方法論記事

骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定

DOI：

10.3791/56616

⸱

2018年3月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, 2Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, 3Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, 4Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨形態形成タンパク質 2 (BMP2) をドープした生体材料は非組合骨折を癒すために新しい治療戦略として使用されています。因子の手に負えないリリースから生じる副作用を克服するためにサイトに新しい戦略を提案する-従って骨機能の向上と材料を作成する要因を直接固定します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒーリング以外の長い骨欠損の治療のための別の治療戦略を集中的に検討しました。骨形成タンパク質 (Bmp) などの骨の成長因子との組み合わせで生体材料の利用につながっているいくつかの制限の現在の処置は現在使用。一般的な吸収またはカプセル化方法には、通常いくつかの深刻な副作用を誘発するいわゆる初期バースト リリース効果に終って BMP2 のスープラ生理量が必要。これらの問題を克服するための可能な戦略は、共有結合タンパク質を足場にカップルことでしょう。さらに、再現性のある製品の結果を保証するために、サイト固有の方法で結合を実行必要があります。したがって、我々 はコドン利用拡大 (BMP2 K3Plk) によって BMP2 タンパク質の成熟した部分に人工アミノ酸 (プロパルギル L-リジン) は導入された BMP2 バリアントを作成しました。BMP2 K3Plk 銅触媒アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を通して官能ビーズに結合されていました。体外結合 BMP2 K3Plk の生物学的活性が証明され、BMP2 K3Plk 修飾ビーズ貪食は、セルベースのアッセイで証明されました。C2C12 細胞と接触して機能性ビーズがビーズ ローカル制限近接でアルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) 発現を促すことができます。本手法での機能性足場を作り出すことがこのように、骨系統への分化をトリガーすることができます。さらに、BMP2 の低用量で結合 BMP2 のサイト向けの配向を制御のために十分です。この方法では、Bmp は要因がサイト指示されたカップリング技術を介して結合されている場合、そうではない適切な向きで細胞表面上の受容体に常に公開されます。製品の結果が非常に制御可能なしたがって、重要なサイズの修理のための適用性を向上、均質な特性を持つ素材の結果骨の欠陥。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨の組織工学・骨再生の究極の目標は、短所と非組合骨折の一般的な治療法の中に発生する制限を克服することです。自動または同種移植は、いくつかの欠点をもっていても現在の治療戦略として主に使用されます。理想的な骨移植が骨延長術における骨、骨移植片の osteointegration につながると同様、新鮮を誘発します。今日では、のみ自動移植は、理想的な骨移植のすべての特徴を提供するので、「ゴールド スタンダード」と見なされます。残念ながら、それはまた、長い手術時間や通常 (例えば、慢性的な痛み、血腫形成、感染症、化粧品の欠陥、等) の多くの合併症を伴う第 2 外傷サイトなど、重要な負の側面を提示します。同種移植は、一方、すべての一般的な側面1の準の特徴であります。代替骨移植技術は、骨、骨伝導、生体親和性と生体吸収性足場を生産する目的で、ここ数年で改善されています。以来、多くの生体材料はすべてのこれらの骨の特性を示さない、BMP2 と BMP7 は、主にさまざまな成長要因は特定足場2の骨の可能性を改善するためにされています。

必須条件としてこのような成長因子の配信システムは、細胞の動員と添付ファイル、セル成長および血管新生のような重要なイベントを促進するために時間をかけて量を制御リリースを提供する必要があります。ただし、bmp 形式だけでなく、他の骨の成長因子がされている一般的固定非共有結合3。わなに掛ける事と吸着技術の深刻な欠点生体内で骨増殖を誘導することによって周囲の組織に影響を与える一般的につながる初期バースト リリースによる蛋白質の超生理量の使用が必要炎症や腫れ、融解4。したがって、時間の長い期間のための配信サイトで成長因子の保持を共有結合固定化方法で実現できます。BMP2 を化学的に変更 (サクシニル化5、アセチル化6またはビオチン化7) 設計する8、または BMP2 派生オリゴペプチド9を設計されているし、限界を克服するために関連するには吸収。ただし、配置可能性がある細胞の受容体に固定化リガンドの結合を阻害するので、これらの構成体の生物活性は予測できません。前に示したとして活性リガンド-受容体複合体の形成に関与するすべての 4 受容体鎖が完全にすべての下流のシグナル伝達カスケード10をアクティブにするために固定化 BMP2 と対話が不可欠です。

