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方法論記事

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

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DOI:

10.3791/56690

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2017年10月18日

1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

この記事について

サマリー

線虫(C. elegans) は、軸索および細胞内輸送を勉強する良いモデルです。ここでは、生体内での記録と線虫における軸索と鞭毛内輸送の解析のためのプロトコルを述べよ

要約

軸索輸送および鞭毛内輸送 (IFT) 軸索と繊毛の形態形成と機能に不可欠です。キネシン スーパーファミリー蛋白質ダイニンは、それぞれ前向性および逆行の輸送を調節する分子モーター。これらのモーターは、レールとして微小管ネットワークを使用します。線虫(C. elegans) は軸索輸送および生体内でIFT を勉強する強力なモデル生物です。ここでは、私は生活の軸索輸送および IFT を観察するためのプロトコルを記述する線虫。輸送貨物は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) などの蛍光タンパク質を用いた貨物蛋白質に付けることで視覚化できます。線虫は透過的であり、貨物の GFP 付けられた蛋白質は細胞特異的発現プロモーターの下で特定のセルで表現できます。生きているワームは、殺害やワームを麻酔なし 10% の agarose のゲルにビーズで固定できます。貨物動きこれらの条件下で軸索と生活の繊毛で直接観測することができます郭清なしの線虫。このメソッドは、ターゲット蛋白質を変更することによりセルやセルで表現する貨物分子の観察に適用できます。最も基本的なタンパク質分子モーターなどと軸索輸送および IFT に関与しているアダプター蛋白質c. の elegansで保存されます。他のモデル生物と比較して、突然変異体を入手し、簡単にc. の elegansの維持します。このメソッドを組み合わせて様々 な線虫変異体は、軸索輸送と IFT の分子機構を明確化できます。

概要

生細胞イメージング、細胞内輸送を分析するために不可欠なツールです。神経細胞生物学の生きているセルイメージ投射軸索輸送の解析は神経機能と形態1を理解することに不可欠です。いくつかの神経変性疾患2軸索輸送の欠陥の根底にあります。ダイニンとキネシン スーパーファミリー蛋白質を運ぶと、逆行性軸索輸送 anterogradely をそれぞれ1,2。

繊毛は、別の細胞内コンパートメントに微小管ネットワークと人身売買の機械が高度3です。蛋白質の統合の機械装置が、繊毛のヒントに毛様体タンパク質を細胞質から運ばれなければならないことを意味する、繊毛でローカライズされていません。繊毛固有キネシンとダイニン、キネシン 2 と細胞質ダイニン-2、呼ばれるそれぞれ、繊毛の4鞭毛内輸送 (IFT)5と呼ばれる現象を利用した部品を輸送します。IFT の減損を引き起こす ciliopathies6と呼ばれる疾患のスペクトル。したがって、ライブセル イメージングによる IFT 機構の解析は、毛様体の形成と病態の基礎的メカニズムを理解する必要です。

線虫(C. elegans) は、軸索輸送および IFT7,8,9を勉強する良いモデルです。IFT を観察、クラミドモナスをモデル生物5,6として広く使用されています。クラミドモナスは単細胞生物、老化、神経機能の動作と IFT の関係の分析が困難でしょう。また、CRISPR/Cas9 など本質的な遺伝学的手法クラミドモナスに適用されていません。高等のモデル生物、ショウジョウバエ、マウスなどでしばしば軸索輸送と IFT の混乱が原因で致死の表現型の形態形成と、動物10の恒常性に欠かせない軸索輸送や IFT 11。マウスの場合、細胞培養とトランスフェクションが軸索輸送と多くのスキルや豊富な時間12,13を必要とする IFT を観察する一般的に必要です。さらに、多くの重要な生理学的なコンテキストは、培養細胞、細胞株の損失が発生します。軸索輸送や IFT線虫変異体が破壊され神経システムがワームの生存のために必須ではないので、ない致命的な7,9,14。軸索輸送および IFT 直接観測できる生体内で郭清なし線虫は透明なそれゆえに簡単に GFP 付けられたマーカーを観察するため。

麻酔16、またはビーズ17マイクロ流体デバイス15アガロースのパッドを使用するなど、線虫を動けなくいくつかのプロトコルがあります。麻酔の包含はニューロン15で人身売買イベントを禁じるかもしれない。マイクロ流体デバイスによる明確な欠点は、マイクロ流体デバイスの準備は、常に容易ではないです。代わりに、アガロース パッド、マイクロ ビーズへの固定化はc. の elegansのタイムラプス イメージングを実行する簡単な方法です。ここでは、私はc. の elegansを固定し、軸索輸送および IFT体内で可視化するこの基本的なプロトコルを記述する線虫。他の方法と比べて、ここで説明する方法は特別な装置を必要としないが安く、簡単に実行します。

