標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元

サマリー

これは癌管理の非常に満たされていない医療ニーズである標的治療薬抵抗性獲得のメカニズムを調査時間および費用効果の in vitroプロトコルです。

要約

過去 20 年間には、細胞毒性薬から医療がんの標的治療へのシフトを見てきました。標的治療薬より印象的な臨床効果と従来の治療法よりも最小化された副作用に示されてが、薬剤耐性の利点の主な制限となっています。臨地実習における標的薬抵抗性のいくつかの/体外・体内の前臨床モデルは、主に 2 つの戦略を使用して開発されている: 獲得抵抗性とii) の in vitro 遺伝子型をモデル化するための i) 遺伝子操作/生体内の抵抗性モデルの選択。本研究では薬剤耐性細胞のサブクローンの世代からの説明から始まって、ターゲット治療薬抵抗性獲得に責任があるメカニズムを調査するため統一的枠組を提案します。阻害剤に感度を復元するために使用するプロシージャを黙らせます。この単純な時間と費用の有効アプローチは広く適用できる、異なる腫瘍 histotypes の他のターゲット治療薬に抵抗性の機構を調査するために簡単に拡張できます。

概要

分子細胞生物学の重要な発見をフォロー アップして、新規に合成された抗がん剤の分子の数は、選択的に腫瘍のタイプの広い配列で発癌性シグナル伝達経路をターゲットに開発されています。特に、腫瘍のユニークなプロパティを持つ対象の治療薬の 2 つのカテゴリ、すなわち合成化合物、遺伝子組換え抗体の臨床成功とで劇的に変化した癌治療を達成しているが知られています。ここ数十年^1,2,3。

それにもかかわらず、その印象的な初期応答にもかかわらず治療に、癌患者の大半はすべての標的治療薬、モノクローナル抗体とキナーゼ阻害剤への薬剤耐性を開発しました。結果として、薬剤耐性、古典的な抗がん薬⁴の主要なハードルはまだ新たな標的治療^5,6にとって大きな挑戦であります。

標的治療への抵抗は本質的なものがあります (つまり、プライマリ) または (すなわち、セカンダリ) 取得します。本質的な抵抗では、薬物治療⁷への応答の期間後に発生する二次抵抗に対しの療法への応答のde novoの欠如について説明します。後者は原始的な腫瘍の大部分の内で腫瘍細胞の小さなコホートの発生によって引き起こされるまたは遠位の不可解な解剖学的ニッチに囲まれた、90% までを展示抵抗 1 つまたは複数のターゲット治療薬。主に目標とされた療法に抵抗性の発現の基礎となる分子機構に起因ターゲット遺伝子変異とその理解はまだはるかに完全な⁸その他生存シグナル伝達経路の冗長活性化。

この作品は、体外サイレンシングの説明への薬剤耐性細胞のサブクローンの世代から始まって、ターゲット治療薬抵抗性獲得のメカニズムを調査するため時間と費用有効方法を提案阻害剤のテストと作業仮説を検証するために使用する重要なツールに感度を復元するために使用する手順。特に、我々 のアプローチは、胃癌トラスツズマブ (例えばハーセプチン)、HER2 タンパク質⁹の細胞外ドメインを対象とするヒト化モノクローナル抗体に抵抗機構の調査に使用されました。化学療法 + トラスツズマブは HER2 陽性転移性乳癌に対する標準のファーストライン治療として広く受け入れられます。治療が両方生体外で有意な活性を持つその抗 HER2 を示す最近の臨床研究のおかげで、生体内でHER2 陽性胃癌モデル^10,11分子薬 HER2 をターゲットにされています。広範囲の臨床試験で検討した、いくつかはまだ進行中、胃食道がん^12,13,14,15症例。

これらの研究は、トラスツズマブに¹⁶、他の標的治療阻害剤の観察されるものと同様に抵抗を発生している患者数は上昇を強調しています。特に、トラスツズマブの応答率は 47% で、トラスツズマブ + 化学療法を受けている患者の全生存中央値はわずか 2.7 ヶ月化学療法単独で¹⁷の患者よりも長くなります。これは、プライマリ トラスツズマブ抵抗は普及しているが、セカンダリのトラスツズマブ抵抗は避けられない示唆されました。このため、緊急にこの腫瘍¹⁸内腫瘍の遺伝の不均質を与えさらに問題は、胃癌 HER2 標的治療抵抗性の原因とメカニズムを解明する必要があります。

さらに、胃癌トラスツズマブへの抵抗のメカニズムはこの状態の信頼性の高い前臨床モデル代表の取得の難しさのため、部分的に説明するは困難証明しました。大島らは、トラスツズマブ¹⁹治療後小さな残留腹膜転移の繰り返された文化から成るトラスツズマブ抵抗性胃癌細胞株の生体内での選択法を報告しました。ただし、筐体の特定動物取り扱い専門、動物倫理委員会の承認の必要性は、時間とコストのかかるメソッドにすることに貢献しました。この作品で述べる方法は簡単で、広く適用できると異なる腫瘍 histotypes²⁰の他の治療薬に抵抗性のメカニズム解明のために簡単に拡張可能性があります。

プロトコル

注: このプロトコルは、具体的にはトラスツズマブ HER 陽性胃癌細胞株の抵抗性獲得機構の解析に調整されています。必要なすべての実験室の器械は、材料表で報告されます。

1. 対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代

注: これは、最も重要かつ異なる細胞を表わすかもしれないない別の感度にターゲットを絞った治療阻害剤独立して腫瘍 histotype や薬物濃度からという事実のために、プロトコルの手順を標準化することは困難使用されます。

1. 文化 NCI N87 セル RPMI 培牛胎児血清 (10%) とグルタミン (2 mM, 1%)、37 ° C で単分子膜としての線、25 cm²培養フラスコにシードします。
2. 先発の線量としてトラスツズマブの各のフラスコ 10 μ g/mL の培養液を追加します。彼らは成長を再開するまでは、先発の線量に細胞を公開します。
   注: 標的治療阻害剤の先発の線量は 10 倍、血漿中のピーク濃度よりも低いはずです。血漿中のピーク濃度は、通常次の標準療法の複数用量患者血中薬物濃度の最高レベルです。この値は、薬物動態に関する研究から取得することができます。
3. トリパン ブルー色素排除法と細胞の成長を監視します。(通常 2 〜 3 週間の期間) 後細胞の成長を再開すると、トラスツズマブの 10 倍高い線量集中する細胞を公開します。
4. (約 2 週間) 後の高い薬物濃度 (少なくとも 2.5 - 4 倍プラズマ ピークよりも高い) の存在にもかかわらず、成長細胞維持までトラスツズマブ (から 400 μ g/mL に 100 μ g/mL) 量が徐々 に増加する細胞を公開します。
5. 濃度の培養液でターゲット療法阻害のあらゆる変化で標的治療への抵抗のレベルを評価するクローン形成法を実行し、相対抵抗 IC₅₀インデックス (RR IC₅₀) を次のように定義します。
   1. 24 ウェル培養皿 500 細胞を播きます。
      注: 5 ウェルズは、条件セットごとに準備されなければなりません。
   2. 100 μ g/mL 400 μ G/ml までターゲット療法 (トラスツズマブ) 阻害剤の濃度を上げるに細胞を公開します。
   3. 15 日間の 37 ° C で CO₂インキュベーター内のセルを孵化させなさい。
   4. インキュベーション後、修正し、次のようにサンプルを染色します。
      1. 10 mL の 1x PBS の媒体とリンスのセルを削除します。1x PBS を削除し、固定液 (酢酸酸: メタノール、1:7、(巻/巻)) の 2-3 mL を追加します。固定の解決を削除し、0.5% クリスタル バイオレット溶液を追加します。2 時間室温で孵化させなさい
      2. クリスタル ・ バイオレット液をピペットで吸引によって慎重に削除し、クリスタル バイオレット ソリューション残渣を洗い流す水道水でプレートを浸します。2 日間室温で空気乾燥します。
   5. 倒立顕微鏡 (4 倍) を使用して 50 以上の細胞のコロニーをカウントします。
      注: この 2 つの独立した観測者が必要です。
   6. RR IC₅₀をターゲット治療抵抗性 subclone セルの IC₅₀値と元/ナイーブ細胞の値の比率として計算します。

2. 検証プロトコル候補者に対象療法抵抗性遺伝子 (R 遺伝子)

注: 遺伝子発現の解析後、署名に関連付けられているターゲット療法と任意の候補遺伝子獲得抵抗性を通じて抵抗のドライバーを調査する:) RT-PCR および b) ウエスタン ブロット分析。

1. リアルタイム RT-PCR
   1. 細胞を用いた酸ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム混合物からの総 RNA の抽出 (材料の表を参照してください)。
   2. ランダム hexamer プライマーを使用して逆のトランスクリプション (RT) 反応を行い、熱 cycler を次のように設定: 46 ° C、20 分で RT、RT 不活化 1 分 95 ° C で 5 分間 25 ° C でプライミングします。
   3. 20 μ L 反応の総 RNA の使用 400 ng。反応混合物を次のようにサンプルの準備: 7 μ L RNase フリー H₂O、2 μ L cDNA (10 ng/μ L)、ターゲット固有の蛍光標識プローブ、x 1 μ 20 と 10 μ L 2 x ミックス含むバッファー、dNTPs、DNA ポリメラーゼ (材料の表を参照してください)。
   4. 各ウェル プレートに反応混合物の 20 μ L を追加し、次のプログラムを実行: 95 ° C、10 分 (1 サイクル) で、2 分の 50 ° C でステージを開催40 サイクル 95 ° c、15 秒と 1 分の 60 ° c。
2. 西部のしみ
   1. 0.05%/トリプシン EDTA 溶液 2 mL を追加し、動作するようにトリプシンの 2 〜 3 分を許可するには、細胞懸濁液を回復します。
   2. 中型含む 10% 牛胎児血清トリプシン (例えば、各 1 mL のトリプシンのための媒体の 2 mL) を中和し、1,200 x g で 5 分間遠心冷 1x PBS で破棄上清および洗浄細胞の 2 つのボリュームを追加します。
   3. 5 分 1,200 × g で遠心分離し、上澄みを廃棄します。換散バッファーと細胞ペレットを再懸濁します、4 ° C、30 分でロッカーで孵化させなさい。
      1. 換散バッファーの量によって異なります (例えば1 x 10 の⁶セルを 100 μ L); 細胞数毎回新鮮な換散バッファーを準備することを確認します。換散バッファーの準備 (氷の上を残す) の 1 ml: 975 μ M を使用して-10 μ L 100 μ M PMSF 阻害剤、15 μ L ホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤は、哺乳類の溶解バッファーあたり。
   4. 4 ° C 15 分で 13,000 × g で遠心沈降法による細胞のライセート上清タンパク質を回復します。
   5. BCA タンパク質アッセイを用いたタンパク質の濃度を決定します。
   6. 蛋白質のサンプル (蛋白質の少なくとも 20-30 μ g) と 3 分間 100 ° C で熱に塩化物イオン サンプル バッファー x 4 を追加します。
   7. プレキャスト 4 20% ゲルを使用し、塩化物イオンとタンパク質溶液の 20-30 μ g、タンパク質標準サンプルごとの 5-10 μ L を読み込みます。
   8. トリス/GLICYNE/SDS 1 x バッファーと西部のしみリングを記入し、(時間停止染料はゲル、それ以外の場合、いくつかの追加分の実行の終わりに達したことを確認する) とき 110 V 30-60 分のためのゲルを実行
   9. PVDF 膜に蛋白質を転送する Electroblot (材料表参照) 半乾燥システムを使用しています。
   10. 1 時間室温でシェーカーで適切なタンパク質溶液 (ミルク/BSA 5%) に浸漬して膜をブロックします。
   11. アンチ IQGAP1 一次抗体と 1: 400 ソリューションは、5% ミルク ソリューション (材料の表を参照してください)。
   12. 一晩冷蔵室のシェーカーの一次抗体溶液中膜を配置します。
   13. 次の日、抗体溶液を破棄し、T TBS 1 x 溶液中浸漬 (1 T TBS x: 1 x Tween20 で Tris バッファーは生理食塩水を追加 0.1%) は 7 分間室温でシェーカーで。
   14. ソリューションと置換 x T-tbs 系 1 を破棄します。3 回繰り返します。
   15. 標準的な西部の抗体を追加することによってしみの検出 1: 10,000 のセカンダリ マウス抗体溶液を作成 (材料の表を参照してください); シェーカーに膜を置くと2 時間室温に置いたまま。
   16. 抗体溶液を破棄し、7 分間室温でシェーカーで T TBS 1 x 溶液中浸漬します。
   17. ソリューションと置換 x T-tbs 系 1 を破棄します。3 回繰り返します。
   18. 化学発光液 5 分間膜を浸漬し、化学発光のイメージャの膜をイメージします。