生物活性、安定性、および固定化因子の生体利用率の点で限界の不均質製品結果の問題を克服するためには、共有サイト指示された方法で足場をバインドできる BMP バリアントを設計されています。このバリアントは、BMP2-K3Plk と呼ばれるには、遺伝子コドン拡張11によって導入された人工アミノ酸が装備されています。このバリアントは、その生物学的活性を維持しながら共有結合の結合戦略を使用して足場に正常にリンクされています。

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プロトコル

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1. BMP2 のバリアントの BMP2 K3Plk の生産

  1. クローニングの BMP2-K3Plk PCR を使用してサイト指示された突然変異誘発によって12
    1. 人間の成熟した BMP2 を増幅 (hmBMP2) p25N hmBMP2 ベクトルから (材料の表を参照してください) 前方のプライマー (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) で逆プライマー (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 導入、黄色停止コドン (タグ) BMP2´s 成熟した部分の最初のリジンの位置にあります。前方のプライマー (10 pmol/μ L)、逆プライマー (10 pmol/μ L)、p25N hmBMP2 (10 ng/μ L) の 1 μ L の 1.5 μ L の 1.5 μ、10 μ M dNTP 原液 1.5 μ 33.5 μ L H2O、10 μ L の PCR 反応混合物の PCR の反作用を実行します。、、1 μ L の DNA ポリメラーゼ (材料表参照) サーマルサイクラー (変性 95 ° C、5 分で 1 分、1 分、72 ° c 1 分、伸長、72 ° C 10 分で最後の拡張のための 60 ° C で熱処理の 95 ° C で変性の 30 サイクル) で。
    2. 製造元の推奨事項に従う、市販のキットを使用して PCR の製品の浄化 (材料の表を参照してください)。
    3. H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 45 分の 37 ° C で制限の酵素 NdeI と PCR の製品を消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分ダイジェスト 37 ° C H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 1 時間で制限の酵素病原と PCR の製品のために 65 ° C で酵素を熱不活性 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-5 分で 80 ° C で酵素を不活性化します。
    4. H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA の使用時間は 2 時間 45 分の 37 ° C で NdeI と pET11a pyrtRNA のベクトルを消化 (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。熱-不活性化 65 ° c 5 分ダイジェスト 1 h H2O、3 μ L 消化バッファーの 16 μ、10 μ L の DNA を使用して 37 ° C で病原と pET11a pyrtRNA のベクトルの (20 ng/μ L)、および制限酵素の 1 μ L。5 分で 80 ° C で熱不活化します。
    5. 未消化のベクトルから消化のベクトルを分離し、(0.8% アガロース、100 V で 60 分間) の電気泳動のゲルの agarose によって消化の残党。100 を使用して 2 時間 (RT) 室温で消化 pET11a pyrtRNA バックボーンを持つ消化 BMP2 K3TAG 挿入を縛る pET11a pyrtRNA バックボーンと 34.5 の ng BMP2 K3TAG 挿入 (モル比 1:3) の ng。反応混合物は、DNA のバックボーンと挿入、リガーゼ バッファー 2 μ、1 μ L の DNA リガーゼと H2O 20 μ L の総ボリュームに含まれます。
    6. BL21(DE3) 細菌 pSRF デュエット pyrtRNAsynth ・ pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 共同変換を実行します。
      1. 50 を追加、微生物のそれぞれのプラスミッドの ng は氷の 30 分間、50 の 42 ° C で熱ショックに混合物を配置 s、5 分間氷の上置いて、混合物で 500 μ L のホストゲノム スープ (LB) 培地を追加、60 分 300 rpm で振る。
      2. 予め温めておいたカナマイシン (50 μ g/mL) に細菌の混合物の 100 μ L を広める/アンピシリン (100 μ g/mL) プレートと 37 ° C で一晩インキュベート
  2. BMP2 K3Plk の発現と精製13,14
    1. カナマイシンの 50 μ g/mL と 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の LB 培地 50 mL で一晩単一コロニーを伝達します。
    2. 素晴らしいスープ (TB) 培 50 μ G/ml のカナマイシン、アンピシリン、100 μ g/mL と 800 mL に一晩文化 1:20 を希釈し、0.7 の OD600に到達するまで、37 ° C で成長します。10 mM の最終的な集中にプロパルギル L-リジンを追加します。イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (誘導) 前に文化から 100 μ L のサンプルを収集します。
    3. 最終濃度 1 mM の IPTG の添加により遺伝子の発現を誘導します。180 rpm で軌道シェーカーの 16 h の 37 ° C で文化を育てます。文化から 100 μ L のサンプルを収集します。
    4. 遠心分離機の 9000 x g で 30 分間破棄で全体の文化の上澄みと 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加) と TBSE バッファー (トリス、150 mM の NaCl、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 10 mM) の 30 mL の細菌のペレットを再懸濁します。