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プロトコル

1 です。 サンプル準備

  1. 生成トランスジェニック c. の elegans 遺伝子導入方法論 18 を使用して興味のひずみ。また、線虫 の遺伝学センター (CGC) から適切な株を取得します。シナプス小胞前駆体の軸索輸送を視覚化する形質転換線 wyIs251 を使用して、[Pmig-13::gfp::rab-3] 7。IFT を観察するには、形質転換線 mnIs17 [osm 6::gfp] 19 を入手します。これらの系統はこのプロトコルで使用されます
    。 注: いずれか染色体外配列、ゲノムの統合またはも GFP ノックイン作品。バック グラウンド信号を減らすためには、細胞特異的発現プロモーターではなく、パン神経プロモーターを使用します
    。 注: ワームのメンテナンスは、他のプロトコルの 20 の説明です。系統は線虫の Escherischia 大腸菌 OP50 フィーダーの芝生の中 (NGM) 板 (1.7% (w/v) アガロース、50 mM NaCl、0.25% (w/v) ペプトン 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL コレステロール、25 mM KH 2 PO 4、1 mM MgSO を維持されました。60 mm 径プラスチック皿に 4) 20 ° c.
  2. 成長がワームのすべてのライフ サイクル ステージに NGM プレートに 20 ° C でワームします
    。 注: いずれかの任意の段階で軸索輸送および IFT を観察できます。これらの段階および視覚化された人身売買イベント 14 , 21 , 22 複数のパブリケーションを使用しているために、若い成人後期 L4 は良い肯定的な制御 、 23.

2。10% の Agarose

注: 多くのベンダーは、寒天、寒天粉末、アガロースなどの同様の製品を提供します。電気泳動グレード agarose を使用 (ゲル強度 > 1200 g/cm 2)。結果ゲルがワームを固定するには十分に強いではないため安い寒天粉末は機能しません

。
  1. ミックス 0.4 g アガロース 4 mL の蒸留水 (DW) ガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm)。蒸発を避けるためにガラス管にふたを置いた
    2. 。
  2. は、90 分の 95 ° C の熱ブロックにガラス管を置きます。さらに、別のガラス管 (1.5 cm × 10.5 cm) が DW でいっぱいを準備し、95 でそれを維持 ° C を入れて 95 ° C DW ( 図 1 A) パスツール ピペットで移しなさい。たくさんの小さな泡が agarose チューブに見られるし、ソリューションが混濁する必要があります。ソリューションが明確になるまでそれを残します。アガロース溶液が均一になるまで上下にピペッティングで混ぜます
    。 注: DW とアガロースゲルから作られたとき 10% アガロース溶液を準備する電子レンジは使用できません。電子レンジによる微小気泡は、アガロース融解を防止します。ただし、凝固の 10% の agarose のゲル溶かすことが簡単にできる電子レンジを使用しています。10% の agarose のゲルを含んでいるガラス管を事前に準備し、少なくとも 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます。そう場合は、必要なときに電子レンジを使用して素材を溶かすこのプロトコルの手順 3 から開始しています
    。 注: Agarose は徐々 に、長時間または繰り返し凝固と融解後 95 ° C で培養した場合を固める能力を失います。この場合、新しい 10% の agarose を準備します
    3. 。

3。アガロース パッドの準備

  1. 76 x 22 mm スライドの 10% の agarose の 2 滴を置く準備手順 2.2 で温めたパスツール ピペットを使用しています
    2. 。
  2. すぐに agarose ドロップする前に 2 番目の 76 x 22 mm 2 スライド カバー硬化アガロース溶液を平らにする 2 番目のスライドの下 の図 1 B、およびプッシュに示すよう。厚さは 0.5-1 にする必要があります mm
    3. 。
  3. すぐにフラッシュ パスツール ピペット ピペット 95 ° c DW 上下アガロース溶液を洗いまで。そうでなければ、ピペットが agarose のゲルを詰まりになります。95 ° C DW でピペット立っているのままにします
    4. 。
  4. 1 分待ちます。アガロース パッド形成し、曇りになります。次に、( 図 1 C) の手によって離れてスライドをスライドです
    5. 。

4。ワームの取り付け

注: ワームの動きを少量でもよい観察を防ぐため。レバミゾールは agarose パッド 24 , 25 でワームの動きを防ぐために伝統的に使用されています。しかし、レバミゾールは c. の elegans の神経受容体を阻害する、したがってニューロン 15 で人身売買イベントに影響を与える可能性があります。以下良い代替 17 ポリスチレン ビーズを使用して記述されている

