ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

サマリー

この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA 二重鎖切断の分析のためのプロトコルを提供します。

要約

DNA 二重鎖切断 (DSB) は、深刻な DNA 損傷です。DSB の修復形成の分析、ゲノム、遺伝毒性試験、放射線生物学、老化、癌、および医薬品開発を含む研究分野の広範なスペクトルに関連しています。DSB に応答して、ヒストン H2AX は蛍光顕微鏡によるセリン 139 離散核病巣検出を形成するいくつかの megabase ペアの領域内でリン酸化されます。また、53BP1 (p53 結合タンパク質 1) は別重要な DSB 応答性タンパク質相同組換えを防止しながら非相同性末端結合による DSB の修復を促進します。ΓH2AX、53BP1 の特定の機能によると γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の複合解析 DSB の詳細な分析のための合理的なアプローチがあります。本稿では、技術を実行するための組織的なノートを添加したステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響は、通常細胞株培養線維芽細胞で示されます。さらに、健康な人の x 線照射によるリンパ球のマーカーとしての γH2AX の巣の値が描かれています。最後に、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による、急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞の遺伝的不安定性を調べた。

概要

DNA が継続的に内因性によって破損している (例えば、複製ストレス、活性酸素種、DNA の固有不安定性) と外因性 (例えば、化学ラジカル、照射) ソース (図 1)^{1,2 ,3,4}。DNA 損傷の間で DNA 二重鎖切断 (DSB) は特に深刻な病変、細胞死やがんを引き起こす可能性があります。細胞と細胞周期⁵あたり約 50 DSB が生じることがあります。哺乳類細胞における相同組換え (HR) と非相同性末端結合 (NHEJ) は、DSB (図 2) の修理のための主要な経路として開発。HR 遅い S/G2 段階で発生し、そのまま妹を使用する可能性のあるエラー無料修理のためのテンプレートとして染色分け体。比較では、NHEJ は細胞周期の中でアクティブおよび潜在的変異原性塩基対を追加または壊れた端部の手術時に切除したことがあります。さらに、代替末端結合 NHEJ 欠乏^6、7の場合遅い変異原性バックアップ修理メカニズムとして従事するかもしれない。

DSB は、各 DSB の周りいくつかの megabase ペアの領域でセリン 139 でヒストン H2AX のリン酸化を誘導します。形成の核の巣 γH2AX 巣の名前は、蛍光顕微鏡⁸で検出。ΓH2AX はさらに DSB 応答性タンパク質の採用を促進し、クロマチン DNA 修復、信号伝達⁹に関与しています。各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられている、蛍光顕微鏡による DSB の定量化が可能であれば、癌細胞および患者検体^10、11,が示されています^12,13,14. 53BP1 (p53 結合タンパク質 1) DSB 修復を媒介に別の主要蛋白質であります。DSB 応答性タンパク質、チェックポイントシグナ リング、DSB 端¹⁵のシナプスの募集に取り組んでいます。さらに、53BP1 は DSB 修復経路選択に重要な役割を果たしています。HR は防がれた¹⁶NHEJ に向かって DSB の修復がトリガーされます。ΓH2AX と DSB 修復 53BP1 の本物の機能を考慮した γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の同時分析形成と DSB の修復の正確な分析のための有用な方法があります。

この原稿は、細胞核の γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡を実行するためのステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞株培養、CD34 陽性急性骨髄性白血病の患者の細胞、健康な人の x 線照射によるリンパ球の正常線維芽細胞に応用されました。方法の詳細は、発表された結果のコンテキストで指摘されます。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、ハイデルベルク大学医療学部マンハイムの倫理委員会 II によって承認されています。インフォームド コンセントを得たすべての個人から書き込まれます

。

1。 材料準備

1. 抗凝固剤原液: 0.9% 塩化ナトリウムの mL あたり 200 i. u. ヘパリンの抗凝固薬の原液を準備。コレクション チューブのそれぞれを入力 (ボリュームを描く 9 mL) 血液または骨髄のサンプルの撤退前に抗凝固剤の原液 2 mL と
。
2. 赤い細胞の換散ソリューション: 準備、10 x 82.91 g 塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム 7.91 g、8.0 でエージェントを溶解して pH を 0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 2 mL と赤血球の溶解液1 の容量の二重蒸留水・ l ・
3. 固定の解決: マイクロタイター チューブで 360 mg パラホルムアルデヒド (PFA) に 1 M 水酸化カリウム溶液を追加 8.3 μ L。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) チューブと熱 36 %pfa 溶液の 1 mL を取得する 95 ° C で加熱ブロック管内の 1 mL マークで管を埋めます。容量は 15 mL チューブに 1 mL 36 %pfa ソリューションを転送します。8 mL の PBS を 4 %pfa ストック液 9 mL を得るために 1 mL 36 %pfa のソリューションに追加します。細胞の固定用 4 %pfa 原液と-18 ° c までストア因数
   。 注意: 1) 水酸化カリウム水溶液腐食性です。目と皮膚の保護の注意してください。2) PFA は、発がん性があります。皮膚への接触や吸入を避けます。フードの下の固定の解決の準備します
。
4. 透過ソリューション: およそ 0.1% のソリューションを取得する追加 50 μ L Octoxinol 50 に 9 mL PBS Octoxinol 9.
5. ソリューションをブロック: 5% と 2 %6 で PBS とストアを持つ蛋白質のブロッキング剤を混合することによって解決を妨げる準備 – 8 ° C