      注意: ハンドル 2-メルカプトエタノール ヒューム フードの下で。皮膚および眼との接触を避けます。蒸気やミストの吸入を避けます。ヒューム フードの下 2-メルカプトエタノールを含むバッファーをすべての再懸濁の手順を実行します。
    5. 空遠心ビーカーの重さし、空のビーカーにペレットを再懸濁を転送します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットとビーカーの重量を量る。ペレットの重量を計算する空のビーカーの重さを引きます。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。短期的に-20 ° c または長期的には-80 ° C でペレットを凍結します。プロトコルを再開する時に解凍室温ペレット
    6. STE バッファー (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM 塩化ナトリウム; 1 mM EDTA、375 mM ショ糖 1: 1000 (v/v) 2-メルカプトエタノール (たて追加)) にペレットを再懸濁します。ペレットのすべての 10 g を 200 mL の STE バッファーを使用します。
    7. 氷 (10 分 40 秒パルス、20 s ブレーキ 30% 振幅) の懸濁液を超音波照射します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。超音波処理、遠心分離手順を 4 回繰り返します。
    8. TBS バッファー (10 mM トリス、150 mM の NaCl) 100 mL にペレットを再懸濁します。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
    9. 新しく追加された 80 U/mL のヌクレアーゼ (例えばBenzonase) とヌクレアーゼ バッファー (100 mM トリス、1 mM EDTA、3 mM MgCl2) にペレットを再懸濁します 10 mL/g のペレットを使用しています。一晩攪拌板 (30 rpm) で RT の懸濁液を孵化させなさい。
    10. トリトンのバッファーを追加 (60 ミリメートルの EDTA、1.5 M の NaCl、6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) フェニル - ポリエチレング リコール) 懸濁液を。追加するトリトン バッファーのボリュームは、懸濁液の 0.5 のボリューム部分に対応しています。RT (攪拌なし) で 10 分間インキュベートします。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
    11. TE バッファー (100 mM トリス、20 ミリメートルの EDTA) でペレットを再懸濁します 8 mL/g のペレットを使用しています。6,360 x g で 20 分間破棄上澄みで遠心し、ペレットの重量を量る。
    12. 25 mM NaAc pH 5.0 の 4 mL/g と 1 mM ジチオトレイトール (DTT) (たて追加) と 6 M GuCl の 5 mL/g を追加することでペレットを再懸濁します。4 ° C で攪拌板 (30 rpm) で一晩懸濁液を孵化させなさい。
    13. 20 分間 75,500 × g で遠心分離機します。上清には、単量体 BMP2 胞が含まれています。上澄みと集中、集中 3 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた 20 OD/mL にこの抽出細胞 (材料の表を参照) を収集します。
    14. (30 rpm) を攪拌しながら、濃縮モノマーを単一液滴の下のバッファー (2 M LiCl、トリス、50 mM 25 mM チャップス、5 ミリメートルの EDTA、1 mM のグルタチオンの二硫化物 (GSSG) 2 mM グルタチオン (GSH)) に追加します。暗闇の中で 120 h 室温で孵化させなさい。
      注: この潜伏期間中に、ぜんぶを巻き戻し。この手順以降からソリューションには、折り畳まれた二量体の BMP2 K3Plk が含まれています。
    15. 集光セル 10 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 膜を用いた透析解決集中された塩酸 Dialyze 1 mM 塩酸集中に対してソリューションを使用して 3.0 に溶液の pH を調整します。
    16. バッファー (20 mM NaAc、30% イソプロパノール) を追加することによってソリューションを平衡します。ソリューションの 30% のボリュームに対応するバッファー A のボリュームを追加します。15 分間 4700 × g で遠心分離機します。
    17. タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム15 150 mL のバッファー A. 負荷平衡する列にタンパク質溶液をイオン交換コラムを平衡させ。バッファー B (20 mM NaAc、30% イソプロパノール、2 M の NaCl) の線形グラデーションを使用して分数を溶出バッファー * 収集 2 mL 分画の 100 mL を使用しています。
      注: は、合計列ボリュームに従って列にロードする前にタンパク質を集中します。最終的なタンパク質の量をする必要があります < 合計列ボリュームの 5%。
    18. SDS ポリアクリルアミドのゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) 16と Coomassie ブリリアント ブルー染色17 (材料の表を参照) によって各画分の 20 μ L を分析します。
      注: Coomassie ブリリアント ブルー染色 SDS ページのゲル番組分数ダイマー (26 kDa) とモノマー (13 kDa) を含有する画分を含みます。
    19. 二量体を含む画分をプールします。一晩で 1 mM 塩酸 (5 リットルの容量) に対して 4 ° C 分数を含むダイマーのプールを dialyze します。遠心ろ過ユニットを集中 10 kDa を使用して最終製品を集中 (材料の表を参照してください)。(12%) SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) と Coomassie ブリリアント ブルー染色により最終製品を分析します。
      注: Coomassie ブリリアント ブルーのバンド染色 SDS ページのゲル 26 kDa で 1 つだけのバンドが表示されます。最終 BMP2 K3Plk 製品です。