3. 候補 R 遺伝子ノックダウンによる標的治療阻害剤感受性の復元

1. セル準備
   1. Trypsinization 単一細胞懸濁液を準備します。細胞当日 transfection を実行します。
      1. 洗って NCI N87 PBS のセルし、5 ~ 10 分追加 2 RPMI 培地含む 10% 牛胎児血清トリプシン (例えば、各 1 mL のトリプシンのための媒体の 2 mL) を中和する量の 0.05% トリプシン/EDTA 溶液で 37 ° C で孵化させなさい。
      2. トリパン ブルー染色を用いた検定とセルをカウントします。各条件の T25 cm²フラスコにシード 2.5 x 10⁵セル (60% 合流)。
         注: 播種のための細胞の適切な数は、細胞倍加時間と実験の期間によって決定されます。目的は、ターゲット遺伝子ノックダウン実験の全体の持続期間のために達成するためにです。9 T25 cm²フラスコは、トランスフェクション条件とクローン形成法 (コントロール、負トランスフェクション コントロール、遺伝子ターゲット transfection のため 3 フラスコ 3 フラスコ 3 フラスコ) に最適です。
2. トランスフェクション
   1. 遺伝子ターゲットを準備し、次のように各 T25 cm²フラスコのコントロール トランスフェクション ミックスを負します。
      1. 各標的遺伝子の siRNA オリゴヌクレオチドまたは最小限不可欠なトランスフェクション媒体 (比率 1:55; 参照テーブルの材料) のネガティブ コントロール siRNA オリゴヌクレオチドの 12.5 μ L を希釈します。
      2. カチオン性リポソームのトランスフェクション試薬 (siRNA オリゴヌクレオチドの標的遺伝子と 1:1 の比率; 参照材料テーブル) を追加します。20 分間室温でインキュベートします。
         注: トランスフェクション ミックスの容量は 700 μ L です。
      3. 各 T25 cm²フラスコにトランスフェクション ミックス 700 μ L を追加します。1 〜 3 日の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
   2. RT-PCR および西部のしみの分析による遺伝子ノックダウンを確認します。推定 R 遺伝子ノック ダウン (繰り返し手順 1.5) コロニー形成実験を通じてターゲットを絞った治療エージェントと感度復原の影響を再確認してください。

結果

図 1では、実験の手順のフレームワークについて説明します。HER2 とトラスツズマブ感受性の高レベルを表現する 3 胃癌細胞株 (IC₅₀ < 薬物、図 2 a、左のグラフのピーク血漿中濃度) ターゲットを絞った治療剤を含む培養液中で育った。用量には、トラスツズマブ (10 μ G/ml) のピーク血漿中濃度は開始用量として設定され、徐々 に 400 μ g/mL 8-12 ヶ月の期間にわたって増加したより 10 倍低い。その後、IC₅₀値トラスツズマブ (図 2 a、右のグラフ) の最高血漿中濃度より低いと安定した抵抗の表現型によって特徴付けられる 3 つのサブクローンを得た。特に、最も耐 subclone、HR NCI N87 28.57 (図 2 b) RR IC₅₀

ディスカッション

パーソナライズし、対象と治療法は、成長している熱意を誘発しているが、これらのいわゆる 'スマート' 療法として従来の化学療法薬、すなわち、薬物抵抗性の急速かつ予測不可能な獲得同じ主要なハードルに直面します。標的療法の結果を改善するためにそれらを引き起こすメカニズムの理解を通じて薬剤耐性問題を解決されなければなりません。ここでは、私たちは癌細胞ラインのモデルで標的治療薬抵抗性獲得のメカニズム解明のため広くアクセス可能な培養方法論を発表しました。

対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代は最も重要で使用、細胞間と薬剤感受性の異なる程度固有の遺伝的多様性により、このプロトコルの手順を標準化することは困難です。これらの理由から、耐性のサブクローンを取得に必要な時間が異なる場合があります。抗癌剤分子への慢性露出は通常強力な腫瘍増殖抑制を発生します。ただし、可変連続薬曝露 (8-12 ヶ月) が経過すると、細胞は対照細胞と同様の率と成長を再開します。

