クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

サマリー

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。

要約

クロマチン拡散技術は、配偶子、精子形成に特に様々 なタンパク質の動的局在を評価するために広く使用されています。これらのテクニックのシナプスと DNA 修復減数分裂において相同染色体対など中タンパク質と DNA の局在パターンの可視化を可能にします。いくつかのプロトコルは、文献に記載されている、哺乳類前期卵子を使用して一般的なクロマチン拡散技術が限られており、胎児の卵巣で減数分裂の開始のタイミングが難しい。比較では、前期の精母細胞はマイクロダイ セクションを必要とせずに高い利回りと少年の雄マウスから収集できます。しかし、少年と成人の精巣における減数分裂と後減数分裂生殖細胞集団の不均一性による特定の段階のセルの純粋な同期された人口を得ることが困難です。減数分裂の後の段階、卵母細胞成熟卵母細胞のグループは成熟雌マウスから収集および文化で減数分裂を再開する刺激できるので (mi) または減数分裂 II (MII) 減数分裂を受けてを評価すると便利です。ここでは、卵母細胞減数分裂クロマチンを広める準備法、胎児から新生児に解剖し、大人卵巣は、ビデオのデモを伴う説明。哺乳類卵母細胞の染色体紡錘イベントは、MI の間に特に頻繁に。行い卵形成の段階でさまざまな異なる突然変異や環境の露出の効果を特徴付けるこれらのテクニックを使用できます。内に記述された技術が減数分裂期哺乳類の卵形成過程の理解と染色体・ タンパク質ダイナミクスの性的に二形の機能を向上させる貴重なは配偶子形成の間の明確な相違点があると.

概要

精子、中に思春期と成人¹発症時精巣生殖細胞の減数分裂の大波は準同期を急速に継続的に補充されます。男性とは対照的女性で減数分裂が胎児の発育中にのみ開始されます。誕生、次卵母細胞のまま前期の長期 dictyate 段階で逮捕された私は、そのまま卵核胞 (GV; 核膜) 思春期まで。思春期の発症時は、卵母細胞のサブセット周期的成長と成熟、減数分裂再開の開始をマークを受けることが選択されます。完全育てられた卵母細胞の減数分裂再開は胚胞崩壊 (GVBD) として知られているプロセスの GV の消失によって明示されます。卵母細胞は、染色体凝縮と極体押出続く分離を経る。卵母細胞は MII への進行時に逮捕になるし、が受精後にのみ 2 番目と最終的な減数分裂を完了する刺激されます。

雌の受胎は減数分裂前期の成功に大きく依存私進行。このための鍵は、物理的なリンケージを介したクロス オーバー組換え²を介して誘導の DNA 二重鎖切断 (Dsb) の修理 chiasmata として知られている相同染色体間の形成です。このプロセスは、そのシナプス³を容易にする相同染色体の間を形成する減数分裂 (SC) として知られている動的タンパク質豊富な足場のコンテキスト内で発生します。SC はジッパーのような三者構造中部の蛋白質によって接続されている 2 つの平行横要素から成る継続的な DNA 修理を通して一緒に同族体を保持しています。シナプス前、軸の要素と呼ばれる外側の要素の前駆体姉妹染色分け体を形成します。SYCP2 など SYCP3 減数分裂タンパク質は、初期前期中には姉妹染色分け体結束軸 colocalize 軸の要素を形成します。これらの後結合横フィラメント蛋白質、SYCP1 は、容易にアセンブリ中心的な要素と一直線に並べられた同族体⁴の間のシナプス部位として機能します。マウス卵母細胞の完全なシナプスによって示されます 20 の存在完全に準備を広げる重複 SYCP3 と SYCP1 のストレッチ、クロマチンを使用して視覚化することができます。シナプスが完了するという同族体間フォーム chiasmata を宛先とする成熟したクロス オーバーが飾られて mutL 相同物 (MLH1/3) ダイマーの正確な処理^5,6を促進するために pachytene サブステージに入る時に^,7. コヒーシン、コンデンシン、複雑な SMC5/6 など染色体 (SMC) 錯体の構造のメンテナンスが減数分裂^{8,9、全体構造と染色体ダイナミクスの制御のために重要 10、11,12}。総称して、これらのイベントは紡錘体極次の SC の解体に反対する相同染色体の適切な双方向を確保します。