2。サンプルの準備

1. 細胞培養線維芽細胞: の加湿 5% の細胞株培養線維芽細胞を養う CO ₂ 雰囲気 4 mM 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 培地で 37 ° C でグルタミン、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
   1. 付着と顕微鏡のスライドの準備線維芽細胞
      1. は、フラスコ (75 cm ² 成長分野) 指数関数的に成長の培養線維芽細胞からメディアを削除します。フラスコに 10 mL の PBS を追加します。手動で 1 分のフラスコを振ることによって付着線維芽細胞を優しく洗って
      2. は、PBS を削除し、フラスコに 1 mL のトリプシンを追加します。すべての付着性細胞がトリプシンによって覆われているように優しくフラスコを振る。フラスコからトリプシンを削除します。37 で 5 分のためのインキュベーターにフラスコを入れ ° C
      3. は、インキュベーター外フラスコを取るし、フラスコに 10 mL RPMI 1640 媒体を追加します。ピペットの繊維芽細胞を分散させるために数回上下中です
      。
      4. は、顕微鏡スライドの 2 つのフィールドのそれぞれに分散した線維芽細胞の 0.3 mL のピペットし、24 h のためのインキュベーター内にスライドを置き、繊維芽細胞がスライドに従います。ΓH2AX と線維芽細胞の核 53BP1 の是非、ステップ 3.1 に移動します
      。
2. 患者サンプル
   1. 血液サンプル: 抗凝固剤原液 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用し、チューブに 7 mL の血液を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します
   。
   2. 骨髄サンプル: 抗凝固剤の原液 (ステップ 1.1) の 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用して、チューブに 7 mL の骨髄を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日は、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します。CD34 のマイクロ ビーズを使用し、CD34 陽性細胞を分離するための分離カラムのセルします
   。
   3. 密度勾配遠心法による単核細胞の分離
      メモ: 単核細胞は密度勾配遠心法 ^{17 , 18 , 19} 血液、骨髄サンプルから分離されます。
      1. Dilute PBS で 1:1 の比率でヘパリン加血液サンプルおよび PBS で 1:3 の比率でヘパリン骨髄サンプル。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を優しく中断します
      。
      2. は、新鮮なチューブに密度勾配媒体のボリュームを追加します。優しくレイヤーの希釈血液または骨髄密度勾配媒体の上に。2 つのレイヤーを混在させるように注意してください
      。
      3. は、室温で 30 分間チューブを遠心分離機し、400 x g. ピペットの上部のプラズマ層を引き。密度勾配媒体上の層の単核細胞を慎重に収穫後は。新鮮なチューブに単核細胞を転送します
      。
      4. は、チューブの単核の細胞に PBS の少なくとも 3 つのボリュームを追加します。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって細胞を優しく中断します。部屋の温度と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心
      5. スピン後上澄みを除去し、4 ° C、1 x 赤い細胞の溶解液 10 mL を加えます。優しくピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を再懸濁します、5 分間氷の上管を配置します。4 ° C で 30 mL の PBS を追加し、室温と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心
   4. 、Cytospins の準備
      1. 患者サンプル (すなわち、1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色、γH2AX、53BP1 の 1 つ cytospin の単核の細胞との 2 つの cytospins の準備免疫蛍光染色の組み合わせ) を (300 × g, 10 分) 遠心 ( 図 3 および 4) のそれぞれの準備のための 10 の ⁵ セル × 1.0
      。

