方法論記事

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

DOI：

10.3791/56693

⸱

2018年2月22日

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1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

この記事について

サマリー

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このプロトコルを記述する外国蛋白質を表現するまたは潜在的な外国蛋白質とその切り捨てられたのアミノ酸の抗アポトーシス活性を評価に使用することができます熱衝撃によるタンパク質発現システム (pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システム)昆虫細胞での酸。

要約

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一過的遺伝子発現系は、細胞培養システム培養バキュロ ウイルスのタンパク質機能解析を実行するための最も重要な技術の一つです。このシステムは、エクスプレス遺伝子一過性発現プラスミドの baculoviral プロモーターの制御下に開発されました。さらに、このシステムは、バキュロ ウイルス自体または外国蛋白質の機能アッセイに適用できます。最も広く、商業的に利用可能な一過的遺伝子発現系は、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいて開発です。ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベルが認められました。したがって、一過的遺伝子発現系が蛋白質の表現を改善するため建設されました。このシステムは、組換えのプラスミッドはショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターの制御の下でターゲット シーケンスを格納する建設されました。このプロトコルはこの熱ショック ベース pDHsp/V5 渓 (6 ヒスチジンと V5 epitope) のアプリケーションを提示/ハスモンヨトウ frugiperdaセル (sf9 細胞) システム;このシステムも候補タンパク質を昆虫細胞での抗アポトーシス活性を評価するための遺伝子発現だけでなく、利用可能なです。さらに、このシステムは、組換えプラスミドの 1 つをどちらか導入することができます。 または昆虫細胞の 2 つの潜在的機能的拮抗組換えのプラスミッドを co transfected。プロトコルはこのシステムの効率性を示しますこのテクニックの実践事例を提供しています。

概要

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2 つの蛋白質の表現システムは、タンパク質を生成するためよく使用されている: 原核生物の蛋白質の表現システム (大腸菌発現系) と真核生物の蛋白質の表現システム。1 つの人気のある真核生物のタンパク質発現系は、バキュロ ウイルス発現ベクター システム (BEVS)1です。バキュロ最初農業の世界の生物的制御因子として使用された森林害虫と。最後の数十年で、バキュロ蛋白質発現ベクターと同様にバイオ テクノロジーのツールとして開発されました。バキュロのゲノムは二本鎖の環状 DNA とエンベロープのヌクレオカプシド2から成っています。までに、七十八バキュロ ウイルスより分離シーケンス3をされています。宿主昆虫細胞における baculoviral 遺伝子発現の時空間のカスケードを基に、遺伝子の転写が即時初期遅延初期、後期、および非常に遅い遺伝子4を含む 4 つの一時的なカスケードに分類できた。

BEVSs は、非常に遅い遺伝子プロモーター (すなわち、多面体または p10 プロモーター) ドライブ ターゲット遺伝子の組換えバキュロ ウイルスの相同組換えによって生成されたときに使用されたので、示されました。組換えバキュロ ウイルス昆虫細胞の異種蛋白の発現は哺乳類 (糖タンパク質生産に適しています) ポスト翻訳の修正蛋白質のそれに似ています。したがって、バキュロは広く使用されている5,6,7をされています。ただし、制限が 1 つ異なる昆虫細胞7N グリコシル化反応経路の存在であります。

したがって、新しいバキュロ ウイルス発現系、一過的遺伝子発現系が開発されました。このシステムは、昆虫細胞での baculoviral 即時初期プロモーター (すなわち 1プロモーター) のドライブの下で外来遺伝子を表現します。このシステムを使用して、ターゲット蛋白質すぐに表現できますすなわち 1プロモーターの制御下で良い N 型糖鎖7昆虫細胞で N グリコシル化反応経路を変更中。また、baculoviral 即時初期遺伝子は宿主細胞の RNA ポリメラーゼ II による転写は、活性化4の任意のウイルスの要因を必要としません。そのため、短い時間内の昆虫細胞で外国蛋白質を表現できます。までに、非定常遺伝子発現システムは細胞培養システム培養バキュロ ウイルスの蛋白質機能の試金を実行するための最も重要な技術の一つです。システムは、バキュロ ウイルスまたは外国蛋白質の機能を解析に適用できます。市販の一過的遺伝子発現系の 1 つは、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) (OpIE2 と OpIE1 プロモーター) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいています。

ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベル頃まだ問題オピー プロモーターを用いた一過的遺伝子発現系に使用される8,9,10。したがって、別の一過的遺伝子発現系では、ショウジョウバエ熱衝撃蛋白質 70 (hsp70) 遺伝子8,9のプロモーターに基づいてを構築されました。Hsp70 のプロモーターは IE baculoviral プロモーター昆虫細胞10熱ショックによる場合よりも効率的に動作します。このシステムでターゲット遺伝子はショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターのドライブの下で表現されました。外来遺伝子を PCR クローニング法による一過的遺伝子発現プラスミドに簡単に複製することができます。さらに、熱衝撃誘導による遺伝子発現のタイミングの制御を実行できます。

本報告では、我々 のアプローチに従うし、熱ショックによる一時的なタンパク質発現系を用いた baculoviral 遺伝子 (3 アポトーシスの阻害剤強 xylina MNPV からiap3 ) の 3 つの異なる切り捨てを表現し、さらに抗アポトーシス活性の解析にこれらの表現された蛋白質を適用します。このシステムは外国蛋白質を即座に表現することができますいずれかまたは他のタンパク質の活性測定法に適用する可能性もしながら sf9 細胞におけるタンパク質抗アポトーシス活性の評価に適用可能します。

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プロトコル

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1. 準備

  1. 昆虫の細胞培養
    1. 細胞培養液の 50 mL を準備します。この操作を行うには、抗生物質の 500 μ L を追加 (アムホテリシン B = 0.25 μ g/mL、ペニシリン 100 単位/mL、ストレプトマイシンを = = 100 μ g/mL) と熱不活化の牛胎児血清 (FBS または抗生物質) なし無血清培の 5 mL。
      注:使用する前に水のお風呂に 30 分の 65 ° c ウシ胎児血清を加熱します。
    2. ハスモンヨトウ frugiperdaを維持 (鱗翅目: ヤガ科)、sf9 昆虫細胞。外し約 25 cm2細胞培養用フラスコ細胞の 80% フラスコを振ることによって、光学顕微鏡下でチェックします。新しい 25 cm2細胞培養用フラスコ、細胞懸濁液の 50% を転送し、室温で 15 分間付けるセルを許可します。5 mL の新鮮な細胞培養培地媒体に置き換えるし、28 ° C の定温器で育つ通路の細胞細胞の増殖によってすべての 2 〜 3 日。
  2. セルの transfection のためのプラスミッドの準備
    1. Pcr クローニング法11pDHsp/V5 彼にターゲット DNA のフラグメント (例えば、強 xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3遺伝子とその削除構成要素) を挿入します。チェックのコロニーによって変換されたコロニーの成長 PCR マスター ミックス (2 X) と pDhsp F2/Op IE2R プライマーを用いた PCR を設定します。商業シーケンス サービスによってプラスミッド シーケンスを確認します。
      注:表 1は、PCR および対応する構造のために使用されるプライマーを示します。
    2. 文化単一シーケンスされた細菌のコロニーの 200 mL の LB 培地を含む上記プラスミド構築 (ステップ 1.2) を含んでいる抗生物質 (50 μ G/ml) をそれぞれ選択。
    3. 製造元の手順12によると Midi プラスミド キットを使用して培養されたエシェリヒア属大腸菌からのプラスミドを抽出します。
  3. 1.5 mL の細胞培養用培地、細胞の無血清培養液の 8.5 mL を混合することによってメッキ媒体を準備します。
  4. 細胞培養培地 10 mL に ActD 株式 (1 mg/mL) の 1.5 μ L を追加することによってアクチノマイシン D (ActD) 細胞培養培地を準備 (最終濃度 = 150 ng/mL)。4 ° C でのストア