。
  1. 摺動自在ミラー透視を搭載したステレオ顕微鏡、下 ~ 30 新しい NGM に適切なマーカーを表現するトランスジェニック ワーム プレート白金細線を用いた細菌を選ぶことがなく転送します
    。 注: プラチナ ワイヤー ピックの白金線とパスツール ピペット (5 インチ) で、白金線の先端が平坦化されました。プラチナ ワイヤー ピックの準備およびこれらのワームの処理、Wormbook (http://www.wormbook.org) で説明します
    2. 。
  2. プレートを残して 1 分の細菌が自動的に削除されますワームの表面からワーム移動細菌なし NGM agarose のゲルと
    3. 。 0.5 〜 1.0 を入れて
  3. μ L は、2.6 %100 nm 径ポリスチレン ビーズ水寒天パッド ( 図 1 D) 上でのドロップします。細菌無料 NGM プレートから、ミクロ粒子のニキビトリートメントに 10-20 ワームを転送します。ドロップとの重複を避けるために白金線を使用してワームを選択広がりワームの体 ( 図 1 E).
  4. 22 × 40 mm 2 coverslip ( 図 1 F) が適用されます。空気の泡を削除が、粉砕のワームを避けるために押し込みます。サンプルは画像の準備ができて、今
    。 注: ため、麻酔を投与すると、ワームが寒天パッド、ポリスチレン ビーズ、coverslip 17 によって生成された摩擦力だけで固定されます。フィーダーの細菌および/またはあまりにも多くのソリューションの存在が、摩擦力が弱いです
    。 メモ: 異なるサイズ coverslips (例えば 22 x 22 mm 2 18 x 18 mm 2) の動作します。ただし、大きい coverslips の浸漬水や観測期間中のサンプルに漏れ対物レンズから油を防ぐことができます
    5. 。

5。観測

注: 各顕微鏡システムとカメラの適切な撮像パラメーター (レーザー出力、利得、ビニング、等) は異なります。ここで、回転のディスク共焦点スキャナーとデジタル CCD カメラを搭載した広視野顕微鏡を使用します

。
  1. 20 ° c、ステージの温度制御を設定または 20 に部屋の温度を調整する ° C
  2. は、顕微鏡ステージ上サンプル スライドを置きます。100 x を使用 (開口数 = 1.3 またはより良い) 対物レンズします
    3. 。
  3. は、 図 2 A (wyIs251 軸索輸送の) または 図 2 B (mnIs17 と IFT) ポジティブ コントロールとして示されている領域を探す.よく 22 として他の分野を分析できます
    4. 。
  4. 設定パラメーター (CCD の利得 = 200、ビニング = 1 または 2、488 にレーザパワー nm = 1.0 1.3 mW)。マルチ TIFF 形式としてファイルの保存に 1 分の 4 フレーム/秒での時間経過の録音を実行します
    。 注: 場合は、GFP シグナルが消えるし、30 GFP::RAB 3 や OSM 6::GFP を観察していくことは困難だ s、レーザー パワーが強すぎます。その場合は、レーザー出力を下げます。逆に、小胞の動きが記録されていない場合、レーザー パワーが弱すぎます。その場合は、レーザーの力を高める
    5. 。
  5. は別のワームを観察し、5.3 および 5.4 を繰り返します。観測最大 20 分間続くことができますが、各ワームは p の影響を避けるために一度だけ記録する必要があります。鳳統損傷
    。 注: ワームは、重大な欠陥 7 , 27 , 28 なし、少なくとも 20 分間観察されています。長い観察の避難所が可能性があります ' t されてまだテストします。神経細胞死の明確な兆候は、神経突起の腫れなど神経細胞形態の変化です。GFP の微弱な信号は軸索と樹状突起で wyIs251 と mnIs17 の両方で見ることができる、神経突起の形態は軸索や樹状突起を見るだけで簡単にチェックできます。神経細胞の形態は、 図 2 に示します
    6. 。
  6. 映画ファイルを生成します。 フィジーのソフトウェアを使用して
    1. 開く複数の TIFF ファイルです。ファイルに移動 > オープン ステップ 5.4 で保存された TIFF ファイルを選択します
      。 メモ: フィジーは、jttps://fiji.sc でダウンロードできます。イメージ J とプラグインは、kymographs を生成する使用できます。そう場合選択したプラグインに関連する指示に従ってください
    2. をクリックして、" 長方形選択 " ボタン ( 図 3 矢印)、四角形を描画することによって関心のある分野を選択コンピューターのマウス ( 図 3 A の黄色の四角形)。画像に移動 > スタック > ツール > Substacks を作るし、ムービーに含まれているスライス番号を選択します。Substack が生成されます
      3. 。
    3. をクリックして substack のウィンドウをアクティブにして画像に移動 > 調整 > 明るさ/コントラスト。明るさとコントラストを調整するためのウィンドウが現れます。ウィンドウで、スライド上部バーの (最小) 右にバック グラウンド信号が消え、2 番目のトップ バーの (最大) 左にので、移動の小胞と粒子見ることができる背景の上に非常によくします
      4. 。
    4. 行く画像 > スタック > スタンパーの時間します。5.4 の手順で 4 フレーム/秒で、ムービーを記録すると、時間間隔は 0.25 s。したがって、入力 " 0.25 " 間隔で
      5. 。
    5. として保存] を選択して動画ファイルを生成する > AVI ファイル メニュー (ムービー 1 と 2).
      注: 適切なプラグインを使用して、することができますファイルを保存する他の形式としてなど " mpeg4 " または " mov " ファイル
      6. 。
  7. Kymographs を生成します。
    1. 再びフィジー ソフトウェアを使用して元のムービー ファイルを開くし、手順 5.6.2 と明るさとコントラストを調整する 5.6.3
      2. 。
    2. クリック " ラインを分割 " ( 図 3 B 矢印)。繊毛または軸索 ( 図 3 B で、黄色の線) に沿って分割線を描画、マウスを使用しています
      3. 。
    3. 行く分析 > マルチ Kymograph > マルチ Kymograph ( 図 3 C)。ライン幅ウィンドウ ( 図 3 D) が表示されます。型 " 3 " 線幅のウィンドウで OK をクリックして ( 図 3 D) です
      4. 。
    4. Kymograph ウィンドウが作成されます。TIFF または JPEG 形式で画像を保存します
      5. 。