2. 銅 (I) の最適化-アルキン-アジ化環化付加反応 (CuAAC) 条件を触媒

  1. 及ぼすアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) および銅の (II) 硫酸塩 (CuSO 4 )野生型 BMP2 の (BMP2 WT)
    1. 20 μ M をインキュベート CuSO4NaAsc の縦横比の異なる BMP2 WT。50 μ L のボリュームで 0.5 mM NaAsc と 0.5 mM CuSO4 (開始濃度) を使用します。CuSO4NaAsc の次の比率を続行: (1:1)、(1.7:1)、(10:1)、(20:1)、0.5 mm CuSO4濃度を一定に保つことと NaAsc の濃度を適宜調整すること。一晩室温 H2O 回転ミキサー (20 rpm) 上の反応を実行します。
    2. 5 %2-メルカプトエタノールを含む読み込みバッファーを追加することによって縮小サンプルを準備し、6 分分析が減少し、SDS ポリアクリルアミドによる試料の非減少ゲル (12%) の電気泳動 (SDS-PAGE) および Coomassie ブリリアント ブルー染色の 95 ° C でサンプルをインキュベートします。SDS ページのゲルを染色 Coomasie 26 kDa と高分子量 (非還元条件) 13 kDa (減らされた条件) の範囲にバンドを示します。
  2. 効果 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 反応アミン (THPTA)
    1. 20 μ M をインキュベート CuSO4THPTA の縦横比の異なる BMP2 K3Plk。5 mM NaAsc、および 200 μ M 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin (NaAsc と 3 アジドフェニル-7 hydroxycoumarin を一定に保つ) を使用します。濃度を開始として 50 μ M THPTA と CuSO4の 0.5 mM を使用します。CuSO4THPTA の異なる比率を使用: (7:1);(10:1);(12:1);(15:1);(20:1). 回転ミキサー (20 rpm) に常温 24 h の H2O の反応 (容量 50 μ L) を実行します。
    2. カップリング、時に 3-アジドフェニル-7-hydroxycoumarin 蛍光色素になります。削減と非還元条件下でサンプルを準備し、SDS ページによってそれらを分析します。3 アジドフェニル 7 hydroxycoumarin の特定の波長で励起チャンネルの下でゲルを視覚化 (λabs = 404 nm; λem = 477 nm)。

