これは癌管理の非常に満たされていない医療ニーズである標的治療薬抵抗性獲得のメカニズムを調査時間および費用効果の in vitroプロトコルです。
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方法論記事
標的治療への抵抗を取得ドライバーの経路を探して: 薬剤耐性 Subclone 世代と感受性遺伝子ノックダウンによる復元
この記事について
サマリー
要約
過去 20 年間には、細胞毒性薬から医療がんの標的治療へのシフトを見てきました。標的治療薬より印象的な臨床効果と従来の治療法よりも最小化された副作用に示されてが、薬剤耐性の利点の主な制限となっています。臨地実習における標的薬抵抗性のいくつかの/体外・体内の前臨床モデルは、主に 2 つの戦略を使用して開発されている: 獲得抵抗性とii) の in vitro 遺伝子型をモデル化するための i) 遺伝子操作/生体内の抵抗性モデルの選択。本研究では薬剤耐性細胞のサブクローンの世代からの説明から始まって、ターゲット治療薬抵抗性獲得に責任があるメカニズムを調査するため統一的枠組を提案します。阻害剤に感度を復元するために使用するプロシージャを黙らせます。この単純な時間と費用の有効アプローチは広く適用できる、異なる腫瘍 histotypes の他のターゲット治療薬に抵抗性の機構を調査するために簡単に拡張できます。
概要
分子細胞生物学の重要な発見をフォロー アップして、新規に合成された抗がん剤の分子の数は、選択的に腫瘍のタイプの広い配列で発癌性シグナル伝達経路をターゲットに開発されています。特に、腫瘍のユニークなプロパティを持つ対象の治療薬の 2 つのカテゴリ、すなわち合成化合物、遺伝子組換え抗体の臨床成功とで劇的に変化した癌治療を達成しているが知られています。ここ数十年1,2,3。
それにもかかわらず、その印象的な初期応答にもかかわらず治療に、癌患者の大半はすべての標的治療薬、モノクローナル抗体とキナーゼ阻害剤への薬剤耐性を開発しました。結果として、薬剤耐性、古典的な抗がん薬4の主要なハードルはまだ新たな標的治療5,6にとって大きな挑戦であります。
標的治療への抵抗は本質的なものがあります (つまり、プライマリ) または (すなわち、セカンダリ) 取得します。本質的な抵抗では、薬物治療7への応答の期間後に....
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プロトコル
注: このプロトコルは、具体的にはトラスツズマブ HER 陽性胃癌細胞株の抵抗性獲得機構の解析に調整されています。必要なすべての実験室の器械は、材料表で報告されます。
1. 対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代
注: これは、最も重要かつ異なる細胞を表わすかもしれないない別の感度にターゲットを絞った治療阻害剤独立して腫瘍 histotype や薬物濃度からという事実のために、プロトコルの手順を標準化することは困難使用されます。
- 文化 NCI N87 セル RPMI 培牛胎児血清 (10%) とグルタミン (2 mM, 1%)、37 ° C で単分子膜としての線、25 cm2培養フラスコにシードします。
- 先発の線量としてトラスツズマブの各のフラスコ 10 μ g/mL の培養液を追加します。彼らは成長を再開するまでは、先発の線量に細胞を公開します。
注: 標的治療阻害剤の先発の線量は 10 倍、血漿中のピーク濃度よりも低いはずです。血漿中のピーク濃度は、通常次の標準療法の複数用量患者血中薬物濃度の最高レベルです。この値は、薬物動態に関する研究から取得することができます。 - トリパン ブルー色素排除法と細胞の成長を監視します。(通常 2 〜 3 週間の期間) 後細胞の成長を再開すると、トラスツズマブの ....
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結果
図 1では、実験の手順のフレームワークについて説明します。HER2 とトラスツズマブ感受性の高レベルを表現する 3 胃癌細胞株 (IC50 < 薬物、図 2 a、左のグラフのピーク血漿中濃度) ターゲットを絞った治療剤を含む培養液中で育った。用量には、トラスツズマブ (10 μ G/ml) のピーク血漿中濃度は開始用量として設定され、徐々 に 400 μ g/mL 8-12 ヶ月の期間にわたって増加したより 10 倍低い。その後、IC50値トラスツズマブ (図 2 a、右のグラフ) の最高血漿中濃度より低いと安定した抵抗の表現型によって特徴付けられる 3 つのサブクローンを得た。特に、最も耐 subclone、HR NCI N87 28.57 (図 2 b) RR IC50
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ディスカッション
パーソナライズし、対象と治療法は、成長している熱意を誘発しているが、これらのいわゆる 'スマート' 療法として従来の化学療法薬、すなわち、薬物抵抗性の急速かつ予測不可能な獲得同じ主要なハードルに直面します。標的療法の結果を改善するためにそれらを引き起こすメカニズムの理解を通じて薬剤耐性問題を解決されなければなりません。ここでは、私たちは癌細胞ラインのモデルで標的治療薬抵抗性獲得のメカニズム解明のため広くアクセス可能な培養方法論を発表しました。
対象となる治療に抵抗性サブクローンの世代は最も重要で使用、細胞間と薬剤感受性の異なる程度固有の遺伝的多様性により、このプロトコルの手順を標準化することは困難です。これらの理由から、耐性のサブクローンを取得に必要な時間が異なる場合があります。抗癌剤分子への慢性露出は通常強力な腫瘍増殖抑制を発生します。ただし、可変連続薬曝露 (8-12 ヶ月) が経過すると、細胞は対照細胞と同様の率と成長を再開します。
さらに、その遺伝子発現データを遺伝子関連ターゲット療.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者の原稿を編集のため博士ベロニカ ザノーニを感謝したいです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagentは、高品質なトータルRNAを単離したり、さまざまな生体サンプルからRNA、DNA、タンパク質を同時に単離したりするための試薬です |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | iScript cDNA合成キットは、リアルタイムqPCRを用いた遺伝子発現解析用の高感度で使いやすいファーストストランドcDNA合成キットです。 |
| TaqMan 遺伝子発現アッセイ | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays は、一対の非標識 PCR プライマーと TaqMan プローブで構成されており、5' 末端に Applied Biosystems FAM または VIC 色素ラベル、3' 末端にマイナーグルーブバインダー (MGB) と非蛍光クエンチャー (NFQ) |
| M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬 | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER哺乳類タンパク質抽出試薬は、培養哺乳類細胞から高効率の全可溶性タンパク質抽出を提供するように設計されています。 |
| Halt プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) は、細胞および組織溶解物に対する完全なタンパク質サンプル保護を備えた単一の溶液の利便性を提供します。 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kitは、タンパク質標準と比較して(A562nm)総タンパク質濃度を測定するための2成分、高精度、界面活性剤対応アッセイ試薬セットです。 |
| 4x Laemmli サンプルバッファー | バイオ・ラッド | 1610747 | SDS PAGE用のサンプル調製には、4x Laemmli サンプルバッファーを使用します。サンプルの還元には、サンプルと混合する前に、2-メルカプトエタノールなどの還元剤をバッファーに添加してください。 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX プレキャストプロテインゲル | Bio-Rad | 456-1094 | 長寿命 TGX (Tris-Glycine eXtended) ゲルは、新しい配合で、標準的な変性タンパク質の分離と天然の電気泳動の両方に使用できます。 |
| Precision Plus Protein WesternC ブロッティングスタンダード | バイオ・ラッド | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained スタンダードは、デュアルカラー、オールブルー、カレイドスコープ、デュアル Xtra の各フォーマットでご利用いただけます。4つとも同じゲル移動パターンを持ち、3つの高強度リファレンスバンド(25、50、75 kD)があります。 |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS は、SDS-PAGE によるタンパク質サンプルの分離用のプレミックスランニングバッファーです。 |
| トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパック | バイオ・ラッド | 1704156 | トランスブロットターボミニPVDFトランスファーパックは、トランスブロットターボトランスファーシステムを使用してミニゲルからタンパク質を迅速かつ効率的に転写します。各真空シールされたすぐに使用できるトランスファーパックには、2つのバッファー飽和イオンリザーバースタックとプレウェットPVDFメンブレンが含まれています。 |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish ペルオキシダーゼ (HRP) コンジュゲートは、Precision Plus Protein Unstained Protein Standards または Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on Western Blots の化学発光または比色検出用です。 |
| Immun-Star WesternC solution | バイオ・ラッド | 5572 | Immun-Star WesternC ソリューションは、タンパク質検出の方法であり、フェムトグラムの中間量のタンパク質を検出します。 |
| ユニバーサルネガティブコントロール | Invitrogen | 12935300 | ネガティブコントロールsiRNAは、マウス、ラット、またはヒトの遺伝子配列と有意な配列類似性はありません。このコントロールは、細胞ベースのスクリーニングでも試験されており、細胞の増殖、生存率、または形態に有意な影響を与えないことが証明されています。 |
| Opti-MEM Glutamax Medium | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 51985026 | Opti-MEM培地は、改良されたミニマルエッセンシャル培地(MEM)で、成長速度や形態を変えることなく、ウシ胎児血清の補給を少なくとも50%削減することができます。 |
| サイレンサーセレクトプレデザイン&検証済みのsiRNA | Ambion 4390824 | RNA干渉(RNAi)は、幅広い細胞タイプのタンパク質機能を研究するための遺伝子発現を効果的にノックダウンするための最良の方法です。 | |
| リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬 | Invitrogen | 13778075 | リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬は、siRNA 導入のための高度で効率的なソリューションを提供します。一般的な細胞タイプ、幹細胞、初代細胞、従来はトランスフェクションが難しかった細胞タイプなど、さまざまな細胞株でこれほど簡単で効率的なsiRNA導入を提供できるsiRNA特異的トランスフェクション試薬は他にありません。 |
| マウス抗IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | 使用濃度: 1:400 5% 乳溶液中 |
| ヤギ抗マウス IgG-HRP: sc-2005 | サンタクルーズ | sc-2005 | 使用濃度: 1:10000 5% 乳溶液 |
| 中 PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | セリンプロテアーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ |
| Thermocycler | PTC-200サーマルサイクラーは | 、温度の均一性と最大3°Cの速度のランプを可能にします。C/秒このプロトコルは、他のサーマルサイクラーでも行うことができます | |
| リアルタイムRT-PCR装置 | Applied Biosystems | 7500 RT-PCRシステム | これは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬を使用して、比較CTアッセイタイプを使用して相対定量を提供する5色のプラットフォームです。プロトコルは、他のサーマルサイクラー |
| マイクロボリューム分光光度計 | Thermo Scientific | Nanodrop | 少量のサンプルを使用して、正確で高速な酸性核測定を提供します |
| ブロッティングシステム | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo システム | 数分でsemy-dry転送を行います |
| 画像取得システムとゲルドキュメンテーション | Bio-Rad | Chemidoc画像化学 | 発光検出に使いやすい |
参考文献
- Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
- Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
- Nelson, A. L., ....
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再版と許可