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結果

DA9 ニューロンの軸索輸送
前向性および GFP::RAB 3 の逆行性軸索輸送wyIs251線を使用することができます同時に DA9 運動ニューロンに記録されます。前向性および近位背 DA9 ニューロン軸索における逆行性輸送の平均速度は約 1.8 2.6 μ m/秒、それぞれ22。移動小胞の数は 0.03 と s あたりの軸索の μ m あたり 0.018 についてです。したがって、DA9 軸索 100 倍レンズを使用しての 10 μ m の 30 s の観察、約 9 と 5 軸索 (図 4および映画 1) における小胞の移動を見つけることが 1 つ。小胞の動きを観察することができますないこそのレーザー出力が弱すぎます。長い範囲の実行に加えて小胞プールの短い範囲の動きをすることができます (映画 1) を記録しました。そこ

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ディスカッション

既存のメソッドに関して制限
ここで説明する方法は、軸索輸送や IFT など高速のイベントを観察に最適です。したがって、固定より長い潜伏よりも優先度は。我々 は重要な摂動なし、少なくとも 20 分間人身売買イベントを観察することができるされている、このメソッド適さない場合があります常に軸索伸長と細胞遊走などの長い観測を必要とする低速の出来事を観察します。長く観察 1 つ agarose の割合を減らすことによって条件を最適化する必要があります (すなわち損傷を引き起こす枯渇しつつあり、その潜在的圧力を減らすことを避けるために水を増やすこと)。また、副作用を慎重に評価する必要があります間、上記15または agarose パッドと麻酔を使用してワームの固定化マイクロ流体デバイスはより適切な16をするかもしれません。

プロトコルの中で重要なステップ
十分な観察のためのマーカーは重要です。マーカーは小...

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開示事項

著者は、何を開示します。

謝辞

著者は、彼女の役に立つ議論のため杉本亜砂子博士 (東北大学) を深く感謝します。wyIs251は、博士カン沈 (スタンフォード大学) からの寛大な贈り物だった。mnIs17は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この作品は、日本学術振興会科研費補助金 #17 H 05010 #16 H 06536 と第一三共の財団、脳科学財団と当財団によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
スライドグラス (76  x 26 mm)松波S1111
カバーガラス (22  x 40 mm)松波C024401
アガローズ和光318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micropolysciences#00876
ヒートブロックTAITEC0063288-000CTU-mini
顕微鏡オリンパスIX-71広視野顕微鏡
スピニングディスクスキャナー横河CSU-X1スピニングディスク共焦点スキャナー 
デジタルCCDカメラ浜松ホトニクスC10600-10BORCA-R2 デジタルCCDカメラ
対物レンズ(x100, NA1.4)オリンパスUPLSAPO 100XO
パスツールピペット (5インチ)IWAKIIK-PAS-5P
ガラス管 (直径1.5cm×10.5cm)岩城9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Laboratory of Kang ShenN/A
OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 は野生型と6回戻し交配されました
実体顕微鏡Carl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
ミラー透過照明ユニットCarl Zeiss435425-9010-000
プラチナ線 (0.2 mm)Nilaco Corporationm78483501
60 mm プラスチック皿Falcon#351007
FijiN/AN/A
線虫増殖培地 (NGM)  1.7% (w/v) アガロース、50mM NaCl、0.25% (w/v) ペプトン、1 mM CaCl2、5 mg/mL コレステロール、25 mM KH2PO4、1 mM MgSO4 
電機 https://fiji.sc/

参考文献

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