減数分裂の細胞周期は、ゲノム維持プログラム誘導と発癌の後続の修理のための様々 な蛋白質の役割について検討する強力なモデルです。さらに、哺乳類の減数分裂も、エピジェネティック修飾と刷り込み¹³の研究に関連するモデルです。ただし、女性減数分裂 (図 1) の哺乳類の胎児・新生児の卵巣で行われるこれらのイベントを評価するために技術的に困難です。前期 5 サブステージを分かれますことができます: leptonema、zygonema、pachynema、diplonema、dictyate。ここで、分離および胎児・新生児の卵巣と精巣 (図 2) を区別する方法をについて説明します。上記の方法から適応、この原稿も女性減数分裂前期の準備のためのビデオのデモとプロトコル (手順 1) の概要私クロマチン広がる^14,15,16,17.このプロトコルにより前期の詳細なミクロ分析、immunolabelling、6-7 の手順で説明したようとつながれたとき私卵母細胞でのイベント。

卵はエラーを起こしやすいと第一減数分裂時に染色体紡錘イベントを表す子孫^18,19の遺伝病の最も一般的なソース。本稿では (プロトコル手順 2)、GV 段の成熟した卵子を成熟雌マウスの発動を促された卵巣から抽出しプロトコルについて述べる.支持条件の下では、完全育てられた卵母細胞は黄体形成ホルモンに依存しない次の分離と培養²⁰減数分裂の再開を受けます。減数分裂の再開後卵母細胞は減数分裂を経て進行し、中期 II で逮捕。卵母細胞は限り受精.中期 II で逮捕されました。手順 2-5、以前に報告されたプロトコルの収集、文化およびクロマチンを広める準備²¹MI と MII 卵子を準備する方法を説明するビデオ デモを適応させます。技術を広めるこのクロマチン染色体に関連付けられている蛋白質の明確な immunolabelling が可能です。さらに、このプロトコルし一価、二価染色体を区別するためにも使用できます、さらに単一の妹を解決できる卵母細胞の倍数性の評価を容易にする染色分け体。したがって、減数分裂タンパク質の局在パターンを明らかに加えこのプロトコルも MI と MII の間に染色体紡錘の潜在的な原因を解明するための非常に貴重なツールとして使用できます。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。野生型 c57bl/6 j マウスの実験を行った。

