ここで、ラットの 3 D の文化のためのプロトコル脳由来グリア細胞、アストロ サイト、ミクログリア、オリゴデンドロ サイトなどを紹介します。一次電池文化、ならびにヒアルロン酸 (浜) ハイドロゲル合成、HAMAphoto 重合と細胞のカプセル化、共焦点走査型電子顕微鏡画像処理サンプルを紹介しています。
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方法論記事
プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善
この記事について
サマリー
要約
同様にイオン注入装置や生体が同じ結果に関数の結果を高めるように設計されて中枢神経系、多数の急性障害と神経変性疾患、: 細胞毒性、神経膠症につながる過剰な炎症および/または総称して怪我を悪化させるまたは健康回復を防ぐグリア瘢痕の形成。初代培養グリア細胞を収容可能 3 D 細胞培養足場を生成、グリア瘢痕形成と研究炎症性プロセスをモデル化するシステムの作成の意図で: ミクログリア異物反応を調節する、開始、炎症性イベント、線維性瘢痕の形成に対応するアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト通常炎症性傷害を受けやすい。現在の仕事では、脳グリア細胞作製、カルチャ、およびカプセル化されたラットとヒアルロン酸ベースの 3 D ハイドロゲル足場の微視的構造の評価のための詳細なステップバイ ステップのメソッドを提供します。生理活性基板と足場を変更する能力だけでなく、電池封止材と共焦点の蛍光および走査電顕によるハイドロゲル足場のキャラクタリゼーションのためのプロトコルの実証、さらに、改良されたセル統合商業基底膜の混合物の設立。
概要
中枢神経系 (CNS) の炎症は急性の認刻極印を長く考慮された (例えば、虚血性脳卒中、脳外傷、脊髄損傷) および慢性 (例えばアルツハイマー病、パーキンソン病のおよびハンティントンの病気) 中枢神経損傷しかし、ますます、神経変性疾患や神経疾患に因果共同作成者として認識されます。持続的なまたは不適切な炎症神経損傷や髄 (例えば多発性硬化症) が発生し、脳の発達 (例えば、統合失調症、自閉症) と (例えばうつ病、不安の気分状態に悪影響を及ぼす、双極性障害)。さらに、植込み型デバイスを用いた新しい治療戦略 (e.g、脳-コンピューターのインターフェイス1,2,3, 脳深部刺激4,5, 脊柱。微小6,7,8,9,10<....
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プロトコル
1 日目スプレイグ ドーリー仔、斬罪に、安楽死から脳組織抽出のためのプロトコルは、動物愛護とアルバータ大学利用委員会によって承認されました。
1. ミクログリアやアストロ サイト分離67,68
メモ: 分離および細胞培養のためのすべてのメディアは水浴中で 37 ° C に予熱します。ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) が 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS)。すべてダルベッコ修飾、栄養混合物 (DMEM/F12) は 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 補われるハムの f12 キーでワシのメディアです。トリプシンと唯一の混合物は、政府短期証券を欠いています。このプロトコルのすべての材料、滅菌 (フィルター、アルコール、購入、およびオートクレーブ) とバイオ セーフティ キャビネットの無菌技術におけるステップ数 1.8 以降のすべてのステップが実行されます。
- 脳あたり 15 mL 12.5 mL DMEM/f12 キー 50 mL コニカル遠沈管、37 ° C と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 15 mL コニカル遠心管中で 0.25% トリプシンの約 2 mL の HBSS 予熱します。DMEM/f12 キーの追....
