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方法論記事

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

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DOI:

10.3791/56631

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2018年1月26日

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

この記事について

サマリー

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3 の球状ドメインで。

要約

脳の発達は、時間空間的なモルフォゲンや転写の異なるプログラムの勾配によって制御される複雑なプロセスです。また、ヒストンのメチル化などのエピジェネティックなクロマチン修飾の確立およびこのプロセス内で特定のセル運命を維持する重要な役割があります。大多数のヒストンのメチル化はヒストン、修飾子、消しゴム、およびヒストン リーダー蛋白質にアクセス可能な柔軟なヒストンの尾で発生します。対照的に、H3K79 のメチル化はヒストン 3 の球状ドメインに位置し、さまざまな発達機能に関与しています。H3K79 メチル化は進化的に保存されているし、酵母にホモ ・ サピエンスから種の広い範囲で見つけることができます。神経前駆細胞を含む生物内の異なる細胞数の変更が発生します。H3K79 メチル化ヒストン 3 の球状ドメインの場所すると、評価が難しくなります。ここでは、分離する手法を提示して文化大脳皮質前駆細胞 (CPCs) 胎生期大脳皮質の脳組織 (E11.5-E14.5) または小脳顆粒細胞前駆細胞 (CGNPs) 生後組織 (P5-P7)、効率的に immunoprecipitate量的な PCR (qPCR) とゲノム シーケンスの H3K79me2。

概要

脳の感覚, モータ, と認知機能が非常に複雑で物理的な環境の変化に影響を受けやすいです。脳は、深くつながっています 3 つの一般的な部分、後肢-、半ばと前脳, で構成されています。前脳, 内終脳は背終 (DT) と腹側終 (VT) に分けることができます。マウスの DT は、「インサイド アウト」方法1で E11.5 と E18.5 間形作られる六つの皮質層で構成されています。VT には、開発後大脳基底核2,3を形成する神経節隆起が含まれています。いくつかの細胞の種類で分類できます哺乳類の中枢神経系神経細胞やアストロ サイト、オリゴデンドロ サイト4など5時間空間的方法を開発します。まず、神経前駆細胞 (Npc) はニューロン、介在ニューロン VT と投射ニューロンの種類に、DT ではグリア細胞 (例えば、アストロ サイト6) に上昇を与えます。皮質過程を最も表面的な層 (層)、最初に形成、カハール ・ レチウス細胞を含みます。Npc を生成 E12.5 と E14.5 の間より深い神経層 (VI, V) 中を生じさせる上層 (第四) ニューロン7,814.5 16.5、前駆細胞の間。軸索の身元は、異なるモルフォゲン誘起の時間空間的転写プログラムおよびまたエピジェネティック プログラム2に指定します。

モーターの調整に関与しているが、小脳は菱脳にありマウス9で E10 と約 P20 の間成長します。小脳皮質と小脳核10が含まれています。成人の小脳皮質は 3 層、最も外側の分子層、プルキンエ細胞層、顆粒ニューロンの10を含む最も内側の顆粒層から成っています。小脳顆粒細胞は最小のニューロンで、脊椎動物の脳11すべての神経細胞の約 80% を表しています。彼らは外部の胚のゾーンに位置する前駆体から開発し、彼らの先12プルキンエ細胞層を移行します。終脳、小脳の開発はいくつかの重要なモルフォゲンによって調整される、ように時間と空間に依存した特定の機能を持っているし、開始は転写プログラム10に定義されています。

