手順
   1. マニピュレーターにイジェクトや電極のピペットを接続します。
   2. 電極ピペットに銀線 (0.2 mm 径) を挿入します。
   3. プラスチック製のチューブを 1 mL の注射器に取り出しピペットを取り付けます。
   4. 取る > 注射器吸引吐出ピペットにプラスミド溶液 5 μ L。
   5. エレクトロポレーション ステージ共を入れて培養培地に 1 mm 径の電極を挿入します。
   6. 視床外植体に放出ピペットを配置します。
   7. 先端が視床のブロックの表面に触れる後に注射器を手動でプッシュします。
      注:プラスミッドの 0.5 μ L についてソリューションは 1 つの視床ブロックあたり通常使用されます。
   8. イジェクション ピペットの撤回後すぐに視床のブロックに電極ピペットを配置します。
   9. 電気パルス (50-400 μ A、200 Hz で 1 ms の 200 の矩形パルスの 3 に 5 列車) を提供します。振幅とオシロ スコープの列車の数を監視します。
      注:電流の振幅は、電極ピペット¹³の内径に依存します。
   10. 電極ピペットを撤回し、インキュベーターに皿を返します。
5. 顕微鏡観察
   1. EGFP の 2 つのフィルター セット装備直立した共焦点顕微鏡の顕微鏡ステージ上培養皿を置く (励起、488 nm; 排出, 515 nm) とした DsRed (励起、514 nm; 排出, 565 nm)。
   2. 10-25 光学セクション 1-7 μ m のステップ サイズ、20 X 長作動距離の対物レンズでの画像を取る。個別に区別のラベル付き軸索した DsRed、SYP EGFP の両方を表現するを選択します。
      注:観測地は約 0.7 × 0.7 mm (つまり 1024 x 1024 ピクセルに対応する、0.68 μ m/ピクセル)。
   3. 毎日イメージングのためのすべての 24 h の画像をキャプチャします。室温で 10 分間以内に完了し、インキュベーターに文化を返します。短い間隔の時間タイムラプス イメージングのための環境湿度 95% 空気と 5% CO₂ 37 ° C で維持する培養室で文化を維持します。

結果

ここで TC 軸索分岐とシナプス形成との関係を明らかにすることを目的に記載されているの実験。同時に脊髄共培養系における少数の視床細胞やシナプス前のサイトは、単一の場所軸索の軌跡を視覚化するには、SYP EGFP とした DsRed エレクトロポレーションを使用して 2 つのプラスミドを導入させた。文化の第 2 週の間に軸索 TC 個別に区別はっきりした DsRed (図 3) でラベル付けされました。展示した DsRed、SYP EGFP 軸索のみ観察しました。ラベル付きの TC 軸索皮質のスライスを侵略し、切片における視床軸索 cocultures生体内で^7,が見つかりましたフォーム枝流の特異性に似ているとことを示す上部の層は、主に枝を形成^8,10,1...

ディスカッション

現在のプロトコルはまた TC 投影¹¹以外の軸索の成長の発達的側面を研究する強力なツールです。例えば、皮質スライス培養とエレクトロポレーション技術の組み合わせは、皮質ニューロンと長期観測^9,18の個々 の軸索形態を視覚化することができます。

現在のプロトコルを使用しては、蛍光タンパク質および興味の遺伝子の共発現による軸索分岐とシナプス形成における興味深い遺伝子の役割を分析できます。通常、以上蛍光蛋白発現細胞の 90% が co transfected 第 2 プラスミド プラスミド溶液のモル比が 1:2^18,19に調整されます。ただし、最適な比率は共トランスフェクション効果と異なる場合があります、ベクトルの間で発現レベルはさまざま。

現在のプロトコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
ハンクス平衡食塩水 (HBSS)	ニッスイ	5905
ウシ胎児血清 (FBS)	Thermo Scientific	社 SH30396-03	ハイクロン
インスリン	Σ	I6634
プロゲステロン	Σ	P8783
ヒドロコルチゾン	Σnbsp;	H0888
亜セレン酸ナトリウム	和光 Pure Chemical Industries	192-10843
Transferrin	シグマ	T1147
プトレシン	Sigma	P5780
Glucose	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
35 mm シャー	Falcon	351008
Millicell-CM insert	Millipore	PICMORG50
100 mm シャーレ	BIO-BIK	I-90-20	リル
HiPure プラスミド Maxiprep キット	Invitrogen
ディスポーザブル滅菌プラスチックピペット		202-IS	トランスファーピペット 滅菌
ガラスキャピラリー:外径1.2mm	なりしげ	G-1.2	内径、1.2 mm
銀線:0.2 mm、1 mm	ニラコ	AG-401265 (直径 0.2 mm)、AG-401485 (直径 1.0 mm)
1 mL シリンジ	テルモ	SS-01T
刺激装置	A.M.P.I	Master 8
二相性アイソレータ	BAK ELECTRONICS	BSI-2
アンプ	A-M Systems	Model 1800
オシロスコープ	日立	VC-6723
マニピュレーター	成重	SM-15
マイクロマニピュレーター	成重	MO-10
実体顕微鏡	オリンパス	SZ40
ユニバーサルスタンド	オリンパス	SZ-STU2
ライト照明システム	オリンパス	LG-PS2、LG-DI、HLL301
電極プーラー	成重	PC-10
共焦点顕微鏡	ニコン	デジタルエクリプス C1 レーザー
x20 対物レンズ	ニコン	ELWD 20x/0.45
培養室	東海ヒット	イギリス A16-U
スプレイグ・ドーリー (SD) ラット	日本 SLC と 日本・生物
顕微鏡 ハサミ	夏目	MB-54-1