ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。
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この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアは植物、特にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) やフラビン アデニンなど削減化合物の酸化からアデノシン三リン酸 (ATP) の生産の多くの代謝経路に関与する重要な細胞内小器官型 (FADH2)。シロイヌナズナのゲノムの完全な注釈が確立して最も広くプラント モデルを使用し、したがってさまざまな器官 (葉や根、花) からミトコンドリアを浄化するために必要なツールをフル活用する必要があること今ミトコンドリアの生物学を研究するシロイヌナズナ用があります。ミトコンドリアは、様々 なアプローチ、続いて連続コロイド密度勾配を使用して更に精製粗ミトコンドリア ペレットを生産差動遠心分離手順の一連を使用して組織の均質化によって分離します。遠心分離。コロイド密度材料がその後複数の遠心分離手順によって削除されます。新鮮な葉のティッシュの 100 g から始まって、ミトコンドリアの 2-3 mg 日常的に取得できます。これらのミトコンドリアの呼吸実験阻害剤及び各種の基材を使用しているを確認する能力を持つ 100 250 nmol O2分-1 mg ミトコンドリア蛋白-1 (NADH 依存率) の典型的な率を表示します。基板を酸化と代替とチトクローム ターミナル オキシダーゼの容量。このプロトコルでは、シロイヌナズナ葉連続コロイド密度勾配および精製された植物ミトコンドリアの効率的な呼吸測定を使用してからミトコンドリアの分離法について説明します。
概要
植物ミトコンドリア研究の歴史は、100 年1以上さかのぼります。無傷ミトコンドリアが 1950 年代初頭に隔離された最初差動遠心分離を使用します。1980 年代におけるコロイドの密度勾配の出現は、浸透圧調節を受けることがなく精製するミトコンドリアを許可しました。グラデーション精製ミトコンドリアは質量分析法の感度のためのほとんどの目的に適しているも比較的軽微な汚染物質検出することができます、不適切なミトコンドリアの場所2を割り当てることができます。プラスチド局在型の両方を削除フリーフロー電気泳動することができますの使用とペルオキシソーム汚染3、無料が、フローの電気泳動は専門性の高い技術と研究の大半には必要ありません。さらに、そのデュアルまたは複数のターゲット蛋白質の思い出したする必要がある蛋白質の場所を決定するときにセルに発生します。葉緑体/プラスチドとミトコンドリアの4、およびミトコンドリア標的蛋白質の数の以上 100 デュアル ターゲットタンパク質を説明し、ペルオキシソームでは5が知られています。さらに、特定の刺激、酸化ストレスなどの下で蛋白質の再配置は、細胞生物学6新興テーマです。このように、蛋白質の位置を学び、生物学の文脈で....
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プロトコル
このプロトコルはそのまま土壌コロイドの連続密度勾配を使用して上に成長したシロイヌナズナ器官ミトコンドリアの分離に使用されます。4 ° C で行われているすべてのプロシージャの次の材料のコレクション
1. 粉砕媒体、洗浄バッファー、およびグラデーションのソリューションの準備
- 研磨媒体 (マイナス アスコルビン酸とシステイン) とテーブル1 2 x 洗浄バッファーの 200 mL 1 日分離前に 300 mL を準備、4 ° C で冷える
注: アスコルビン酸ナトリウムと L-システイン (遊離塩基) 17.84 mM, 20.36 mM の最終的な集中にそれぞれ追加、分離の朝に研削中にします。ミトコンドリアが使用される西部のしみまたはブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルのゲルの電気泳動 (BN-PAGE) 分析、BSA のない洗浄バッファー x 2 を構成します。 - ミトコンドリアの分離 (図 1と表 1) の朝にグラデーションを準備します。
- 重いと光のグラデーションのソリューションは、2 つのビーカー。それぞれの 35 mL で 2 つの勾配管十分です。
- グラデーションの注ぎ口と PVC 蠕動チューブを脱イオン水の部屋を洗って、すべての管から管を....
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結果
このプロトコルを使用して、SDS-PAGE とイムノブロットによって異なるミトコンドリア蛋白質を検出することができました。図 3 aに示すように、水の培養組織から分離したタンパク質はかすかなバンド (2 μ g) を検出するのに十分です。信号強度は、ロード量に比例して増加します。プレート (図 3 b)、高い光ストレスへの応答上に成長した組織から分離したミトコンドリアの異なった遺伝子型の治療は代替オキシダーゼ抗体バイオアセッテイによって分析できます。
ミトコンドリア ・ チトクロムc経路活性代替経路のイヌイットは、新鮮単離ミトコンドリア サンプルを使用して測定できます。説明の隔離プロシージャ (図 4 a) の中にミトコンドリアの整合性はよく保持されます。チ.......