大脳皮質と小脳の層の開発は、特定のモルフォゲンの転写式で、したがって、DNA のクロマチンの状態によって制御されます。簡易ビューでクロマチンの状態を転写活性状態としてユークロマチンと転写活性サイレント領域として異質染色質に分割できます。クロマチンの基本単位としてヌクレオソームには、各コアのヒストン H2A、H2B、H3、H4、147 の塩基対の DNA13に囲まれた 2 つのコピーが含まれています。ヒストンは、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、sumo 化、ADP リボシル化、脱アミノ化、およびプロリン異性化14,15によって高いファーストクリーニング変更します。ヒストンのリジンのメチル化は転写、複製、組み換え16、DNA 損傷応答17、およびゲノムインプリンティング18制御する最も安定したヒストン修飾と見なされます。リシンはモノラル、ディ、またはトリ メチル19アクセス可能なヒストンの尾にだけでなく、ヒストン20の球状ドメイン内で表示できます。H3K4 H3K36 で特定のメチル化は、主ユークロマチン、H3K9、H3K27、または H4K20 で特定のメチル化は主にヘテロクロマチン領域、すべての残基がヒストンの尾14,内にある19,21。H3K79 のメチル化はヒストンの球状ドメイン内にあるし、転写活性、発現不活性ゲノム領域22とも関連付けられています。それは、酵母や子牛の胸腺、鶏、人間23で観察されているので変更は保存されました。H3K79 モノ, ジおよびトリメチル (H3K79me1、me2、me3) は、ヒストンのメチル化酵素 DOT1L24,25と26核設定ドメインを含むタンパク質 2 (Nsd2) によって触媒されます。DOT1L は、増殖、DNA 修復、27の reprograming 携帯電話で関与しています。マウスでDot1lの損失は、発達段階 E10.528,29周り出生前の死に します。心臓の発達過程および myocardiocyte の分化は、DOT1L は遺伝子発現の規則30に不可欠です。中枢神経系における DOT1L 関数は、神経管開発31で関与する可能性があります、それはTbr1の抑制に関与する-脳開発32中、式小胞体ストレスによる機能可能性があります応答遺伝子33。コンテキスト依存のアクティブ化または中枢神経系の開発のような体内状況に特に H3K79me の抑制作用は、日付には部分的に32を理解専用です。H3K79 のメチル化はヒストン 3 の球状ドメインにあるので、柔軟なヒストンの尾23での変更と比較してアクセスしにくい立体です。H3K79 メチル化の機能を理解し、その場所とゲノム環境を決定する信頼性と再現性の高い分析法が必要です。QPCR や時点の異なるシーケンスを介して H3K79 のメチル化を分析する、異なる神経前駆細胞 (皮質のクリック単価) と小脳の CGNPs、DOT1L 阻害剤治療、チップ メソッドの分離手法を提示するこの方法で大脳皮質と小脳の開発中にポイント。プロトコルとその可能性の概要については、図 1を参照してください。