1. 収穫前期クロマチンの作製と胎児または新生児の卵巣に広がる

1. 14.5-19.5 日のポストの coitum (dpc) で胚を抽出するには、頚部転位または CO₂窒息 IACUC ガイドラインによると妊娠中の女性を犠牲に。
   注: 生後 1-5 卵巣 1.3 のステップに進みます。図 1は、胎生期および出生後隔世で濃縮減数分裂前期段階をまとめたものです。
2. V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。母体の子宮角を分析、胎盤から胚を分離・ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 37 ° C で x に予め温めておいた 1 の 3 mL を含む 35 mm のペトリ皿に胚を転送
   注: 37 ° C で設定 fliptop インキュベーターは、温度を維持するために使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵巣の操作中に温度を維持するためにも使用できます。
3. 3.5 インチ手術ハサミ胚または IACUC ガイドラインに従って斬首を通して子犬を犠牲に。さらに郭清する前に予め温めておいた PBS に首のない胚または子犬を配置します。
4. 37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む別の 35 ミリメートルのシャーレで一度に 1 つの胚または子犬を解剖します。前肢の下と後脚と尾図 2A-Bに記載されている上直接前方半分に沿って、胚の後部の半分の腹側正中線に沿って切断することによって進みます。
5. 3.5 インチ手術用はさみを使って腹部を開きます。転置または肝臓や腸、37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に卵巣を公開のループを削除する細い鉗子を使用して (図 2 bにガイドを参照してください)。卵巣はすぐ下および腹腔内 (図 2 b-C) の後部壁に向かって腎臓の後ろにあります。男性と女性の生殖腺の差異化のためのガイドは、図 2 Dで提供しています。
   注: 最適な条件の急速に解剖卵巣を妊娠中の女性が犠牲になる後。
6. 郭清範囲と時計メガネの場所の下の細いピンセットのペアを使用して各女性胎児から両方の卵巣を削除または複数の井戸の別の井戸に予め温めておいた PBS の含む 0.5 〜 1.0 mL をプレートし 37 ° C で維持
7. きれいな時計ガラスまたは卵巣 comp を浸すようにして 9 ウェル プレートの小さな井戸に、0.5 mL ハイポ抽出バッファー (17 mM クエン酸ナトリウム二水和物、ショ糖 50 ミリメートル、5 ミリメートルの EDTA、0.5 mM DTT、30 mM トリス-HCl、プロテアーゼ阻害剤、pH 8.2) に卵巣の各ペアを配置します。letely。しかし、少なくとも 15 分間、30 分以上を孵化させなさい。
   注意: は、新鮮なハイポ抽出バッファーを作成し、DTT 添加の 2 時間以内の使用します。
8. 疎水性障壁の PAP のペンを使って、インキュベーション中に図 3Aに示すように、きれいなガラス 25 x 75 mm²、1 mm 厚の顕微鏡スライド上 2 22 x 22 mm²の正方形を描画します。
   注: スライドは、早めに準備することができます。
9. きれいなスライドに 100 mM ショ糖の 45-50 μ L をピペットし、ドロップする卵巣の 1 つのペアを転送します。
10. 2 つの 27 G 針の鋭い端を使用して、ショ糖液に細胞を放出する卵巣を離れてをいじめます。鉗子、卵巣の大きい部分を取り外し、慎重に細胞を分散させるためにショ糖溶液をピペットします。
11. 固定液の場所 40 μ L (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.2% 洗剤 (材料の表を参照)、pH 9.2) 準備されたスライドのそれぞれの正方形。200 μ l ピペット チップのスライド表面に固定液を均等に します。
12. 定着剤を含むスライドのそれぞれの正方形の上にショ糖ミックスの 20 μ L をピペットします。
    注: これは卵巣スライドごとの 1 つのペアを使用してに相当します。
13. 一晩室温で湿気の多い密室でスライドを孵化させなさい。
    注: 一晩インキュベートを範囲で指定できます (12-15 時間) 室温で。
14. 室ふたを開き、完全に風乾するスライドを許可します。
15. 0.4% 湿潤剤 PBS 溶液 50 mL を含む Coplin jar 内のスライドを洗う 2 min のため空気が乾燥、(材料の表を参照)、immunolabelling プロトコル (手順 6) に進んでください。
    メモ: 後で使用するため-80 ° C でスライドを保存することがありますがこれは興味の蛋白質によって異なります。最適な結果を得るのためには、immunolabelling プロトコル (手順 6) にすぐを進みます。

