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上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

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DOI：

10.3791/56568

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2018年3月12日

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1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。

要約

3 D 浸潤アッセイを開発しているが、その微小環境の整合性に影響を与えずに細胞を研究課題が残っています。ボイデン室必要セルが元の文化場所から避難して、新しい環境に移動するなど、従来の 3次元の試金します。だけでなく、これが、微小環境に固有な細胞プロセスを混乱させる、それは多くの場合細胞の損失の結果します。まれ、かの微小環境に非常に敏感な細胞を扱うとき、これらの問題は特に挑戦的です。ここでは、両方の問題を回避する 3 D 浸潤能の測定法の開発について述べる.この分析では、小規模でも細胞をめっきし、走化性因子を含む ECM 行列をセルの上に置いた。これはセル変位を必要としない、上向きマトリックスへの侵入セルをできます。このアッセイでは、細胞の形態と同様、細胞浸潤は、コラーゲン ・ ゲル内で評価できます。この試金を使用して、我々 は稀で、敏感な細胞の侵襲的な容量を特徴付ける乳癌細胞 MCF7 と間葉系/多能性の融合から生じるハイブリッド細胞幹/間質細胞 (MSCs)。

概要

細胞運動は細胞の正常発達的および生理学的プロセスです。ただし、パターンと移行し、侵入する細胞の能力の変化は、炎症性疾患、がん転移1,2,3などの病態に関連付けられます。転移がんで最も悪い理解の側面といえます。転移、がん細胞は細胞外マトリックス (ECM) が低下する、ローカル組織および intravasate に侵入する必要があります。循環では、がん細胞は、遠くのサイトに発信する、extravasate、二次性腫瘍を形成します。したがって、能力 ECM を低下させる細胞の移行して侵入するが、転移能に関連します。異なるアプローチは、分析、細胞の移行と侵略の機能を定量化して開発されています。最もよく使われる方法には、創傷治癒の試金、微速度顕微鏡観察、ボイデン室アッセイが含まれます。創傷治癒の試金4と時間経過顕微鏡検査、細胞遊走に予備的な洞察力を与えるだろう簡単で便利な試金。ただし、細胞が生体内で存在する 3 D 環境を反映して 2 D の試金はどちらも。研究では、細胞が 2 D 15,6と比較して 3 D 環境に異なる反応することを示しています。さらに、創傷治癒の試金は再現し、量的な結果7,8,9をもたらす困難です。創傷治癒のアッセイの 3 D の変更、セルの除外ゾーンの試金はもっと生理学的に関連するアッセイが細胞融合イベント10,11 から生じるハイブリッド細胞など数の少ないセルに適していません.

ボイデン室アッセイは、細胞研究関連微小を提供する 3 次元試金です。ただし、セルの元の微小環境から削除して移行し、走化性因子含む培地に向かって下方に侵入・ ボイデン ・ アッセイ系の上部室に預けられるが必要です。この 3 D のアプローチは細胞の微小環境やで限定数10、11,12に脆弱性の移行および侵略の機能の分析に適していません。細胞の遊走・浸潤を分析する新しいアプローチは、マイクロ流路勾配商工会議所アッセイ13です。適した、移行および侵略の研究の信頼できる、この試金はより高価な典型的な実験室の技術的に困難な場合が。ここで、微小環境に敏感な細胞を含む多くの細胞の種類と互換性があるおよび/または数の制限は、単純な反転垂直浸潤アッセイについて述べる。この試金はフーパーらによって提案されたプロトコルから適応されました。14します。 この分析では、セルのまま彼らの元の環境での移行と侵略が走化性因子の11を含むコラーゲン ・ ゲル内上方に移動ことを監視します。この試金は再現はされて最適化し、35 mm ディッシュで検証します。それは、異なるセル文化のサイズ、異なるマトリックス付着、および異なる塩基の強さなどさまざまな分析条件に適応できます。この試金は、創薬プロセスの初期スクリーニングのための in vitroプラットフォームとして役立つことができます。