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プロトコル

フライブルク大学と地方自治体の動物福祉委員会は、次のプロトコルに記載されているすべての動物実験 (G12/13、G16/11) を承認しました。

1. 準備

  1. クリック単価の分離のための準備
    1. 交尾 (E11.5 と E14.5) 野開発のさまざまな段階で胚を取得するタイミングを設定します。少なくとも 8 週齢であるひずみ技研 (海軍医学研究所) のマウスを使用します。交尾後 E0.5 で肯定的な膣にプラグを検討します。
    2. 十分な材料を持っている、E12.5 または E14.5 の皮質からの 1 つの H3K79me2 チップの当所マウスの 1 リットルを使用します。後の胚の段階よりチップ分析の 1 リットルを使用 (平均くずサイズ技研: 10 胚)。
    3. Hank´s バランスのとれた塩ソリューション (HBSS) とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、4 ° C (常温長期保存) を precool します。
    4. 平衡 4 ° C 保存トリプシン-EDTA (0.05 %w/v) 37 ° c
    5. 準備皮質細胞用培地 (CCM):最終濃度 2% (v/v) B-27 サプリメント、5 μ G/ml Apo トランスフェリン、1 μ g/mL グルタチオン、0.5 mM L グルタミン、0.8 μ G/ml スーパーオキシドジスムターゼおよび 1% (v/v) (材料表参照) ニューロンのための媒体を補完します。ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン抗生の混合物。4 ° C で保存します。37 ° c. に媒体を平衡実験のため
    6. 牛胎児血清 (FCS)、分注を解凍それ (50 mL)、37 ° C (-20 ° C で長期的なストレージ) に 1 つの因数を平衡と。
    7. 細胞培養のための H2O の DNAse 1 (10 mg/mL) の株式を準備します。因数-20 ° C で保存します。
    8. 必要な場合、特定の DOT1L 阻害 EPZ 5676 や DMSO の SGC0946 100 mm ストック濃度を溶解します。0 日でセルに 1-5 μ M の最終濃度を適用し、2 日毎阻害剤を再適用。
    9. CPC 栽培 37 ° C で CCM 培地で一晩細胞培養皿 (6 または 12 の井戸) ポリ L-オルニチン臭化水素酸塩 (150 mM ホウ酸 ph 8.4 1 mg/mL) RT で少なくとも 1 時間とラミニン (1 mg/mL) その後のコートします。
  2. CGNP 分離のための準備
    1. マウス小脳 (チップと条件あたり 3-5 動物) の分離の P5 P7 動物を生成するための適切な交配を整理します。
    2. HBSS バッファーにグルコース 6 mg/mL を追加して HBSS/グルコースを準備します。
    3. CGNP 細胞培養培地 (CGM) を準備するには、1% (v/v) N2 サプリメント, 1% (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン、25 mM KCl と 10% FCS DMEM f12 キーを追加します。CGNP 栽培の FCS なく 0.6 μ g/mL ソニック ・ ヘッジホッグ (SHH) (CGM SHH) を含む CGM メディアの準備し、必要なとき 37 ° C に釣り合います。
    4. 100 μ g/mL ポリ-D-リジン グリア細胞の除去のための RT で 1-2 時間で 6 も細胞培養皿をコートします。その後滅菌 ddH2O で 2 回洗浄し、乾燥プレート。プレートを 4 ° C で最大一週間保存します。
    5. 4 ° C でのポリ L-オルニチン (0.1 mg/mL) と CGNPs コート 6 も細胞培養皿の栽培の一夜します。その後 H2O の細胞培養で 2 回洗浄し、乾燥プレート。
      注意: プレートが 4 ° C で最大一週間保存することができます。
    6. HBSS/グルコースで 0.025% トリプシン (w/v) を準備し、37 ° C 必要なときに釣り合います。
  3. H3K79me2 のチップのための準備
    1. 架橋クロマチンの前にたて PFA (PBS、pH 8 で 1%) を準備します。準備するには、PFA 熱 50 mL PBS 電子レンジで最大 65 ° C一定の攪拌中 0.5 mg PFA を PBS に追加します。50 μ L を追加し、10 M NaOH と PFA が解散されるまで待ちます。その後、42.5 μ L を追加 HCl (37 %v/v) 8 の pH を得る。PH の確認を再度とさせる 1 %pfa ソリューションに到達しました。
    2. 在庫を準備 RNase (1 mg/mL) のプロティナーゼ K (20 μ g/μ L) 個別に滅菌 ddH2O. 保存-20 ° C で因数
    3. 次のバッファーおよび試薬の準備: 0.02% を含む PBS トゥイーン、換散バッファー、グリシン、希釈バッファー、バッファー 1、チップ バッファー 2、チップ 3、バッファーおよび TE バッファーをチップし、4 ° C で保存毎回新鮮な溶出バッファーを準備します。
      1. 0.02% を含む PBS を準備トゥイーン。4 ° C でほとんど 1 週間のための店
      2. プロテアーゼ阻害剤 × 1、1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、pH 8.0、10 mM EDTA で 50 mM Tris を使用して換散バッファーを準備します。
      3. 2.5 M のグリシンを準備します。
      4. 希釈バッファーで 20 mM Tris 150 mM NaCl、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、1% (v/v) トリトン X-100、0.25% (w/v) SDS およびプロテアーゼ阻害剤 × 1 を準備します。
      5. チップ バッファー 1 で 20 mM Tris 150 mM NaCl、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0、1% (v/v) トリトン X-100 と 0.2% (w/v) SDS を準備します。
      6. バッファー内蔵 2 使用の 20 mM Tris pH 8.0、500 mM の NaCl、2 ミリメートルの EDTA、1% (v/v) トリトン X-100 と 0.2% (w/v) SDS を準備します。
      7. バッファー内蔵 3 使用の 20 mM Tris pH 8.0、250 mM LiCl、2 ミリメートルの EDTA、1% (v/v) NP-40 と 1% (w/v) SDS を準備します。
      8. 20 mM Tris pH 8.0、2 ミリメートルの EDTA を使用して TE バッファーを準備します。
      9. 100 mM NaHCO31% (w/v) SDS を含む新鮮な溶出バッファーを準備します。