3。 γH2AX 53BP1 免疫蛍光染色と

1. 固定・透過: 4% の 200 μ l でセルを修復する PFA 10 分。固定後、3 回ラボ シェーカーで各 5 分の 30 mL の PBS のセルを優しく洗います。その後、セルを permeabilize 0.1% の 200 μ L で 10 分間 Octoxinol 9 セルを洗浄して優しくラボ シェーカーで各 5 分 5% ブロッキング溶液 30 mL を 3 回。30 mL の新鮮な 5 %1 h. の解決を妨げるに細胞をブロック
2. 抗体の孵化
   1. インキュベート マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) の細胞の 1 つ準備およびマウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) と細胞の他の準備とアンチ 53BP1 ポリクローナルウサギ (1: 500) 一晩で 4 ° C
   2. インキュベーション洗浄セル軽くラボ シェーカー各 5 分の 2% ブロッキング溶液 30 mL に 3 回後
   。
   3. ブロックのソリューションを削除し、Alexa488 共役ヤギ抗マウス二次抗体 (1: 500) とセルの最初の準備と、Alexa488 共役ヤギ抗マウス抗体 (セルの 2 番目の準備を孵化させなさい1: 500)、常温で 1 h の Alexa555 共役ロバ抗家兎二次抗体 (1: 500).
3. メディアをマウント: 細胞とスライドをボウルに入れ、セルを洗浄して優しくラボ シェーカー各 5 分の 30 ml の PBS の 3 回。PBS を削除し、セルを 4, 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントをマウントします。気泡がないように慎重にメディアをマウントの上に coverslip を置く埋め込まれています。蛍光顕微鏡による細胞を分析する前にメディアをマウントの強化のため、少なくとも 3 時間待機します
。

4。ΓH2AX、53BP1 の解析巣

1. 蛍光顕微鏡: 100 X 目的で画像の中に、DAPI、アレクサ 488 Cy3 フィルターを搭載した蛍光顕微鏡で細胞核内 γH2AX、53BP1 の巣を分析倍率。カメラで画像を記録し、適切な画像処理ソフトウェアで画像を処理します
。

結果

G0/G1 期と G2 段階の場合 γH2AX 巣が (図 5 a) 異なる蛍光ドットとして表示されますセルの γH2AX 巣の分析は最も正確です。対照的に、レプリケーション プロセス (図 5 b) によって引き起こされる分散パン核 γH2AX 斑点、S 期細胞で γH2AX 巣の分析は複雑します。

細胞の固定を行った 4 %pfa (10 分) と 0.1% で透過 Octoxinol 9 (10 分)。メタノールを固定と透過にも使用できます。ただし、メタノールが非常に深刻な細胞核を分割し、4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較して明確な表示されない γH2AX 巣 γH2AX 巣を汚す Octoxinol 9。

ディスカッション

ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、形成と幅広い分野で DSB の修復の分析に有用な方法です。実験の結果に影響を与える重要なパラメーターは、細胞周期、固定と透過の細胞、抗体、およびハードウェアの選択、蛍光顕微鏡のソフトウェアに使用されるエージェントの段階です。

正常線維芽細胞細胞株培養を指数関数的に成長することにより細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響を示した。G0/G1 の異なる蛍光ドットとして登場した γH2AX 巣と S 期 (図 5) で分散したパン核 γH2AX 斑点と比べて G2 段階。G0/G1 の異なる γH2AX 巣相し、G2 段階一過性および/または構成で指定された DNA の損傷セル繰り返し通路中に取得しました。逆に、S 相に分散した斑点のみ一過性が発生し、レプリケーション ・ プロセスとおそらく関連していた。パン核 γH2AX 斑点を妨げる可能性があります分析から S 期細胞の排除、本物 γH2AX 病巣の解析を推奨します、S 相の特定 γH2AX パターンによ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI培地	Sigma-Aldrich	R0883	細胞培養用培地
ヘパリン ナトリウム	レシオファーム	PZN 3029843	ヘパリン 5,000 I.U. / mL
塩化ナトリウム溶液 0.9%	B. ブラウン	PZN 1957154	抗凝固剤ストック溶液の成分
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	単核細胞の単離用培地
トリプシン溶液 10X	Sigma-Aldrich	59427C	細胞培養における線維芽細胞の解離用酵素
CD34 MicroBead Kit	MiltenyiBiotec	130-046-702	CD34+骨髄系前駆細胞の単離
用顕微鏡スライド	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	顕微鏡スライド
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	卓上遠心分離機
サイトスピンデバイス
リッド	ヘレウス	76003422	マイクロチューブレス作業用リッド
サイト容器 ヘ	レウス	75003416	円錐形2つの穴を持つサイト容器
クリップキャリア	ヘレウス	75003414	キャリア サイト容器とスライドを保持するための
キャリア サポートインサート	ヘレウス	75003417	サポートインサートクリップキャリアを保持している
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	細胞膜の透過化用洗剤
水酸化カリウム溶液 1M	メルクミリポア	109107	パラホルムアルデヒド溶液の調製に必要
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	固定剤
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	D8537	平衡塩溶液
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	ブロッキング剤
マウスモノクローナル抗 -&� ガンマ;H2AX 抗体 (JBW301)	Merck Millipore	05-636	&γ;H2AX
ポリクローナルウサギ 抗53BP1抗体 (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	二次抗体
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	二次抗体
Vectashield 封入剤	ベクターラボラトリーズ	H-1200	DNA染色用DAPIを含む
Axio Scope.A1	ツァイス	490035	蛍光顕微鏡
クールキューブ 1 CCDカメラ	メタシステム	ズ H-0310-010-MS	デジタル記録用カメラシステム
ISISソフトウェア	メタシステム	対象外	顕微鏡ソフトウェア