3. 共有カップリング法アジに BMP2 K3Plk 修飾アガロース ビーズ

  1. 20 μ L の反応バッファー (0.1 M HEPES pH 7.0、3.9 M 尿素 50 μ M CuSO4, 250 μ M THPTA、5 mM アスコルビン酸ナトリウム) で 500 μ L の総ボリュームでアジ化アクティブ アガロース ビーズと BMP2 K3Plk または BMP2 WT (ネガティブ コントロールとして使用) の 20 μ M をインキュベート、rotati の RT で 2 hng ミキサー (20 rpm)。5 mM EDTA (最終濃度) の追加によって反作用を停止します。
  2. 回転ミキサー (20 rpm) で 15 分間室温でインキュベートします。遠心分離機のルート収集で 1 分の 20,000 × g でサンプル培養上清。
  3. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 1,000 μ L で 4 M MgCl2、1,000 μ L で、2 回 3 回 3 回 HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 1,000 μ L でビーズを含むペレットを洗浄します。すべての洗濯の段階で RT で 1 分の 20,000 × g で遠心分離し、培養上清を収集します。4 ° C で 1,000 μ L の PBS で結合ビーズを格納します。
    注意: は、上清を除去しながらビーズ ペレットを不可します。

4. 存在と固定化 BMP2 K3Plk を使用してテキサス赤の生物学的活性を検証するというラベルの付いた BMP 受容体私の外部ドメイン (BMPR IA EC )

  1. インキュベート 50 μ L BMP2 K3Plk 修飾ビーズのテキサス赤の 1 μ m というラベルの付いた BMPR IAEC HBS500バッファー (50 mM HEPES、500 mM の NaCl) の 150 μ L で RT で、回転ミキサー (20 rpm) で 1 時間。
  2. 破棄した上清で 1 分の 20,000 × g でビーズを遠心します。HBS500バッファーの 1000 μ L でビーズを洗浄します。追加の洗浄のステップを 3 回繰り返します。20,000 × g で遠心するそれぞれの後 RT で 1 分間洗浄のステップ。
  3. 500 μ L の PBS のビードを再停止しなさい、カバー スライド ガラス上の 50 μ L をピペットします。561 または 594 nm 間顕微鏡のフィルターを設定します。テキサス赤-BMPR-IAECを検出-BMP2-K3Plk 修飾ビーズ蛍光顕微鏡と画像を使用します。

5. アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) の測定前に BMP2 K3Plk を生産とのカップリング反応の後の体外活性を証明する表現。