2 脳組織の神経前駆細胞の分離

  1. クリック単価のオプションの培養と分離
    1. 頚部転位によって妊娠動物を安楽死させるし、冷たい HBSS に胚を転送します。
    2. ハサミで頭蓋骨を削除し、脳を分離、場合に応じて、小さな鉗子を使用して双眼スコープの下ですべての他の脳の部分を削除することによって両方の半球の分離野 (全体、DT、または VT) と小さな鉗子と、髄膜を削除必要に応じて、小さなはさみ。分離皮質を 15 mL チューブに 4 ° C で 5 mL HBSS バッファーに格納します。
    3. 遠心分離機の分離脳材料 1,000 x g と 4 ° C で 5 分間
    4. 5 mL の野を洗って冷たい HBSS し上下にピペットで 1 mL ピペット チップとそれらを均質化。必要に応じて、ピペット チップの先端をカットします。
    5. 1,000 x g と 4 ° C で 5 分間、試料を遠心分離します。HBSS を削除します。
    6. 3 mL のトリプシンを追加し、37 ° C で 5 分間サンプルをインキュベート
    7. サンプルに FCS 1 mL、5 mL、CCM、DNase 1 の 30 μ L を追加し、上下慎重にピペットで 5 mL ガラス製ピペットでサンプルを均質化します。
    8. 1000 x g と 4 ° C で 5 分間隔離されたセルを遠心分離します。上澄みを廃棄、5 mL、CCM を追加し、再度サンプルを均質化します。
    9. サンプルの因数を希釈し、ノイバウアー カウント室を数えます。胚 1 つあたり 10 の6セル × 4.5 の平均量が期待されます。孤立したクリック単価の栽培手順 2.1.10 に進みます。チップ、すぐに手順 3 に進みます。
    10. 栽培、板ポリ L-オルニチン (0.1 mg/mL) とラミニン (1 mg/mL) コーティング単価 CCM 中5セル/cm2と 2.5 x 10 の 8 × 104間の密度で料理し、37 ° C、5% CO2、および 100% の相対湿度でそれらを孵化させなさい。
    11. (約 4 日) 後細胞培養神経細胞に区別するために、クリック単価を開始、以来日の in vitro 0 (0 日) として郭清日を検討してください。栽培の長い用語については、媒体の半分新鮮な CCM 中 4 日を変更します。
    12. 1-5 μ M を適用 SGC0946 または EPZ5676 日 0 (細胞分離後 4-5 h) DMSO に溶解し、1 日おき更新します。コントロール治療として DMSO を使用します。必要な場合は、標準のイムノブロット メソッドを介して阻害剤処理の効率化をテストします。
  2. CGNPs のオプションの培養と分離
    1. はさみを使用して斬首で P5 7 動物を安楽死します。頭皮の皮膚、頭蓋骨を開く、小さなハサミ、鉗子を使用して脳を取り外します。小脳を分離し、冷たい HBSS/グルコースにそれを転送します。すべての髄膜と血管を取り外し、冷たい HBSS/グルコースでいっぱい 15 mL チューブに、小脳。
    2. 3 回 10 mL で小脳を洗って冷たい HBSS/グルコース (4 ° C で 5 分間 650 × g で遠心分離によってそれらを収集) しその後ゆっくり上下に 1 mL ピペットでピペッティングによる小脳を均質化 (最大 2 〜 3 回) 0.5-1 取得 mm3フラグメント。
    3. HBSS/グルコースで 0.025% トリプシンの 5 mL を追加し、CGM の 5 mL を追加して 15 分停止消化の 37 ° C の水浴中一定の攪拌下に組織を孵化させなさい、4 ° C で 5 分間 650 × g で遠心分離によって組織を収集
    4. 上澄みを除去しカップ刻んだ 1 mL の CGM に 1 mL のピペット先端部を組織し新しい 15 mL チューブに転送。
      注: それは空気の泡を避けるために重要です。
      1. 5 mL CGM を追加し、残党組織を解決する氷の上 2 分の混合物をインキュベートします。新しい 15 mL チューブに上清を移します。残存組織を 2 mL CGM を加えて製粉の手順を繰り返します。
    5. 組織の遺残、合計で約 10 mL) を除いた上清をプール、小脳の細胞を収集するために 4 ° C で 5 分間 650 × g で遠心分離機します。10 mL の CGM にペレットを再懸濁します。
    6. アストロ サイトより速くより強くを CGNPs よりポリ-D-リジンに従う、以来プレート 100 μ g/mL ポリ-D-リジン コーティング 6-井戸-プレート上のセル (ウェルあたり最大 4 mL) とアストロ サイトを削除する 37 ° C で 20 分間インキュベートします。
    7. プレートを振るし、上清を収集します。15 mL チューブに 4 ° C で 5 分間 650 × g で遠心分離します。10 mL の CGM にペレットを再懸濁し、カウント部屋ノイバウアーとセルをカウントします。
      注: CGNPs が小さく、ラウンドして、位相差顕微鏡を使用してイメージを作成するときにハローを示します。
    8. 必要な場合シード 37 ° C のセルは事前ポリ L オルニチン コーティング プレート (3 x 10 の6セル 6 ウェルあたり) に CGM を加温し、37 ° C、5% CO2と 100% の相対湿度でそれらを孵化させなさい。
      注: シードを実行しない場合は、ステップ 3.1 に進みます。
      1. 6-12 時間後に、CGM SHH に培地を交換します。分離 CGNPs 6 h の治療 (または CGM SHH に変更する場合) DOT1L 阻害剤と DMSO 分離後を制御し、それにすべての 2 日目 (2.1.12 と比較) を更新します。必要な場合は、標準のイムノブロット メソッドを介して阻害剤処理の効率化をテストします。チップは、3.3 の手順に進みます。
        注: は皿の上 (とその FBS) CGM を残し、CGNPs の小脳顆粒ニューロン (CGNs) への分化になります。