2. タンパク質の一過性発現

  1. 細胞播種
    1. Sf9 細胞を培養用フラスコを振ることによって収穫、打倒し 50 mL のチューブに細胞懸濁液を落ちるし、P10 ピペットで 10 μ L を検定に転送します。光学顕微鏡の下で細胞の数をカウントします。
    2. 室温で 15 分間 24 ウェル プレートの各ウェルに 3 × 105 sf9 細胞をプレートします。0.5 ml 播種培地の培地を交換してください。
  2. プラスミドのトランスフェクション
    1. 希薄細胞のトランスフェクション試薬: 100 μ L 細胞の無血清培養液と 1 のボルテックスでミックスの細胞のトランスフェクション試薬の希釈 8 μ s。
    2. 1 ボルテックス 2 μ g のプラスミド DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-彼または pDHsp70 Ly-IAP3-リング/V5-渓) 細胞の無血清培養液とミックスの 100 μ L に追加 s (図 2)。
    3. 希釈したプラスミド DNA と希薄化後細胞のトランスフェクション試薬 (210 μ L) を組み合わせるし、室温で 30 分間 1, 加温のボルテックスでミックスします。
    4. P1000 ピペットで滴下セルに DNA トランスフェクション試薬混合物 210 μ を追加します。5 h 28 ° C の孵化させなさい。
    5. P1000 ピペットを使用して細胞培養液 0.5 mL でメッキ媒体を交換してください。テープで 24 ウェル プレートをシールし、28 ° C 16 h でセルを孵化させなさい。
  3. 熱衝撃 transfected セル: (水の表面に浮かんで) 42 ° C の水浴に皿を置きます。30 分間加熱し、28 ° C の定温器に 24 ウェル プレートを返します。
  4. 蛋白質の表現の検出
    1. 1 h、5 h 熱ショック後 0.5 ml の 1 x PBS バッファーのセルを簡潔に 3 回洗います。
      注: は、9 mL の滅菌 ddH2O に 1 mL の 10 x PBS バッファーを追加して PBS バッファー PBS バッファー x 1 x 10 を希釈します。
    2. 上下にピペッティングして SDS のローディングの染料 × 1 の 40 μ L で細胞を溶解させます。
      注: は、30 μ L の PBS バッファー x 1 と 4 x SDS サンプルバッファーの 10 μ L を混合することによって SDS 読み込み染料 × 4 を希釈します。
    3. 熱ブロックで 10 分間 98 ° C で蛋白質のサンプルを加熱、1 分のスピン ・ ダウンと西部のしみの試金のための氷の上に置きます。
    4. 西部のしみの分析
      Eslami ルハン13から西部のしみの分析の手順に従います。SDS ページのゲルの14を実行: ブルー染色 (もそれぞれに読み込まれた蛋白質のサンプルの量が量で等しいことをチェックするためのロード コントロール) を受ける 1 つのゲルおよびその他の西を受ける Eslami、ルハン13 によると、アッセイのしみ.
    5. ヤギ抗うさぎ IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役 (0.8 mg/mL) (1:10000 作業に TBST バッファーで希釈ウサギ抗 V5 抗体 (5 mg/mL) (濃度 1 μ G/ml の作業に TBST バッファーで希釈 1: 5000) と V5 タグ融合タンパク質を検出します。濃度 0.08 μ g/mL)。
      注:17.5% ポリアクリルアミドゲルの割合を調整するときするタンパク質の分子量 < 17 kDa。

3. 抗アポトーシス活性測定法

  1. 遺伝子による細胞アポトーシス: 2.1 から 2.3 まで前述の手順を繰り返します。共同 transfect 1 μ g のプラスミド DNA の 1 μ g と pDHsp/D-rpr/フラグ-彼プラスミド DNA (含むアポトーシス誘導遺伝子) の [pDHsp70/V5 彼ベクトル (マイナス コントロール)、pDHsp70-Ac-P35/V5-彼の (肯定的な制御) pDHsp70 Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70 Ly-IAP3-BIR/V5-渓pDHsp70、Ly-IAP3-リング/V5-彼のまたはそれぞれ。]。5 時間後の熱ショック処理、セル実行可能性の試金 (図 2) を行います。
  2. 化学的に誘導アポトーシス: 2.1 から 2.3 まで前述の手順を繰り返します。2.1.2 ステップ 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 x 106 sf9 細胞をプレートします。4 μ g のプラスミド DNA を transfect [pDHsp70/V5 彼ベクトル (マイナス コントロール)、pDHsp70-Ac-P35/V5-彼の (肯定的な制御) pDHsp70 Ly-IAP3/V5-彼、pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-彼または pDHsp70-Ly-IAP3-リング/V5-彼、それぞれ。]。5 時間後の熱衝撃で ActD 細胞培養培地の 16 h の 2 mL と sf9 細胞を扱い、セル実行可能性の試金 (図 2) を行います。
    注:6 ウェル プレートの 1 つの井戸をカバーする最小量は 1 mL です。
  3. トリプリケートの 3.1 と 3.2 を含む、上記の抗アポトーシス活性アッセイ実験を実行します。