  1. アルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) アッセイ
    1. Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.
    2. 3 × 104細胞/ウェルの 96 ウェル マイクロ プレートへの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、0.5-200 の存在下で C2C12 細胞をインキュベート 100 μ L/ウェル DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) の 37 ° c 5% CO2 72 h で加湿雰囲気で BMP2 WT の BMP2 K3Plk nM。
    3. 培地を取り除き、pbs 100 μ L/ウェルの細胞を洗浄します。換散バッファーの 100 μ L/ウェルで 1 h の RT で細胞を溶解 (1 NP 40%、0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) の水平振動板 (220 rpm)。
    4. 細胞ライセートに 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (たて追加) を 100 μ L/ウェル ALP バッファー (0.1 M のグリシン、pH 9.6、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2) を追加します。
    5. 405 で吸収を測定色の開発が完了するまで ALP バッファー、および 5 分ごとの追加後マルチ プレート リーダーで nm。用量応答曲線とロジスティック モデルを用いた EC50 値生成 y = A2 + (1-2)/(1 + (x/0x)p)。
  2. アルカリホスファターゼ (ALP) の汚損
    1. Promyoblastic C2C12 細胞 (ATCC CRL-172) でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児の子牛血清 (FCS)、100 U/mL ペニシリン G 37 ° c で 5% CO2加湿雰囲気で 100 μ g/mL ストレプトマイシンとの文化.
    2. まあ 96 ウェル マイクロ プレートで/3 × 104セルの密度で C2C12 細胞を播きます。セルの一晩を添付しましょう。培地を取り除き、BMP2 K3Plk 結合ビーズの 20 μ L/ウェルを追加します。BMP2 K3Plk 結合ビーズは、PBS の懸濁液の 1000 μ L。
    3. DMEM で 0.4% 低融点アガロース溶液を準備します。電子レンジ (600 W 3 分間) で溶かすし、冷まします 37 ° c の水浴中に使用されるまで。
    4. 各ウェル (カバー ビーズと細胞) に 0.4% 低融点アガロースの 20 μ L を追加します。2000 x g で 20 ° C で 5 分間遠心80 μ l 添加 DMEM (2% の FCS、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL ストレプトマイシン) し, 72 時間の 5% CO2で加湿雰囲気で 37 ° C で。
    5. 凝固の 0.4% の agarose が外れないように注意しながら、中を削除します。ステップ 1 NBT の 100 μ L/ウェルを追加/BCIP (ニトロ ブルー テトラゾリウム塩、5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-トルイジン塩) 基板の解決。
    6. アルカリホスファターゼ染色直後に明らかになる紫染色顕微鏡を使用して分析します。明視野顕微鏡を使用し、写真を撮る。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では官能基化市販アジ アガロース ビーズ (図 1) に共有 BMP2 変種は、BMP2-K3Plk 手法について述べる。作り出された BMP2 K3Plk バリアントの生理活性は、C2C12 細胞におけるアルカリホスファターゼ (ALP) 遺伝子発現の誘導によって検証されました。生体外でテストは野生型 BMP2 による同様の ALP 発現レベルを示しています (BMP2 WT) と BMP2 K3Plk (図 2)。