3. 固定細胞のクロマチンのせん断加工

注: は、細胞を培養しているいない場合、3.1 と 3.2 の手順を実行、彼らは、3.3 のステップに進みます。

  1. 1,000 x g で 4 分間遠心分離によって細胞を収集し、1.3 mL の PBS を追加します。1.5 mL チューブにサンプルを転送します。4 ° C で 1,000 x g で 4 分間遠心1.3 mL の PBS で 2 回サンプルを洗います。
  2. 重要なステップ:追加 350 μ L 1% のサンプルに PFA 22 ° C で 5 分間インキュベートし、反応を停止するには、18.4 μ L グリシンと 1 mL の PBS を追加します。4 ° C で 1,000 x g で 5 分間のサンプルを遠心分離します。
    1. 氷冷 PBS で 2 回サンプルを洗います。1,000 x g で 5 分間、4 ° C の遠心分離によって固定セルを収集します。さあ今から氷のサンプルを保ちます。
      注: 固定時間は、最適な結果を得るため正確に 5 分をする必要があります。別のセルの数字は、時間適応を必要があります。
  3. 重要なステップ:1 mL を 1% 追加培養 CGNPs (またはクリック単価)、細胞培養プレート井戸に直接 PFA。22 ° C で培養で 5 分の所に後、グリシンおよび PBS の適切な量を追加し、細胞スクレーパーとセルを収穫します。
    1. 1.5 mL チューブにセルを転送し、1,000 x g と 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心分離氷冷 PBS で 2 回サンプルを洗います。4 ° C で 5 minat 1,000 x g の遠心分離によって固定セルを収集します。さあ今から氷のサンプルを保ちます。
  4. 重要なステップ:換散バッファー (+ プロテアーゼ阻害剤) の 700 μ L を追加し、4 ° C で 15 分間サンプルをインキュベート渦サンプル 5 分ごとにせん断分離細胞、超音波発生装置 (30 秒パルス、30 秒一時停止) 最大電力での 3 × 10 分のクロマチン。
    1. ボリュームがチューブあたり 350 μ L を超えていないことを確認します。渦位相差顕微鏡によるサンプル 10 分間隔チェック残りの核溶解。
      注: 後で分析に最適なせん断結果 (図 1 bと比較) を得ることが重要です。クロマチンをせん断して他の方法を使用する場合、クロマチン フラグメントの 200-500 bp 間のサイズにせん断を最適化します。
  5. 10 分、13,000 × g、4 ° C の細胞残骸をペレットします。Preclearing ステップ 5.2 の上澄みを使用します。必要に応じて、後で使用するための-20 ° C でサンプルを凍結します。

4. ビーズと Preclearing の準備

  1. 0.02% を含む 1 mL の氷冷 PBS で 45 μ L 蛋白質 A 磁気ビーズ/チップと 20 μ L 磁気ビーズ/サンプルを洗って 3 回磁気スタンドを使用してトゥイーン。その後、ビーズに 1 mL の氷冷 PBS を追加します。
  2. 1 mL の氷冷 PBS、45 μ L ビーズ/チップ抗体/チップ (H3K79me2 またはウサギ IgG) 3 μ g を追加します。抗体をビーズにバインドする回転子の 4 ° C で 2 時間サンプルをインキュベートします。抗体によって 〜 3 μ g 抗体/チップを使用します。
  3. 1 mL の氷冷 PBS 0.02% を含むと抗体結合ビーズを 3 回洗浄トゥイーン。洗浄抗体結合ビーズに氷冷 PBS の (量の磁気ビーズ使用開始) 適切なビーズのボリュームを追加します。
  4. (容量 1,320 μ L) を preclearing のサンプルに希釈バッファーの 600 μ L と洗浄の磁気ビーズの 20 μ L を追加し、ローテーターの 4 ° C で 2 時間インキュベートします。磁気スタンドを使用してビーズを削除します。入力サンプルとして lysates の 5% (33 μ L) を取るし、-20 ° C でフリーズ

5. クロマチン免疫沈降

  1. Precleared エキスを分ける 2 つの管 (約 643.5 μ L)、抗体結合ビーズ (45 μ L/サンプル希釈バッファーの同じボリュームを追加H3K79me2 またはウサギ IgG)。ローテーター上で一晩 4 ° C でサンプルをインキュベートします。
  2. 4 ° C で回転で冷たいチップ バッファー 1、バッファー内蔵 2、10 分のバッファー内蔵 3 とビーズを洗浄します。その後、4 ° C で回転で 5 分間 TE バッファーで 3 回を洗ってください。
  3. 室温でシェーカーで 1,400 rpm で 1 h の溶出バッファーでビーズを溶出します。
  4. 入力サンプルに RNase チップ サンプルあたり (1 mg/mL) 10 μ g、5 μ g を追加し、37 ° C (1,400 rpm) で 30 分のサンプルをインキュベートします。
  5. 100 μ g, プロテイナーゼ K を追加 (20 μ g/μ L) あたりのチップ サンプルと入力あたり 50 μ g と 1,400 rpm 65 ° C で一晩インキュベートします。

