Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定

サマリー

我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ セクレターゼ酵素を定量化する設計されています。

要約

異なる基板の γ セクレターゼ胸の谷間を定量化するセルベースのレポーター遺伝子アッセイのペアを開発しました。本稿では、アプリ C99 のノッチ、Gal4 プロモーターに駆動されるホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して γ セクレターゼによる胸の谷間を監視するために使用可能性があります手順について説明します。これらの試金は安定株 Gal4 駆動ルシフェラーゼ レポーター遺伝子とアプリ (アプリ C99; のいずれか Gal4/VP16 タグ C 末端フラグメント HEK293 細胞が共同で設立されました。Cg 基本セルの場合)、または、Gal4 VP16 タグ付けのノッチ-ΔE (NΔE;NG のセル)。並列でこれらのレポーターの試金を使用して、我々 はことを示している ErbB2 阻害剤、CL 387,785、優先的に cg 基本セルでアプリ C99 が NG の細胞でない NΔE γ-セクレターゼ胸の谷間を抑制できます。CL-387,785 で処理する CG と NG の細胞によって展示差動応答 γ セクレターゼ変調器の最寄りの特性を表し、これらの応答は、γ-セクレターゼ部による抑制パンとは対照的。私たちの研究は、携帯電話のコンテキストで異なる基板上に向けた γ セクレターゼ活動を鑑別できることの直接の証拠を提供します。これらの新しいアッセイしたがって改善の AD 治療の薬剤開発に便利なツールがあります。

概要

アミロイド β (a β) のオリゴマー フォーム¹アルツハイマー病 (AD) 患者の脳の神経変性の主な原因と考えられています。Β-セクレターゼによって最初放置、γ-セクレターゼ²a β ペプチドがアミロイド前駆体タンパク質 (APP) の段階的な胸の谷間によって生成されます。過去 10 年間で AD の治療に対する治療のアプローチが a β の生産³の防止に焦点を当てた。研究の大半は、どちらかアプリの γ セクレターゼ胸の谷間を排除でき、a β の生産または β-及び/又は γ-セクレターゼ活動⁴の抑制により減少する α セクレターゼ活性の増強に焦点を当てています。残念ながら、β と γ セクレターゼ^5,6の他の生理学的な基板の機能の干渉のため、やむを得ない副作用で β または γ セクレターゼ結果の非選択的阻害。Γ セクレターゼ阻害剤に関する最近の研究はノッチ^{7 の重要な γ セクレターゼによる処理にはほとんど影響を発揮しながら a β の生産を調節することができます化学および遺伝の変調器の数の発見を報告しています。 ,}

プロトコル

1. アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に対応するルシフェラーゼ レポーター信号の測定

注: は、CG と NG のセル^20,21の世代の詳細な説明の前の出版物を参照してください。

1. NG または CG のセルのシード (20, 000 細胞/ウェル) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) プラス 10% ウシ胎児血清 (FBS)、5 μ g/mL ブラストサイジン 250 μ g/mL 抗生物質 (例えばで構成されている培地に 200 μ L/ウェルの最終巻で 96 ウェル マイクロ プレートに、zeocin)、および 200 μ g/mL hygromycin b.
   1. 診断とセルをカウントします。
   2. 加湿 CO₂インキュベーターにプレートを転送し、37 ° C で一晩インキュベートします。
2. 成長媒体の 100 μ L を各ウェルから削除します。
3. 成長の 100 μ L/ウェルを追加いずれか 0.2% ジメチルスルホキシド (DMSO)、2 μ M と 2 μ g/mL テトラサイクリンを含む中 CL 387,785、2 μ M N-....

結果

ErbB2 抑制 CL 387,785 によって差動によってアプリ C99 の処理を促進することがΓノッチ胸の谷間を与えずセクレターゼ
特定の γ-セクレターゼ基板の蛋白質分解開裂を定量化することができます細胞ベースのアッセイを確立するには、テトラサイクリン誘導 C 末期 Gal4/VP16 タグ付きの安定の共トランスフェクションによる HEK293 派生 CG セルラインを生成アプリ C99 と Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター遺伝子。NG 細胞平行線は、NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間の分析にも設立されました。NG 細胞におけるテトラサイクリン誘導 C ターミナル Gal4 VP16 タグ付き NΔE と Gal4 のプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子だった HEK293 細胞に安定 cotransfected。Cg 基本セルでアプリ C99 の γ セクレターゼ胸の谷間と NG 細胞における NΔE.......

ディスカッション

広告 aducanumab 免疫療法のフェーズ 1 b 試験の有望な結果は広告²²の病因における a β の重要な役割を定着させたし、抗 a β のアプローチがまだアンチ広告薬の開発のための実行可能な戦略であることを示唆しています。ここでは、アプリ C99 とホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して NΔE の γ セクレターゼ触媒分解を定量化するため細胞に基づく試金について述べる。アプリ C99 と NