喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

気道炎症を調べるにいくつかの方法を使用: 直接測定 (気管支生検、気管支肺胞洗浄など) と間接法 (症状評価のような血液サンプルの分析および肺機能検査)¹。直接テクニック確実に気道炎症を評価するという利点がありますが、侵襲と不可能で大規模な患者の不快感のため、リスク発生¹。間接法としては不十分な気道炎症¹の直接の評価と相関する彼ら。

喀痰コレクション気道からサンプル細胞に別の方法、気道炎症の直接の評価を可能です。それにもかかわらず、自発的に痰の生産質の悪いサンプルにつながる可能性があります、すべて患者²は不可能します。この問題は、喀痰生産²を誘発する超音波噴霧高張生理食塩水を使用してによって克服されています。このメソッドは、ニューモシスチス ・ カリニ肺炎³の診断用ひと免疫不全ウイルス (HIV) に感染した患者に使われた当初、健常者と喘息患者 1992年⁴に適応されました。喀痰誘発は等張生理食塩水⁵を使用してもより深刻な患者で可能であります。一般的に忍容されている生理食塩水の吸入は hyperresponsive 航空⁵患者の気管支けいれんを引き起こす可能性があります。したがって、手順¹の前に短時間作用の β 作動薬を管理することをお勧めします。さらに、我々 は以前超音波ネブライザーで食塩にサルブタ モールを追加することでこのリスク⁶さらに減少したことを示しています。喀痰誘発の利点は、それは非侵襲的な² 、⁵のとき適切な安全予防措置です。

喀痰サンプルの処理の 2 つの方法は文献で現在使用されて: 全体痰法とプラグの選択⁷。当研究室全体痰法が行われます。喀痰処理の主な目的は、炎症気道内腔に存在の種類を研究する差分セル数を取得することです。ただし、多くの追加解析は喀痰培養上清中⁸で仲介人を研究することによって、または喀痰細胞の詳細な調査を実行することによってさらに炎症性プロセスおよび免疫のメカニズムを調査することも (など、流れ cytometry⁹セル文化¹⁰、ゲノム¹⁰、プロテオミクス¹⁰、免疫細胞化学⁷の in situハイブリダイゼーション⁷、等)

喀痰誘発と分析の手法は、現在は技術的に困難な時間のかかる、¹訓練を受けたスタッフが必要ですのでサービス、臨床専門センターを研究に限定されます。気道の炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、慢性の咳、または特発性肺線維症¹¹のような様々 な呼吸器疾患のためこの方法で調査されるかもしれない。

このセクションで説明するすべてのメソッドは、リエージュ大学病院の倫理委員会によって承認されているし、すべての健常者が参加の書面によるインフォームド コンセントを与えた。