2. 中期私採卵

1. それぞれのマウスから分離したから胞状卵胞の数を最大にするには、5 IU 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG、として知られている馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG)) の性的成熟の処女雌マウス腹腔内注入します。
   注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。PMSG を準備するには、溶解 5,000 IU の-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で滅菌 PBS (5 U/0.1 mL) ストアの 100 mL ボトル
2. 44-48 時間後準備コレクション中、最小必須培地アルファ (MEMα) 培 5% ウシ胎児血清 (FBS) と 3 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA;MEMΑ/BSA/FBS)。0.2 μ m 孔フィルターを通してメディアを滅菌します。MEMα/BSA/FBS マウスごとの 1 つのガラス皿に中小 5% CO₂インキュベーターで 37 ° C に暖かいの 2.5 mL をデカントします。
   注: 他のコレクションや、市販 (M2 と M16) 文化メディアもよく使用されますように。
   注意: 操作手順中に周囲の空気露出を最小限に抑えるために限られた期間のための時間で 1 つ 5% CO₂インキュベーターから培養皿を削除することをお勧めします。
3. 頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO₂窒息を介してマウスを犠牲に。
4. 大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角; を検索します。卵巣は胸郭に近位現在します。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵管を押しながら微細鉗子の別のセットの MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に滑液包と場所から卵巣をリリースし続けます。
   注: 手順 1、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO₂で維持することが不可欠です。温度と CO₂のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO₂ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。
5. 27 ゲージ針 (または同じようなサイズ) 1 mL 注射器を使用して手動で大きいから胞状卵胞を穿刺によって卵丘卵子複合体をリリースします。
6. 解剖顕微鏡で観察しながら手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用して GV 段卵母細胞を収集します。のみから胞状卵胞からリリースされている卵を収集します。GV 卵子は約 90 の直径を持つ μ m GV 卵母細胞顆粒膜細胞の 2-3 層に囲まれています可能性があり、合計約 200 μ m の直径を持ちます。
7. きれいな時計ガラスまたは中期に到達する 6 時間 MEMα/BSA/FBS 媒体を含んでいる 9 ウェル プレートの卵母細胞を培養 5% CO₂インキュベーターで 37 ° C で私。
8. 手順 4 に進みます。

3. 中期 II (MII) 採卵

1. それぞれのマウスから分離した卵母細胞を最大にするには、5 IU PMSG の性的に成熟した処女雌マウス腹腔内注入します。44-48 時間後 5 IU ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の腹腔内注入します。
   注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。HCG を準備する溶解ボトル 200 mL の PBS に 10,000 U (5 U/0.1 mL)。-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で保存します。
2. 12-14 時間後 2.2 の手順で上記のよう MEMα、BSA、FBS コレクション媒体を準備します。
3. 頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO₂窒息を介してマウスを犠牲に。
4. 大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角を見つけて、卵巣は現在の胸郭に近位。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵巣と卵管を削除し、MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に置きます。
   注: 手順 1 と 2、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO₂で維持することが不可欠です。温度と CO₂のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO₂ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。
5. 27 G で 1 mL 注射器 (または同じようなサイズ) を使用してまたは鉗子をシャープ、MII 卵子を解放する卵管膨大部の穴を引き裂きます。
   注: 膨大部で卵子を傷つけないように気をつけてください。卵子が表示されます (図 4)、乳頭が腫れて、半透明表示されます。
6. 手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用してコレクションの中新しい皿に MII 卵子卵管の膨大部を収穫します。
7. 手順 4 に進みます。

4. 卵を denuding 基礎と透明帯除去

1. MEMα 中 3 mg/ml BSA の裸に周囲の卵丘細胞 (2.5 mL/マウス) 37 ° c、5% CO₂時計ガラスの卵母細胞に補われるヒアルロニダーゼの 300 IU/mL を準備します。
   注: ヒアルロニダーゼ効果は準備の 1 時間後に大幅減少します。MII 卵子, ヒアルロニダーゼ治療は必要ではありません。
2. 裸にする周囲の卵丘細胞卵母細胞に 3 分間 MEMα/BSA のヒアルロニダーゼ 300 IU/mL に卵子積雲細胞複合体を公開します。
   注意: それは卵母細胞に損傷を与える、ヒアルロニダーゼへの 3 分露出を超えないようにします。
3. 卵母細胞を洗って、卵母細胞を新鮮な温め MEMα/BSA の中皿に転送します。小さな口運営ガラス ピペットまたは毛細血管 (約 90 μ m は、卵母細胞の直径よりもわずかに大きい) を使用して、ピペットの複合体を上下の卵丘細胞を完全に分離します。次のステップを準備している間、インキュベーターで回復する卵を許可します。
4. 酸性タイロード液、MEMα/BSA、37 ° c (500 μ L/マウス) Waymouth のメディアを温めます。小さな 9 よくガラス プレートの各ウェルに場所 300 μ L。
5. 透明帯 (ZP) を削除するには、タイロード液に 5-10 卵を転送します。ソリューションにのみ 30-45 秒の卵母細胞を公開します。
   注: ソリューションにはあまりにもほとんど露出は削除されません、ZP 完全に破裂と広がってから染色体の卵子を回避します。あまりにも多くの露出は損傷し、卵母細胞を殺します。解剖顕微鏡の下で ZP ディゾルブを見て露出時間の最適化に役立ちます。
   注意: は新鮮なタイロード液を使用してその機能が年齢とともに低下として重要です。ZP の制服消化できるように卵母細胞のグループごとにタイロード液の新鮮な井戸を使用します。
6. ZP 除去後すぐに温めた MEMα/BSA/FBS 媒体に転送することによって卵子を洗います。このステップを繰り返します。
   注: は、転送、卵子が一緒に固執する簡単に、ガラス ピペットまたは ZP の毛細血管除去に注意してください。前ぬれガラス ピペットまたは Waymouth の中の毛細血管と、一緒に付着卵が最小限になります。
7. 転送でき、Waymouth の中 5% CO₂インキュベーターで 37 ° C で 30 分の回復する卵。
8. 手順 5 に進みます。