4. セル実行可能性の試金

  1. 3 回 1 mL の 1 分の 1 の x PBS バッファーを追加することによって扱われた細胞を洗浄します。0.04% トリパン ブルー色素を含む 1 mL 1 × PBS バッファーをピペッティングにより細胞を再懸濁します、室温で 3 分間染色します。1.5 mL マイクロ チューブに細胞懸濁液を転送します。
    注:1 x PBS バッファーと 1 mL 0.4% トリパン ブルー溶液 9 mL を混合することによって 0.4% トリパン ブルー溶液を希釈します。
  2. P10 ピペットの検定を 10 μ L トリパン ブルー染色細胞懸濁液を転送し、光学顕微鏡下で実行可能なそのままセルをカウントします。
  3. 統計解析
    1. 記録されたデータを計算し、カウントのすべての平均 ± 標準偏差として存在します。
    2. スチューデントの両側 t 検定によって Microsoft Excel を使用してデータを分析します。統計的に有意なデータをPとして定義の値 < 0.05。

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結果

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フルの長さと他 2 つ切り捨て (BIR とリング ドメイン) LyxyMNPV から Ly IAP3 のしたで過剰に発現 sf9 細胞、熱衝撃による pDHsp/V5-彼に基づく/ハスモンヨトウ frugiperdaセル (sf9 細胞) システム。PDHsp/V5-彼含まれているショウジョウバエ熱ショック蛋白質プロモーターで、42 ° C 状態の温度で細胞の転写因子と翻訳システム (図 1)8 を使用して下流遺伝子の発現をドライブ、9,11。技術全体のフローチャートを図 2に示します。1 h、5 h 熱ショック後細胞蛋白質のサンプルバッファーと分離し、タンパク質の発現を確認する西部のしみの分析を受けます。1 時間または 5 時間後...

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ディスカッション

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熱ショックを利用した pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システムの概念は、最初 1994年8クレムらによって記述されていた。Baculoviral 遺伝子プロモーター (IE1) とショウジョウバエ hsp70の比較を示したそのhsp70蚊細胞10でより高い効率を持っていた。さらに、正確に熱ショック処理後、熱ショック誘導によるタンパク質発現のタイミングを制御できます。このシステムはエビと核 (NPV) の蛋白質機能の試金を申請した IAP 蛋白質9,11。このプロトコルでは合計 6 プラスミッドの構造が使用された: 3 (pDHsp/V5 彼、pDHsp/Ac、p35/V5-彼のおよび pDHsp/D-rpr/フラグ-彼) は建宏ルー9、および他の 3 つの構造 (pDHsp-iap3/V5-彼、pDHsp、...

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開示事項

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

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博士建宏ルー 3 プラスミドの構造を提供する国立台湾海洋大学海洋生物研究所に感謝いたします。この研究によってグラント 106-2311-B-197-001 - 科学省から技術 (ほとんど) に対応しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗生物質-抗真菌剤、100XGibco15240-062昆虫細胞培養用
認定された胎児ウシ血清Bioind04-001-1A
Sf-900 II SFMサーモフィッシャー10902096無血清細胞培養培地
Sf9 細胞ATCCCRL-1711
25cm2 細胞培養フラスコNunc、サーモフィッシャー156340
倒立型光学顕微鏡WHITEDWHITED WI-400
RBC HIT コンピテントセルバイオマンRH618-J80Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)BiomanLBL407
寒天、細菌学グレードBiomanAGR001
ZeocinInvitrogenant-zn-1selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)ThermoFisherK0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)GeneaidPIE25
Actinomycin DSIGMAA9415
Corning 50 mL 遠心分離チューブSIGMACLS430829-500EA50 mL チューブ
血球計算盤Gizmo Supply CoB-CNT-SLDE-V2
24-wellMultidish Nunc, Thermo Fisher14247524-well plate
Cellfectin II 試薬Thermo Fisher10362100Cell Transfectin Reagent
PBS-Phosphate-Buffered生理食塩水(10X)pH 7.4モフィッシャーAM9624
4回;SDS ローディング色素BiomanP1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)Merck MiliporeIPVH00010PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell systemBIO-RED1703930Blotting device
Ponceau S solutionSIGMA6226-79-5
Anti-V5SIGMAV8137rabbit anti-V5 antibody
ヤギ抗ウサギIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)ジャクソン111-035-003
Tween 20Merck817072
6-Well MultidishNunc, Thermo Fisher145380
0.4% トリパンブルー溶液AMRESCOK940-100ML
P10 pipetmanGilsonF144802
P1000 pipetmanGilson
テープSymbioPPS724 ウェルテープ ( 19 mm×36メートル)
サーF123602

参考文献

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  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

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