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プロトコル

注: このプロトコルは、McArdleらに説明します。11します。図 1のタイムラインを提供します。

1. 培養プレートの準備

  1. ガラス底の疎水性を下げるための 15 分の 1 M 塩酸 (HCl) 1 mL と 10 mm のガラス底を含む 35 mm の培養皿を洗ってください。
  2. リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) すべての HCl を取り除くために 1 mL で 2 回培養プレートを洗います。
  3. 文化の 70% エタノール 1 mL を 2 回洗浄します。
  4. 1 ml の細胞特定の培地の培養プレートをリンス (ここでは、使用 α-MEM 10% 熱を添加した不活性 FBS と 1% 非必須アミノ酸)。
    注:次の日まで加湿器では 37 ° C で CO2インキュベーターで培養液を含む処理培養プレートを格納できます。
  5. 35 mm ディッシュの扱われたガラス底に細胞 (MSCs と MCF 7 共培養) を 100% の confluency に成長します。35,000 MSC 細胞および 75,000 24 h MCF7 細胞の共培養します。

2. コラーゲン ゲルの調製

  1. 接触時にコラーゲンの重合を防ぐために冷凍庫にコラーゲン ・ ゲルをピペッティング用マイクロ ピペットのヒントを格納します。
    注:これは、最も重要なステップです。
  2. ボリュームを決定するラット尾コラーゲンのため私はコラーゲン株式の濃度に基づきます。この試金のためのコラーゲン ・ ゲルの 100 μ L を準備します。
    注:私は在庫ありラット尾コラーゲンの高濃度が適しています。それに応じてコラーゲンを希釈に使用するダルベッコ変更イーグル培地 x 10 のボリュームを決定します。
  3. 私 (3.8 μ g/mL 在庫)、10 x ダルベッコ変更されたワシの媒体および 1 x 細胞培養液 2% 牛胎児血清と 2.4 mg/mL のコラーゲンの最終的な集中に適切な走化性因子を添加した氷ラット尾コラーゲンを結合します。
  4. コラーゲン ・ ゲルを中和するために重炭酸ナトリウム溶液の混合物の 4.5% に追加します。
    注:重炭酸ナトリウム溶液を追加のボリュームは他の試薬の正確な pH によって異なります。中性の溶液を確保するか、培地の pH 指示薬を使用して pH のストリップとの混合物をテストすることをお勧めします。
  5. ガラス底培養皿の中で細胞をコラーゲン混合物の 80 μ L を横たわっていた。
  6. 加湿器では 37 ° C で CO2インキュベーターで 30 分間重合コラーゲン ゲルを許可します。
  7. 減らされた血清 (2%) と細胞用培地 2 mL でコラーゲン ・ ゲルをカバーし、24、48、72 時間に加湿器で CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
    注意:プレートは、ガラス底から切り離す、コラーゲン ・ ゲルを防ぐために慎重に取り扱う必要があります。

3. コラーゲンの準備の例は、3.8 μ g/mL のラット尾コラーゲン在庫を使用してゲルします。

  1. 氷上では、ラット尾コラーゲンの 114.5 μ L、DMEM、x 10 の 16.6 μ L と、走化性因子を含む培地の 33.1 μ L を組み合わせます。
  2. 重炭酸ナトリウム 14.0 μ L でコラーゲン混合物を中和します。
  3. 手順 2.5 のように続けます。

4. 細胞のイメージング

  1. そっとお皿からメディアを削除します。
  2. 1 ml の PBS のゲルを軽くすすいでください。
  3. 15 分 4% パラホルムアルデヒドの ml の 1 セルを修正します。
  4. 1 mL の PBS で 2 回細胞を洗浄します。
  5. DAPI 溶液 (100 ng/mL) 室温で 20 分間と細胞を染色します。
  6. 共焦点の顕微鏡を使用して、別の場所での撮影 400 μ m z スタック 16 μ m ステップの各位置のセルをイメージします。顕微鏡の使用により、白色光、アーク励起源を用いた共焦点イメージング ユニットをスキャン ディスクがあります。0.75 の開口で利用されている 20 倍レンズを使用します。
  7. 画像を再構築します。
    1. 与えられたゲル (約 25 画像) の画像を開き、イメージ → スタック → 画像のスタックをクリックして画像のスタックを作成します。ゲルの底に対応した最初のイメージ (z = 0 μ m)、2 番目のイメージは、z 方向の最初のステップに対応した (z = 16 μ m)、z 方向の 2 番目のステップに対応した 3 番目のイメージ (z = 32 μ m)。それぞれのイメージの深さに核を評価し、核はその特定のセルの侵入深さが鮮明で焦点に深さを指定します。