5. MI と MII 卵母細胞クロマチン スプレッド

1. PAP のペンを使用すると、図 6 aに示すように、スライド ガラスに 11 x 44 mm²矩形を描きます。
2. 定着剤の薄層を使用してスライドをコート (0.2% 1% パラホルムアルデヒド H₂O、pH 9.2 トリトン X 100) のスライドに固定液 100 μ L を分注して、前後のスライドを揺動します。過剰な定着剤を取り除くためにスライドをタップします。
3. できるだけ小さなメディアとして付いている小さな口ピペット針と 5-10 卵のピックアップ、固定液にスライド上 1 cm から卵子を堆積しながら定着剤コーティング スライド間でラインに針をドラッグします。卵母細胞が寄託されていること、彼らが破裂するため解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。
   注: 卵母細胞は、スライドにすぐにバーストする必要があります。卵子が、高さは、クロマチンの広がりの程度の影響を堆積させた。詳細についてはさらに図 6に代表的な結果を参照してください。
4. スライド閉じた加湿チャンバー内で一晩に従うクロマチンを許可する室温で孵化させなさい。
5. 完全に風乾し、リンスし、0.4% 湿潤剤 H₂O、pH 8.0 の 50 mL を含む Coplin jar でスライドするスライドを許可します。
6. 手順 6 に進みます。

6. Immunolabelling

1. 表 1に示す抗体希釈バッファー (ADB) を準備します。
2. 洗浄バッファー (WB) 溶液 (10 %pbs で希釈した ADB)、50 mL を格納した 2 つの Coplin jar と 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液を含む 1 つの Coplin jar の準備 (例えば、50 mL WB に 10% 洗剤の 250 μ L を追加)。
3. WB の 50 mL を含む 1 つの Coplin jar のセクション 1 と 10 分のこのプロトコルの 5 で準備されたスライドを洗います。
   注意: 任意の時点で immunolabelling の中にドライ スライドを聞かせてはいけません。
4. Coplin jar 含む 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液に 10 分間スライドを洗います。10 分間 WB 溶液 50 mL を含む残り Coplin jar 内のスライドを洗います。
5. ADB で希釈した選択された一次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。4 ° c 密閉湿気の多い室内で一晩インキュベートします。
   注: インキュベーションは、3 に 2 を短縮できる時間 37 ° C でCoverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば、50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。
6. 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar にスライドをすすぐ。
7. 6.5 6.2 の手順を繰り返します。
8. ADB で希釈した選択した二次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。スライド 2 に 1 を孵化させなさい 37 ° c 湿度の高い密室での時間。
9. 2 回の Coplin jar 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む 10 分スライドを洗います。
10. 2 回 0.2% 湿潤剤 H₂O 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar ファイルで 5 分用のスライドを洗います。