さらに、その遺伝子発現データを遺伝子関連ターゲット療...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagentは、高品質なトータルRNAを単離したり、さまざまな生体サンプルからRNA、DNA、タンパク質を同時に単離したりするための試薬です
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	iScript cDNA合成キットは、リアルタイムqPCRを用いた遺伝子発現解析用の高感度で使いやすいファーストストランドcDNA合成キットです。
TaqMan 遺伝子発現アッセイ	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays は、一対の非標識 PCR プライマーと TaqMan プローブで構成されており、5' 末端に Applied Biosystems FAM または VIC 色素ラベル、3' 末端にマイナーグルーブバインダー (MGB) と非蛍光クエンチャー (NFQ)
M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬は、培養哺乳類細胞から高効率の全可溶性タンパク質抽出を提供するように設計されています。
Halt プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) は、細胞および組織溶解物に対する完全なタンパク質サンプル保護を備えた単一の溶液の利便性を提供します。
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kitは、タンパク質標準と比較して(A562nm)総タンパク質濃度を測定するための2成分、高精度、界面活性剤対応アッセイ試薬セットです。
4x Laemmli サンプルバッファー	バイオ・ラッド	1610747	SDS PAGE用のサンプル調製には、4x Laemmli サンプルバッファーを使用します。サンプルの還元には、サンプルと混合する前に、2-メルカプトエタノールなどの還元剤をバッファーに添加してください。
4–20% Mini-PROTEAN TGX プレキャストプロテインゲル	Bio-Rad	456-1094	長寿命 TGX (Tris-Glycine eXtended) ゲルは、新しい配合で、標準的な変性タンパク質の分離と天然の電気泳動の両方に使用できます。
Precision Plus Protein WesternC ブロッティングスタンダード	バイオ・ラッド	1610376	Precision Plus Protein Prestained スタンダードは、デュアルカラー、オールブルー、カレイドスコープ、デュアル Xtra の各フォーマットでご利用いただけます。4つとも同じゲル移動パターンを持ち、3つの高強度リファレンスバンド(25、50、75 kD)があります。
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS は、SDS-PAGE によるタンパク質サンプルの分離用のプレミックスランニングバッファーです。
トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパック	バイオ・ラッド	1704156	トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパックは、トランスブロットターボトランスファーシステムを使用してミニゲルからタンパク質を迅速かつ効率的に転写します。各真空シールされたすぐに使用できるトランスファーパックには、2つのバッファー飽和イオンリザーバースタックとプレウェットPVDFメンブレンが含まれています。
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish ペルオキシダーゼ (HRP) コンジュゲートは、Precision Plus Protein Unstained Protein Standards または Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on Western Blots の化学発光または比色検出用です。
Immun-Star WesternC solution	バイオ・ラッド	5572	Immun-Star WesternC ソリューションは、タンパク質検出の方法であり、フェムトグラムの中間量のタンパク質を検出します。
ユニバーサルネガティブコントロール	Invitrogen	12935300	ネガティブコントロールsiRNAは、マウス、ラット、またはヒトの遺伝子配列と有意な配列類似性はありません。このコントロールは、細胞ベースのスクリーニングでも試験されており、細胞の増殖、生存率、または形態に有意な影響を与えないことが証明されています。
Opti-MEM Glutamax Medium	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51985026	Opti-MEM培地は、改良されたミニマルエッセンシャル培地(MEM)で、成長速度や形態を変えることなく、ウシ胎児血清の補給を少なくとも50%削減することができます。
サイレンサーセレクトプレデザイン&検証済みのsiRNA	Ambion 4390824		RNA干渉(RNAi)は、幅広い細胞タイプのタンパク質機能を研究するための遺伝子発現を効果的にノックダウンするための最良の方法です。
リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬	Invitrogen	13778075	リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬は、siRNA 導入のための高度で効率的なソリューションを提供します。一般的な細胞タイプ、幹細胞、初代細胞、従来はトランスフェクションが難しかった細胞タイプなど、さまざまな細胞株でこれほど簡単で効率的なsiRNA導入を提供できるsiRNA特異的トランスフェクション試薬は他にありません。
マウス抗IQGAP1	Invitrigen	33-8900	使用濃度: 1:400 5% 乳溶液中
ヤギ抗マウス IgG-HRP: sc-2005	サンタクルーズ	sc-2005	使用濃度: 1:10000 5% 乳溶液
中 PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	セリンプロテアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ
Thermocycler		PTC-200サーマルサイクラーは	、温度の均一性と最大3°Cの速度のランプを可能にします。C/秒このプロトコルは、他のサーマルサイクラーでも行うことができます
リアルタイムRT-PCR装置	Applied Biosystems	7500 RT-PCRシステム	これは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬を使用して、比較CTアッセイタイプを使用して相対定量を提供する5色のプラットフォームです。プロトコルは、他のサーマルサイクラー
マイクロボリューム分光光度計	Thermo Scientific	Nanodrop	少量のサンプルを使用して、正確で高速な酸性核測定を提供します
ブロッティングシステム	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo システム	数分でsemy-dry転送を行います
画像取得システムとゲルドキュメンテーション	Bio-Rad	Chemidoc画像化学	発光検出に使いやすい