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ディスカッション
通常、シロイヌナズナからミトコンドリアの分離は徹底的な研磨と 5 mg を超える利回りが得られますが約 80-100 の 3 - 4 週間の古い植物からミトコンドリアの 3 mg を利回りを残します。収量は生育条件によって異なります、老化9の中にも維持されるように思われますがミトコンドリアの構造は、senesce の葉、劇的に減少します。良好な収率を取得する最も重要な機能の 1 つは、ミトコンドリアを解放する細胞を溶解する研磨方法です。機械的研削装置の数は購入可能な中、シロイヌナズナの乳鉢と乳棒で粉砕を実現収量の面で一貫して良好な結果として細胞内小器官にはほとんど損傷を持つ細胞を溶かすこと機械研削盤は高速ですが、最適化を必要し、する研削に必要な量は、組織によって異なります。モルタルと乳棒、しばしば便利と効率的組織のスライスまたは研削前にナイフやハサミでカット。4 ° C で実施される必要があるすべてのステップのとおりと精製ミトコンドリアの洗浄ペレットを取得するために研削の端から全体の手順は、約 4 時間を取る必要があります。洗剤または管またはグラデーションのメルターで他の試薬の痕跡は、収量.......
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開示事項
著者は利害の衝突を宣言しません。
謝辞
この研究、オーストラリア研究協議会優秀センターのプラント エネルギー生物学 CE140100008、オーストラリア研究協議会未来フェローシップ (FT130100112) を MWM とフョードル ・ リュネン研究員 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルトによって支えられました財団、ドイツ) JS に。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | 化学 |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | ケミカル |
| シトクロームc | Sigma-Aldrich | C3131 | 化学 |
| Difco 寒天、粒状 | BD Biosciences | 214530 | 化学 |
| ジチオトレイトール | Sigma-Aldrich | D0632 | 化学 |
| EDTA 二ナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | E5134 | 化学 |
| Gamborg B-5 基礎培地 | Austratec | G398-100L | 化学 |
| Gamborg ビタミン溶液 (1000x) | Austratec | G219-100ML | 化学 |
| ヤギ抗マウス IgG (H + L)-HRP コンジュゲート | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ | 1706516-2ml | ケミカル |
| ヤギ 抗ウサギ IgG (H + L)-HRP コンジュゲート | バイオ・ラッド・ラボラトリーズ | 1706515-2ml | 化学 |
| L-システイン | シグマ | C7352-100G | 化学 |
| 硫酸マグネシウム | シグマ・アルドリッチ | 230391 | ケミカル |
| 村重 &Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl galaate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 化学、コロイド密度勾配 |
| ポリビニルピロリドン (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | 化学 |
| シアン化カリウム | Sigma-Aldrich | 60178 | 化学 |
| リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 化学 |
| ピルビン酸 | Sigma-Aldrich | P2256 | 化学 |
| 塩化ナトリウム | Chem-Supply | SA046 | 化学 |
| ジチオナイト | Sigma-Aldrich | 157953 | 化学 |
| L-アスコルビン酸 | ナトリウム | Sigma A4034-100G | |
| 化学コハク酸 | Sigma-Aldrich | S2378 | 化学 |
| クロース | Chem-Supply | SA030 | 化学 |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 化学 |
| ピロリン酸四ナトリウム (Na4P2O7 & middot; 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | シグマ | 11921681001 | ケミカル |
| バランス | メトラー・トレド | XS204 | 機器 |
| ビーカー | Isolab | 50 mL | |
| 遠心分離機 | ベックマン・コールター | Avanti J-26XP | 機器 |
| 遠心分離管 | Nalgene | 3117-9500 | 機器 |
| サーキュレーター | ジュラボ | 1124971 | 取り付け酸素電極チャンバー |
| コニカルフラスコ | Isolab | 500 mL | |
| スポイト | 3 mL | ||
| 固定角ローター | ベックマン・コールター | JA25.5 | 機器 |
| 漏斗 | Alimenti | 14 cm | フィルタリング用 |
| グラジエント注ぎ器 | バイオ・ラッド | 165-4120 | グラジエントの準備用 |
| マグネティックスターラー ATE | VELP Scientifica | F20300165 | 機器 |
| ミラクロス | VWR | EM475855-1R | ろ過材 |
| 乳鉢と乳棒 | ジェイミー・オリバー | 花崗岩、6インチ | 機器 |
| O2view | ハンザテック機器 | 酸素モニタリングソフトウェア | |
| オキシグラフプラスシステム | ハンザテック機器 | 1187253 | クラーク型酸素電極 |
| 絵筆 | アーティスト第一選択 | 1008R-12 | |
| パラフィルム | ビーミス | PM-996 | プラスチックパラフィンフィルム |
| 蠕動ポンプ | ギルソン | F155001 | 勾配の準備のために |
| PVC蠕動チューブ | ギルソン | F117930 | 勾配の準備のために |
| ウォーターバス | VELP Scientifica | OCB | 機器 |
参考文献
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell
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