7. マウント スライド

1. 手順 2 で準備、前期クロマチンのスプレッド 4', 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントの 100 μ L を追加 (DAPI、1.5µg/mL)。MI と MII のクロマチンのスプレッドの準備手順 5 は、DAPI を含むメディアをマウントの 50 μ L を追加 (1.5µg/mL)。そっと離れて余分な液体をしみ。
2. 上 22 mm × 60 mm coverslip を置き、クリアのマニキュアをシールします。蛍光顕微鏡による評価まで 4 ° C または-20 ° C のスライド ボックスに格納します。
   注: カバー スリップに軽くマニキュアでシーリングする前に余分なマウント中の解消をするをタップします。

結果

可視化し、卵母細胞の減数分裂期染色体を評価する 2 つの方法を説明しました。最初のテクニックは、胎生期および新生児の卵巣に前期の進行を評価への仕出し料理します。前期クロマチン普及準備、減数分裂、染色体、シナプスのペアリングを含む多数の動的プロセスを可視化するため非常に貴重な desynapsis、相同組換えと染色体のエピジェネティックな改造します。ここでは、このメソッド堅牢な可視化のためのユーティリティと c57bl/6 j 胚から採取した卵母細胞におけるクロス オーバー形成の定量的解析を行った (図 3 b と3 C)。Pachytene サブステージ内のセルの豊かにするには、マウス胚は 18.5 dpc (図 1) で取得されました。2 つの主要な認刻極印前期の pachytene サブステージの私は、同族体と相同物ペアあたり少なくとも 1 つ MLH1/3-肯定的なクロス オーバー...

ディスカッション

クロマチン普及準備は、年代順に女性哺乳類減数分裂とタンパク質の動的局在の研究に研究を許可します。胎児・新生児のクロマチン スプレッド行事が減数分裂前期の綿密な分析を可能にします。中期私と中期 II クロマチン スプレッドを使用と単一の妹を区別できますから染色分け体一対姉妹と一対の相同染色体倍数性の評価と同様。比較では、ここで説明したプロトコルできる有利な頻繁クロマチン結合タンパク質の分解能を減少させるバック グラウンド信号の高レベルを生成する全体卵母細胞 immunolabelling と比較しています。さらに、クロマチン拡散技術は、時間と専門的な機器の大規模な投資を必要とする生細胞イメージングに魅力的な代替手段を表しています。

胎児・新生児の卵巣を検索し、抽出することは困難にすることができます。他のすべての臓器と卵巣を検索し、(図 2 b) 胚/子犬の PBS の新鮮な料理を使用する前に PBS を含む別の皿に腎臓以外にも材料を慎重に抽出をお勧めします。胚/子犬が男性の精巣は細管形成と生殖腺 (