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結果
神経組織のホスト応答と高スループットのグリア瘢痕をモデル化するには、 in vitroシステムはマトリックス材料は生体親和性、その場形成、細胞傷害性のイベントを発生させないとを変更すると 3 D の細胞の足場を必要とします。優しい対応を導くための生理活性成分。このため、ヒアルロン酸に基づく 3 D の細胞の足場システムを作成し、細胞間相互作用とグリア bioreactivity を検討する主な混合グリア細胞人口をカプセル化します。細胞と足場の簡単な視覚的検討がなされました。オリゴデンドロ サイト (緑の CNPase) を含む細胞の亜集団の形態ミクログリア (赤で Iba1)、共焦点蛍光顕微鏡観察 (図 3Ai-ii-Ci ii) によるアストロ サイト (黄色で GFAP) が表示されます。複合足場と細胞形態に SEM (図 3Aiii-iv - Ciii iv
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ディスカッション
モデル グリア bioreactivity 3次元培養システムおよびグリア瘢痕のプロセスを生成する目標に向かって一次培養ミクログリア、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトをサポートし、により、電池の堅牢な評価システムを開発しました。形態と細胞間の相互作用。示されている顕微鏡写真から各セル型の形態が 2 D、3 D 浜および 3 D 浜基底板混合プラットフォームと異なる。2 D システムの形態がはっきりと表面の平面に沿って一方に片寄ったが 3 D の浜に比較すると、ミクログリアやアストロ サイト オリゴデンドロ サイトのクラスターを除いて、行列の内部は一般的に小さかった。走査電子顕微鏡像の詳細は、浜に丸形概ねセル。これは主に歩行し、自由な動きとプロセスの成長の行列を変更する限られた容量でカプセル化された細胞のためにかもしれません。細胞伸長、浜にはアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト通常ラジアルだったこれら細胞の拡張のプロセス、組織マトリックスおよび他の細胞と対話する能力を通して彼らの動きが限られていたことを示唆します。さらに、前作は、相互接続ネットワー キング、この伸長65.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、金融サポート レベル、CFI、AIHS、アルバータ州健康サービス、および脳研究のため Davey 基金から感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>1.HAMA合成および光重合のための材料 | |||
| ヒアルロン酸(HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi、MW:1.5 - 1.8 X 10 ^ 6 |
| 水メタクリル(MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| 水酸化ナトリウム(NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| エタノール(EtOH) | 商業アルコール株式 会社。 | 無水 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)錠剤 | ッシャーサイエンティフィック | 18912014 | |
| トリエタノールアミン(TEA) | シグマアルドリッチ | 90279-100ML | |
| 1-ビニル-2ピロリジノン(NVP) | シグマアルドリッチ | V3409-5G | |
| エオシンY(EY) | シグマアルドリッチ | E6003-25G | |
| ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184シリコーンエラストマーキット | ダウ コーニング | ||
| 3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| ビーカー (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| ビーカー (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH 紙 (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| 名前 | Company | カタログ番号 | Comments |
| 2.グリア細胞の単離と細胞培養のための材料 | |||
| P1-2 Sprague Dawleyラットの子犬 | Charles River | CD Sprague Dawleyラット株コード001 | |
| Dissectorはさみ - スリムブレード(小) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| 手術用ハサミ - Toughcut(大) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| 細かい鉗子(Dumont #5) | ファインサイエンスツール | 11521-10 | |
| 湾曲した細い鉗子 (デュモン #7) | ファインサイエンスツール | 11271-30 | |
| ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) | ギブコ | 14170-112 | |
| ダルベッコの改変イーグルの培地とハムの栄養混合物 F-12 (DMEM/F12) | ギブコ | 11320-033 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) | ギブコ | 15140-122 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| ポリ-L-リジン (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL コニカル遠心チューブ | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL コニカル遠心チューブ | サイエンティフィック | 05-539-5 | |
| 12ウェル 組織培養処理プレート (セルスター) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL 血清ピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-676-10F | |
| 25 mL セロジカルピペット | フィッシャーサイエンティフィ | 12-676-10K | |
| ペトリ皿 (60 mm X 15 mm) | フィッシャーサイエンティフィ | FB0875713A | |
| ペトリ皿 (100 mm X 15 mm) | フィッシャーサイエンティフィック | FB0875712 | |
| 顕微鏡カバースリップ(18 mm) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-100 18CIR | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | strongコメント |
| 3。顕微鏡用材料(共焦点顕微鏡・走査型電子顕微鏡) | |||
| マウスモノクローナル抗CNPase | abcam | ab6319 | |
| ウサギ抗Iba1 | 和光実験化学 | 019-17741 | |
| ニワトリ抗GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| フルオロマウント-G | フィッシャーサイエンティフィック | 00-4958-02 | |
| ホルマリン | シグマ アルドリッチ | HT501128-4L | 緩衝型 (10%) |
| トリトン X-100 | フィッシャーサイエンティフィック | BP151-500 | |
| 馬血清 | ギブコ | 16050-122 | |
| パラホルムアルデヒド | エレクトン顕微鏡科学 | 157-8 | 緩衝型 (8%) |
| グテラアルデヒド | Electon Microscopy Sciences | 16019 | 緩衝型 (8%) |
| 四酸化オスミウム | Electon Microscopy Sciences | 19152 | 緩衝型 (2%) |
| ヘキサメチルジラザン (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| エタノール (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | 無水 |
| 顕微鏡スライド (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
参考文献
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998....
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