6. チップ サンプルの精製

  1. チップと入力サンプル DNA の浄化を浄化キット (材料の表を参照してください)、マニュアルによると。DNA の以上 5 μ g が予想される場合より多くの浄化のコラムを使用します。キットで提供される DNA 溶出バッファーの 2 x 15 μ L のサンプルを溶出します。
  2. 可視化の蛍光体と、fluorospectrometer を使用して (1 μ L 使用) サンプルの定量化を行う (材料の表を参照してください)。

7. qPCR を介してチップ試料の分析

  1. QPCR 解析プライマー設計、統合ゲノミクス ビューアー (IGV) ブラウザー34から関心のゲノム配列を取得します。H3K79me2 はそこに位置する可能性が高いので、遺伝子の転写開始部位 (TSS) の周りのプライマーを設計します。コントロールとして考慮する非コーディング genomic 地域または地域約 10 Kb 上流 TSS または転写終了の下流 10 Kb のサイト (TES)。
    1. 製品サイズを 70 と 200 bp の間 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ とプライマーを生成し、最適な温度は 60 ° C のプリセット試作、 Aft4、Ddit3、 Scd1、 Aft3、およびNpm1 表1 ゲノム領域のプライマーを使用します。
  2. 次の qPCR プログラム、マスター ミックスと 58 ° C、63 ° C 間のアニーリングの温度勾配と新たに設計されたプライマーをテストし、最高の製品の数量と品質のアニーリングの温度を選択します。
    1. 予想される製品サイズを制御する DNA 電気泳動を適用します。QPCR 解析用リアルタイム PCR 検出システム (材料の表を参照してください)。
    2. 10 μ L の DNA ポリメラーゼのマスター ミックス、0.5 μ L プライマー前方 (10 μ M)、0.5 μ L プライマー リバース (10 μ M)、4 μ L ヌクレアーゼ フリー水、および 5 μ L の DNA を使用して、マスター ミックスを準備 (1 ng/μ L)。
    3. 2 ステップ qPCR プログラムを次のように使用: 95 ° C で 5 分間、50 x (30 95 ° c、30 秒 58-63 ° C で)、および 4 ° C で常に変性グラデーション
  3. (2 ng/μ L、1 ng/μ L、0.5 ng/μ L、0.25 ng/μ L、0.125 ng/μ L) のゲノム、せん断、精製された DNA のサンプルの希釈系列を作成し、qPCR を使用効率テストの 5 μ L を使用します。標準曲線の傾きを決定し、次の式によってプライマー効率を計算します。
    効率 (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100。
    1. プライマーを使用し 90% と理想的なケース、105% 間の効率の効率を 85% から 115% 以上。
  4. チップと入力サンプルを分析する適用 0.1 1 ng の DNA チップの混合それぞれ前方と逆プライマー、ヌクレアーゼ フリー水、および DNA ポリメラーゼ マスター ミックス各 qPCR 反応 20 μ L の最終巻。
  5. チップと入力サンプルのしきい値サイクル (Ct) を決定し、濃縮 (% 入力) で次の数式を計算する入力のサンプル Ct Ctの値を正規化します。Ct値がバック グラウンド レベルを決定する IgG のコントロールから取得しました。
    % 入力 = 100-2^(norm. 入力 − 規範。チップ)
    規範。入力 = Ct (入力) − ログ2(希釈倍率)
    規範。チップ Ct (チップ) − ログ2(希釈倍率) =
    注: 標準。= 正規化