1. 喀痰誘発

1. 前と後の気管支拡張剤のスパイロメトリー
   1. スパイロメトリーを実行 (1 秒 [fev 社₁] の強制 expiratory ボリュームと肺活量 [FVC] 操縦) アメリカ胸部学会 (ATS) によると/欧州呼吸器学会 (ERS) 標準条件¹²。
   2. スペーサー デバイスを介してメーター用量吸入器 (MDI) から 400 μ g 吸入サルブタ モールを管理します。
      注: 大人、吸入サルブタ モールの有害事象は振戦、頻脈の¹³を含みます。
   3. スパイロメトリー (fev 社₁と FVC 操縦) 15 分後で繰り返す、ATS/ERS 基準¹²によると。
2. 超音波ネブライザーの準備
   注意: ネブライザーする必要があります徹底的に洗浄・消毒製造元の指示に従い、各使用する前に。
   1. 推奨レベルまで蒸留水でネブライザー室を埋めます。
   2. ネブライザー室にクリーン カップを置きます。
   3. 適切なふた付きカップをカバーします。
   4. 後気管支拡張剤 fev 社₁患者の高張生理食塩水 (5%) のいずれかの 50 mL のカップを埋める > 65% 予測または 50 mL の等張生理食塩水 (0.9%) 後気管支拡張剤 fev 社₁≤65% 予測患者の。
   5. カップにサルブタ モール硫酸塩溶液 (5 mg/mL) の 1.75 mL を追加します。
   6. チューブとバルブ製造元の指示に従って接続します。
3. ネブライザーと喀痰のコレクション
   注: は、医療監督の下で技術を実行します。
   1. 患者への手順を説明します。
   2. 鼻クリップを使用する患者をお願いします。
   3. 噴霧器をオンし、エアロゾルとファンの設定の最下位のレベルを選択します。
   4. 5 分の呼吸法とマウスピースを介してエアロゾルを吸入する患者をお願いします。
      注: 患者の耐性に応じてエアロゾルとファンの設定を増加可能性があります。
      1. 耐え難い咳や吐き気、場合の手順を中止し、1.3.5 の手順に進みます。
      2. 胸の圧迫感や呼吸苦、1.3.8 のステップに移動します。
   5. 噴霧器をオフにします。
   6. 鼻クリップを削除し、水で口をすすぎ、シンクにそれを破棄する前に 2 回うがい患者をお願いします。
      注: 唾液細胞が痰のサンプルを汚染して使用できなくなるサンプルに 。
   7. プラスチックの容器に痰を咳をする患者をお願いします。
   8. Fev 社₁を測定するスパイロメトリー (強制呼出) を実行します。
   9. Fev 社₁秋を次のように評価: (fev 社₁は 3.8 [mL] のステップで測定される) - (1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社₁ )/(1.3 [mL] のステップで測定後気管支拡張剤 fev 社₁ ) * 100。
      1. Fev 社₁後気管支拡張剤値から 20% 以上該当する場合は、手順を中止します。Fev 社₁再び 10 分後を測定します。Fev 社₁には、20% 以上が該当する場合は、噴霧イプラトロピウム臭化物 (0.25 mg/2 mL) を管理し、医療観察下の患者に医師を求めます。1.3.10 手順に進みます。
      2. Fev 社₁が後の気管支拡張剤の値から 20% 以上でない場合、手順 3.2 〜 3.9 1 ~ 3 回 10 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達します。
         注: 合計ネブライザー時間は痰のサンプルの量と質 (プラグまたは粘性部品の存在) になります。サンプルの質や量が悪い場合ネブライザーの 10 分後、手順を拡張して、15 〜 20 分の合計ネブライザー時間に到達する必要があります。
   10. 冷蔵処理まで痰のサンプルを保ちます。

2. 喀痰処理

注: 最適な細胞生存率のサンプリングの 3 時間以内、喀痰を処理します。

注意: は、白衣、防護手袋、ゴーグルを着用します。

1. 予備の準備
   1. 滅菌蒸留水 10 mL を製造元の指示に従って、6.5 ミリメートルのソリューションを取得する集中ジチオトレイトール ソリューション (粘液溶解剤) の 10 倍希釈を行います。
      注: 集中ジチオトレイトール ソリューション周囲の空気との混合を防ぐために、ソリューションから撤退バイアル滅菌注射器と針で。開いたら、濃縮液バイアルを室温で保管し、5 日以内に使用する必要があります。希釈した溶液を毎日用意しています。
      注意: 目や皮膚の炎症の危険性のため保護具 (衣類、手袋とゴーグル) を着用します。
   2. ダルベッコ Phosphate-Buffered 生理食塩水 (DPBS) 0.08% 解を得るためトリパン ブルー溶液 (0.4%) の割増希釈を行います。この希釈液を室温で維持し、2 週間以内に使用します。
      注意: 発癌性の危険のため保護具 (衣類、手袋、ゴーグル) を着用します。
2. 喀痰培養上清のコレクション
   1. 50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブで全体の喀痰を転送し、サンプルの重量を量る。
   2. DPBS ソリューションの 3 倍の重量を追加します。
   3. ゆっくりと渦 30 サンプル s。
   4. 遠心 800 x g、4 ° C で 10 分間します。
   5. 滅菌ガーゼの 2 層を通して試料をフィルター処理し、50 mL コニカル下部のプラスチック製のチューブに上清を収集します。
   6. 分注 2 mL プラスチックの上澄みチューブ、-80 ° C で保存
      注: 清サンプル、喀痰流体相コンポーネントを試金するために役立ちます。
3. 喀痰孟
   1. 必要に応じて、細胞懸濁液 5 mL の容量に到達する細胞ペレットに DPBS を追加します。
   2. 6.5 mM ジチオトレイトールが 1 つのボリュームに細胞懸濁液を希釈します。ベンチ ロッカーを使用して、室温で 20 分間細胞懸濁液をロックします。
      1. DPBS と少なくとも 3 回を繰り返します。
   3. 550 x g と 10 分のための 4 ° C で希釈した細胞懸濁液を遠心します。