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10Xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4	生物学的	119-069-161
60 mm x 15 mmシャーレ	デンビル	T1106
35mm x 12mmシャーレ	デンビル	T1103
ファイン鉗子	VWR	300-050
解剖はさみ	テッドペラ	1340
解剖 はさみ、鋭い先端、41/2 "	VWR	82027-578
ガラス正方形1 5/8	カロライナバイオロジカルサプライ	カンパニー742300	クレーブ各使用前に
糖	シグマ	S8501
エン酸三ナトリウム二水和物	シグマ	S1804
EDTA	シグマ	E6758
トリズマベース	シグマ	T1503
1,4-ジチオスレイトール(DTT)	シグマ	646563	使用直前に低張緩衝液に加え
50倍プロテアーゼ阻害剤	ロシュ	11873580001
付きターベルクリンシリンジ(1cc、27G x 1/2インチ)	ベクトン、ディキンソン(BD)	309623
金シール超霜ガラススライド(25X75mm、厚さ1mm)	サーモ	3063-002
スーパーPAPペン、大型(液体ブロッカー)	電子顕微鏡科学(EMS)	71310
16%パラホルムアルデヒド水性	電子顕微鏡科学(EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	原稿中の洗剤
免疫染色水分チャンバー	エバーグリーン	240-9020-Z10
Coplinジャー	フィッシャー	08-815
Photo-flo 200	電子顕微鏡科学 (EMS)	74257	原稿の湿潤剤
妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン (PMSG)	シグマ	G4877	-20C
ヒト絨毛性ゴナドトロピン (HCG)	シグマ	C0434	-20C でアリコートを保管
9 つの凹型空洞を持つ PYREX スポットプレート	ッシャー	13-748B	オートクレーブ 毎回使用前に
ガラスキャピラリー	フィッシャー	22260943	卵子採取針を作るため
ブランド パラフィルム M	シグマ	BR701501	卵母細胞採取針を作るため
ラテックスゴムチューブ(内径3.2mm×外径6.4mm)	フィッシャー	14-178-5B	卵子採取針
を作るためラテックスゴムチューブ(内径6.4mm×外径11.1mm)	フィ	ッシャー14-178-5D	卵子採取針を作るため
柔軟なシリコーンゴムノーズピース、硬質プラスチックマウスピース、15インチのラテックスチューブ	シグマ	A5177-5EA	卵子採取針を作るため
ミツトヨマイクロメーターヘッド	ミツオヨ	150-208	卵子採取針を作るため
シリンジ5mL	BD Biosciences	309646	卵子採取針作成用
シリンジフィルター 0.45 μmフィルター	コーニング	431220	卵子採取針を作るため
ガラスパスツールピペット 5 3/4インチ	フィッシャー	13-678-6A	卵子採取針を作るため
83 x 0.5 mm ピペットチップ	デンビル	P3080	卵子採取針を作るため
α-MEM	Invitrogen	11415049
Waymouth's media	Life Technologies
ウシ胎児血清	フィッシャー	A3160602
ウシ血清アルブミン (BSA)	Σ	A3311	卵子培養培地用
500ml フィルターユニット 0.22um	デンビル	F5227
ヒアルロニダーゼ	ΣH3506
チロードs ソリューション	シグマ	T1788	-20C でアリコートを保管
馬血清	シグマ	H-1270	ADB/洗浄バッファー用
牛血清アルブミン (BSA)	シグマ	A1470	ADB/洗浄バッファー用
VECTASHIELD 退色防止封入剤 DAPI	付き ベクターラボ	H-1200
顕微鏡カバースライド (22mmx60mm)	フィッシャー	12-544-G
クリアマニキュア	アマゾン	N/A
名	会社	strongカタログ番号	コメント
Microscopes
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss
Name	会社	カタログ番号	コメント
Primary Antibodies
Mouse anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431	希釈係数- 1:100
ウサギ抗SYCP1	ライフテクノロジー	ズ PA1-16763	希釈係数 - 1:1000
ヤギ抗SCP3	サンタクルーズ	sc-20845	希釈係数 - 1:50
ヒト抗セントロメアタンパク質	抗体 組み込まれた	15-235	希釈係数 - 1:100
ウサギ抗TOPOII	アブカム	ab109524	希釈係数 - 1:100
マウス抗ヒストンH4 (ジメチルK20、トリメチルK20)	Abcam	ab78517	希釈係数 - 1:500
ウサギ 抗 Rec8	Courtesy of Dr. Karen Schindler	N/A	希釈係数 - 1:10,000
Name	会社	カタログ番号	コメント
二次抗体
ロバ抗ヤギIgG(H + L)アレクサフルーア568コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11057	希釈係数-1:500
ロバ抗マウスIgG(H + L)アレクサフルーア488コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21202	係数-1:500
バ抗ウサギIgG(H + L)アレクサフロー647コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-31573	係数-1:500
ヤギ抗マウスIgG(H + L)Alexa Fluor 568コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11004	係数-1:500
ヤギ抗ヒトIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11013	係数-1:500
ギ抗ウサギIgG(H + L)アレクサフロー568コンジュゲート	フィッシャーサイエンティフィック	A-11011	係数-1:500