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結果

ガラス下部およびラット尾コラーゲン入り 35 mm 培養皿を用いて開発し、生体外で3 D 侵略を最適化する私はプロトコルを試金。我々 は癌細胞 MCF7 と MSC 胸を示したこのアッセイを使用して細胞が 0.04 ± 1.8 μ m、μ m ± 76.0 41.3 平均距離にコラーゲン ・ ゲルに 48 時間後それぞれ侵入しとき IGF1 (18.6 ng/mL) は、走化性因子 (図 2) として使用されました。さらに、希少な細胞である MSC と MCF7 細胞融合製品が同様のコラーゲンゲルに侵入する可能性を示した。IGF 18.6 ng/mL で私として使用した場合、48 h で侵略の彼らの平均距離は μ m ± 12.4 10.7 走化性因子 (図 2)。MCF7 と MSCs 侵攻能力の差は有意 (P < 0.01)11。融合製品の侵攻能力と MCF7 または MCSs ...

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ディスカッション

ここでは、様々 な細胞などの微小環境に依存したり、まれにあるセルに便利です簡単な反転垂直浸潤能の測定法について述べる.この 3 D 浸潤アッセイの細胞は彼らの元の微小環境の維持し、走化性因子を含むコラーゲン ゲルで覆われています。セルは移行し、コラーゲンに侵入します。このアッセイで細胞を染色し、ゲル内で簡単に監視できます。シンプルさとこのアッセイの再現性は、3 D システムでがん細胞の遊走・浸潤を勉強するための便利なツールとなります。ただし、強い塩基は培養皿の底に細胞親和性を破るに必要と思われます。

35 mm ディッシュの倒立垂直浸潤能の測定を最適化されています。この培養皿は 10 mm のガラス底もイメージングも装備されています。この培養皿の 1 つの制限は、分析を実行するために必要なコラーゲン ・ ゲルのかなりの量です。イメージングと互換性のあるデザインを見つける小さい培養皿はより経済的になります。35 mm ディッシュ デザインの適切なゲル層はその強さのため非常にデリケートで、慎重に処理をされないとプレートの底からデタッチすることができます簡単に。別のセルの文化デザインがコ...

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開示事項

著者は、競合する関心が存在しないことを宣言しています。

謝辞

この作品は、ジャクソン州立大学と米国防、アイデア賞 11-1-0205 部環境衛生 RCMI センターを通じて健康の国民の協会 (NIMHD G12MD007581) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation、マサチューセッツ州アッシュランドP35G-1.5-10-CMattekガラスボトムディッシュ
ラットテールコラーゲンIコーニング、コーニング、ニューヨーク、アメリカ354236 コラーゲンゲル
酸Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州 63178 USAH1758HCl
リン酸緩衝生理食塩水Thermo Fisher Scientific Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム、アメリカ10010023PBSの
10X Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAD242910X DMEM
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USAS5761NaHCO3
共焦点蛍光顕微鏡Olympus America, Center Valley, PA, USAOlympus IX81Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine SerumGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USASH30070.03FBS
Ti:Sapphire 多光子レーザー走査顕微鏡Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA40x NA 0.8 objectiveMPLSM
Imaris softwareBitplane Inc. Zurich, CHImaris 7.5.2Imaris software
DAPISigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAD9542DAPI
パラホルムアルデヒドThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA50980487PFA
α-minimum essential mediumSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAM0894
MDA-MB-231ATCC;マナサス、バージニア州、米国HBT-22
MSCTrivedi and Hematti、2007
20X レンズ UPLAPOオリンパスアメリカ、センターバレー、ペンシルベニア州、米国36-064オリンパス UPLSAPO 20X 対物レンズ
塩

参考文献

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
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  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
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  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

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