検定
典型的なイメージは、検定を用いた顕微鏡で可視化した図 1に示すように。扁平上皮細胞は識別簡単に彼らが非扁平上皮細胞よりもはるかに大きい。これらの扁平上皮細胞、上皮細胞、口の中から来る。両方の種類の細胞はトリパン青死んだとき汚れます。酵母、細菌、およびスクラップをカウントを避けるために注意する必要があります。

図 1: 死んで非扁平上皮細胞と、(C)、扁平上皮細胞 (A) 生活非扁平上皮細胞、(B) を示す検定画像。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Cytospin スライド: 喀痰処理後に得られる cytospin スライドの代表イメージを図 2に示します。形態と色によって、異なる種類の細胞 (好中球、好酸球、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞) を区別できます。いくつかのケースで扁平上皮細胞による汚染は重要な可能性があり、扁平上皮細胞の割合が 80% を超える場合、サンプルは失敗した (図 3)。

図 2:好中球、マクロファージ、好酸球、(C) (D)、リンパ球 (B) (A) を示す Cytospin スライド画像と上皮細胞 (E)。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:質の悪い cytospin スライドの例 > 扁平上皮細胞の 80%。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

成功率
当科で (成功した誘導と読める cytospin を組み合わせた) プロシージャの成功率 1,129 患者 (健常者、喘息または COPD 患者) のサンプルに基づく、82% (924/1,129) です。患者のタイプによるとサブ解析で成功率は 75% (57/76) 健常者で、82% (827/1,004) 喘息、COPD 患者の 82% (40/49)。

健常者の結果
当科の中央 (四分位範囲) から 289 健常者のシリーズのレトロスペクティブ分析で 3.72 g (四分位幅 2.46 g-5.54 g) であり、喀痰の中央値の合計非扁平上皮細胞数/g が x 106 (0.59 喀痰重量0.37 x 10 の四分位範囲6 - 1.29 × 106)。

、それらの健常者に扁平上皮細胞の比率は 19% (10%-34%) と低水準と生存率は 66% (54 78%) に高い。異なった細胞のタイプの割合に関する結果は、図 4 aにまとめたものです。マクロファージ (49% [31-68%]) の比率中リンパ球 (2% [1-3]) の割合 (34% [14%-60%])、好中球の割合よりも高くなって、好酸球 (0% [0% 0%]) と上皮細胞 (4% [2 11%]) が低いことがわかります。これらの結果は、データを絶対値 (図 4 b) で表現した場合に似ています。

図 4:健常者にみられる差動細胞数の代表の結果は絶対値をパーセンテージ (A) または (B) で表されます。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

また、患者の年齢を考慮することが重要です。確かに、強い相関が痰のサンプル (図 5) 患者さんの年齢と好中球の割合の間に存在。同様に、10 年間の年齢別グループ (図 6) によると患者を分類するとき増加する年齢と好中球の割合が大幅に増加を見ました。したがって、別のコホート研究の結果を比較するときにこの変数を考慮する必要があり、主題の一致に注意する必要があります。

図 5:年齢および喀痰中の好中球の割合の相関。相関関係を求めたスピアマン テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6:年齢カテゴリによると好中球比率の進化します。分散分析の p 値は < 0.0001 好中球の割合年齢クラス間の比較のため。複数の比較は、ダンの多重比較検定で作られました。P 値は次のように表されます: * p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < 0.001。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

呼吸器疾患を患っている患者の結果
誘発喀痰検査法のテクニックは、気管支喘息患者における炎症細胞プロファイルを評価するために使用されます。この手法は、別の炎症性呼吸器疾患、COPD を患っている患者にも適用可能性があります。健常者、喘息、COPD 患者 (年齢、性別、およびタバコの習慣の一致する 3 つのグループ) を比較すると、炎症性細胞プロファイルは全然違うこれらのコホート (図 7) を観測しました。確かに、気管支喘息患者通常によって特徴付けられる上げられた喀痰中好酸球、喀痰中好中球の割合は、健常者に比べて COPD 患者で通常より高い疾患重症度に結びついています。

図 7:健常者の喀痰炎症細胞プロファイル (n = 45)、気管支喘息患者 (n = 108)、および COPD 患者 (n = 54).3 つのグループは、性別、年齢、タバコの習慣に一致しました。ANOVA の p 値が < 0.05、<、0.0001 と < 0.0001 好中球、好酸球、マクロファージ、グループ間の比較のためそれぞれ。複数の比較は、ダンの多重比較検定で作られました。P 値は次のように表されます: * p < 0.05 と * * * p < 0.001。結果は、中央 (四分位幅) として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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