8. シーケンスを介してチップ試料の分析

  1. チップ サンプル (入力と沈澱 DNA サンプル) をシーケンス処理施設に転送します。
  2. 配列を多重入力 DNA の ng と次世代インデックス ライブラリに沈澱 DNA のすべてが適切なライブラリ作成キット (材料の表を参照してください)、2 を変換ライブラリの事前使用を準備する、プラットフォームを示す (材料の表を参照してください)。
  3. 重要なステップ:キットの指示に従って、修復と dA 尾の DNA 断片を終了する (15 μ M の濃度で作業) とシーケンス アダプターを縛る。シーケンス アダプターおよび PCR のためのプライマーは適切な oligos (材料の表を参照) を使用します。この入力 DNA 量、結紮アダプター DNA 断片を豊かにするのに 6 9 PCR サイクルを使用します。
    注: 通常、結紮アダプター DNA のサイズ選択を実行する必要はありません。PCR 重複多くの PCR 増幅サイクル結果と高 GC バイアス以来、可能な限りいくつかの PCR のサイクルを使用することをお勧めします。
  4. 最後のライブラリ チェックの適切なデバイスのサイズ分布を可視化する解析の全反応の 0.5 μ L を取る (材料の表を参照してください)。定量化、fluorospectrometer またはその他の方法 (材料の表を参照) との組み合わせで可視化染料を使用します。
  5. H3K79me2 より大きいゲノム領域に広く広がって、いるヒストン修飾と思われるのでシーケンス、サンプル ペアエンド リード長さ 50 の bp と 75 澪読み取りのシーケンスの深さ。
  6. 銀河/ユニ フライブルク サーバー (galaxy.uni freiburg.de) とチップ seq データを分析します。
  7. FastQC と ChIPseq を取得した品質管理を実行し、必要に応じて、Bowtie2 バージョン 2.2.035トリミングの有無を直接割り当てます。Mm9 または最新バージョン mm10; を使用してゲノムのアセンブリ参照として参照アノテーション Ensembl FTP として 79 をリリースします。
  8. (省略可能) 削除ピーク呼び出す前にピカール MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) を使用して、複製を読みます。
  9. MACS2 バージョン 2.1.036 H3K79me2 の '広いオプションを使用してピークを呼び出します。
  10. チップと入力サンプルでは、読み取りの読み取りの数のログ2ログ2比を得るには、両方のサンプルの比率は、BamCoverage と BamCompare を使用します。
  11. その他詳細なチップ seq 特定分析適用 deepTools2 バージョン 2.3.5 または 2.4.137、すなわちチップを推定するカバレッジ トラック ファイル (チップのみ、入力にチップの比較のための bamCompare の bamCoverage) を生成するにはplotFingerprint を使用して、パフォーマンスと全般的な概要を生成するには、computeMatrix、plotHeatmap を使用します。K 平均 computeMatrix 処理中にクラスタ リング H3K79me2 分布によるとゲノム領域のクラスターを選択します。
  12. トライアル用 NCBI で堆積した E14.5 DT の H3K79me2 として公開チップ seq データの使用 (受入番号: SRP057733)。

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結果

神経前駆細胞の分離、培養、H3K79me2 チップ、チップの解析手法の一般的な方式:産後の段階で胚の脳の発達中の異なる時点で大脳皮質前駆細胞や小脳顆粒細胞前駆細胞の H3K79me2 チップを実行するフローチャートを図 1に示します。最初のステップとして、脳が分離して (E11.5 と E14.5) の間終脳や小脳 (P5 P7) が取得します。DT とバーモント州を分割して終脳の異なる領域を分析することが可能です。その後、組織が均質化、神経前駆細胞を分離します。今、前駆細胞の培養と DOT1L 阻害剤とそれらを扱うことが可能です。別の可能性は、前駆細胞を直接解決し、チップ プロシージャにすることです。チップ、クロマチンを 200-500 bp の断片にせん断・ H3K79me2 磁気ビーズ結合抗体とその後培養されます。ビーズを洗浄し、DNA を取得後、qPCR (図 1 a)、シーケンス処理によって、沈殿させた DNA...

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ディスカッション

ヒストン修飾、転写因子、ヒストン コード リーダー、作家、または消しゴムのゲノムの占有を検出するクロマチン免疫沈降を実行する 2 つの主要な方法があります。ヌクレアーゼ消化、ネイティブのクロマチン免疫沈降を用いたネイティブ チップであると、ヌクレオソームと他の DNA に接続されたタンパク質が DNA にしたバインドされて PFA 固定、せん断されたクロマチンを使用して提案手法39. その高い抗体検出率とネイティブのチップは、クロマチンからヒストンのメチル化の適用されるべきし、ヒストンのメチル化、チップ全体で比較的安定しています。だ開始材料の大規模な量が必要なので大脳皮質や小脳の開発を研究するため該当するマウスの脳細胞の数は通常限られています。抗体は一般に非固定材料に対して発生しますが、抗体は特にチップ qPCR 解析と immunoblots (図 2 a 減少 H3K79me2 信号に DOT1L リードの特異的阻害後に H3K79me2 を検出した事を証明できました、図 3 a