銅の (II) 硫酸塩 (CuSO4) とアスコルビン酸ナトリウム (NaAsc) の酸化還元反応では、構造の整合性に影響を与える可能性があります、したがって BMP2 K3Plk の生理活性に影響を与える活性酸素種を生成します。CuSO4と NaA...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子コドンの展開によってタグの蛋白質の変形が主主蛋白質シーケンスの任意の位置でさまざまな非天然アミノ酸類似の導入。BMP2 のような Bmp の場合一般的なタグのような (彼の) 6 ヒスチジンの札はできるだけ protein´s C ターミナル端タンパク質立体構造の中に埋もれた、こうして外からアクセスできないので N 末期に導入されました。他のポジションで導入されたタグのサイズは非常に高いその結果 BMP´s 活性を消し去る構造変化を引き起こす可能性があります。さらに、突然変異を導入することに BMP2 シーケンス リフォールディングの有効性に影響を与えることができるそして修飾タンパク質の等電点など他の蛋白質のパラメーターを変更することも。従って、確立された蛋白質の生産のプロトコルのすべての 1 つのステップは、変えられた蛋白質 variant´s の特性に合わせて適応する必要があります。BMP2 K3Plk の生産は確かに野生型 BMP2 の式に確立された方法の変更を必要です。異文化時代やプロパルギル-L-リジン (Plk) 濃度がテスト (データは示されていない) 式収量に達するために。リフォールディング、分離・精製の手順幸いな...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、プラスミド ピロリジル tRNA のエンコーディングを提供して pRSFduet pyrtRNAsynth 対応するアミノアシル tRNA 合成酵素のエンコーディングを提供するため博士 M. Rubini (コンスタンツ、ドイツ) をありがとうございます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material
1-Step NBT/BCIPサーモフィッシャー34042細胞に溶液を加える
3-アジド-7-ヒドロキシクマリンBaseClickBCFA-047-1クリック反応に使用される化学薬品
アガロース低融点Biozym840101ALPアッセイ用アガロース 
アジドアガロースビーズイエナバイオサイエンスCLK-1038-2反応用ビーズ
BamHI (Fast Digest enzyme)サーモフィッシャーサイエンティフィックFD0054制限酵素
BMP受容体 IA (BMPR-IAEC)----研究室で製造
Coomassie Brilliant Blue G-250 DyeThermo Fisher Scientific20279SDS PAGEのCoomassie Brilliant Blue染色に使用される化学物質
硫酸銅 (II) 無水物 (CuSO4)Alfa AesarA13986クリック反応に使用される化学物質
DNAポリメラーゼおよび反応バッファー KapabiosystemsKK2102KAPA HiFi PCRキット
Dulbecco'修正されたイーグル」培地 (DMEM) GlutaMAXGibco61965-026細胞培養培地
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Sigma Aldrich GmbHE5134-1kgクリック反応を止めるために使用される化学薬品
イソプロピル ß-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)Carl Roth GmbH2316.5細菌誘導 (1mM 最終濃度) 
NdeI (Fast Digest enzyme)サーモフィッシャーサイエンティフィックER0581制限酵素
NHS活性化 Texas RedLife technologiesT6134受容体P
-ニトロフェニルリン酸Sigma Aldrich GmbHN4645-1Gアルカリホスファターゼ
p25N-hmBMP2 ----ミドはWalter SebaldからJ. Nickel
pET11a-pyrtRNA---ュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座から提供
プロパルギル-L-リジン(Plk)----ヴュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座より提供
pSRFduet-pyrtRNAsynth----ヴュルツブルク大学薬剤学および生物薬学講座
Qiagen ゲル抽出キットQiagen28704ゲル精製
Qiagen PCR精製キットQiagen28104PCR精製 
L-アスコルビン酸ナトリウムSigma Aldrich GmbHA7631-100Gクリック反応に使用される化学薬品
T4 DNA リガーゼThermoScientificEL0011ライゲーション 
トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)BaseClickBCMI-006-100クリック反応に使用される化学薬品
4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコールSigma Aldrich GmbHX100-1LTriton X 100 
名前会社カタログ番号コメント
>Equipment
Amicon濃縮細胞400ml メルクKGaAUFSC40001濃縮ユニット
アミコンウルトラ-15遠心フィルターユニットメルクKGaAUFC901024濃縮遠心ユニット
ÄKTA前衛FPLC&Auml;KTA--FPLC機
アバンティ J-26XPベックマン・コールター 393124細菌培養用遠心分離機
バクテリアシェーキングインキュベーターInfors HT細菌培養用シェーキングインキュベーター
FluorChem Q systemproteinsimple--SDS-PAGE蛍光ミスクロスコープ用イメージング・解析システム
キーエンスBZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel®EMD SO3- (M)Merck KGaA116882イオン交換クロマトグラフィーカラム材料
Greiner CELLSTAR® 96ウェルプレートSigmaM5811-40EA細胞培養用96ウェルプレート(ALPアッセイ)
Heraeus Multifuge X1RThermoScientific--Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket RotorThermoScientific75003624Microcentrifuge for plate during ALP staining
Microcentrifuge - 5417REppendorf--Centrifuge
OriginPro 9.1 G OriginLab--ALPアッセイデータの統計解析用ソフトウェア
Polysine SlidesThermoScientific10143265microscope slides
Rotor JA-10Beckman Coulter ●アバンティJ-26XP遠心分離機
ローターJLA8.1ベックマンコールター用ローター ●アバンティJ-26XP遠心分離機
用ローターJA25.50ベックマンコールター --Avanti J-26XP 遠心分離機
Tecan infinite M200 マルチプレートリーダーTecan Deutschland GmbH用
Thermocycler - Labcycler GradientSensoQuest GmbH--PCR
TxRed - 顕微鏡フィルターキーエンスフィルター 
限外ろ過再生セルロースディスク 3 kDaメルク KGaAPLBC04310アミコン濃縮セル 400ml
限外ろ過再生セルロースディスク 10 kDaメルク KGaAPLGC04310アミコン濃縮セル 400ml
結合 プラスに提供されましたヴされました されました 提供 Rotor for ローター 蛍光顕微鏡用

参考文献

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