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

アンリエット ・ Bertemes は、ラボ内 CGN 栽培プロトコルを確立する支援を感謝いたします。このメソッドの紙は、DFG 資金 CRC992 医療エピジェネティクスによるテレビへの資金によって支えられました。著者はフライブルクの銀河チームのサポートを認める: 教授 Rolf Backofen、バイオインフォマティクス、アルベルト ・ ルートヴィヒ大学フライブルク、ドイツ共同研究センター 992 医療エピジェネティクス (DFG グラント SFB 992/1 2012) によって資金を供給、Björn Grüning Pavankumar Videmドイツ連邦教育省および研究 (BMBF グラント 031 A538A RBC (de。NBI))。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗GAPDH抗体 Abcamab8245Category: 抗体
略語/コメント: 免疫ブロット希釈率 1:5000
抗H3ab1791Category: 抗体
略語/コメント: イムノブロット希釈率 1:3000
抗H3K79me2ダイアゲノードpAb-051-050Category: 抗体
略語/コメント: ChIP抗体
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: 抗体
略語/コメント: イムノブロット希釈液 1:1000
抗ウサギ-IgGジアゲノードC15410206Category: 抗体
略語/コメント: ChIP Ctrl抗体
抗チューブリンαAbcamab108629Category: 抗体
略語/コメント: イムノブロット希釈液 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
略語/コメント: CCM
B27 Supplement (50x)ライフテクノロジー17504044Category: Cell culture
略語/コメント: CCMバイオアナライザーAgilent
テクノロジーの場合 G2940CACategory: ChIP
略語/コメント: せん断クロマチン
Bioruptor NextGenDiagenodeの分析B01020001Category: ChIP
略語/コメント: 超音波処理装置
ホウ酸pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: 細胞培養
略語/コメント: CPC培養用
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: 細胞培養
略語/コメント: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
略語/コメント: 磁気ビーズ、ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062用Category: DOT1L inhibition
略語/コメント: 細胞培養におけるDOT1L阻害の場合
エチレンジアミン四酢酸SERVA39760.01Category: ChIP
略語/コメント: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: 細胞培養
略語/コメント: CPC単離とCGM
グルコースSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
略語/コメント: CGNP単離用
グルタチオン(1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: 細胞培養
略語/コメント: CCM用
Glycine Carl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: 細胞固定用
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
略語/コメント: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank's Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
略語/コメント: HBSS
L-グルタミン (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: CCM
LamininSigma-Aldrichの場合L2020Category: Cell culture
略語/コメント: 塩化リチウムのCPC培養用
Sigma-AldrichL4408Category: ChIP
略語/コメント: LiCl
N2サプリメントLife Technologies17502048Category: 細胞培養
略語/コメント: CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
略語/コメント: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEB E7645SCategory: ChIP Analysis
略語/コメント: Library preparation
NEB次のマルチプレックスオリゴ for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library
Neurobasal mediumGibco21103049Category: 細胞培養
略語/コメント: CCM
NP-40代替カルバイオケムの場合 492016Category: ChIP
略語/コメント: ChIPバッファー
ホルムアルデヒドCarl Roth335Category: ChIP
略語/コメント: PFA、細胞固定用
ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
略語/コメント: PSN、CCMおよびCGM
リン酸緩衝生理食塩水Life Technologies10010023Category: Cell culture
略語/コメント: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA定量のための色素の可視化
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: 細胞培養
略語/コメント: CGNP単離用
ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩Sigma AldrichP3655Category: Cell culture
略語/コメント: 塩化カリウムを培養するCPC用
Thermo FisherAM9640GCategory: 細胞培養
略語/コメント: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
略語/コメント: ChIP
プロテイナーゼKSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
略語/コメント: ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
略語/コメント: DNA精製用キット
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
略語/コメント: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: 溶出バッファー
ナトリウムCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl、ChIPバッファー用
デオキシコール酸ナトリウムSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: ChIP
ナトリウム用ドデシルサルフェートカール・ロス183Category: ChIP
略語/コメント: SDS, ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
スーパーオキシドジスムターゼ (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: 細胞培養
略語/コメント: CCM
用 トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンカール・ロス9090Category: ChIP
略語/コメント: TRIS、ChIPバッファー
用 トリトンX-100カール・ロス・X100Category: ChIP
略語/コメント: ChIPバッファー用
トリプシン-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: CPC単離用
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
略語/コメント: ビーズ調製用
その他の実験装置:ノイバウアー計数室、インキュベーター、ローテーター、シェーカー、ダイセクションセット、ウォーターバス
CCM:皮質細胞培地
CGM:CGNP細胞培養培地
抗体 ズズ用 preparation パラの場合 用 用 塩化

参考文献

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

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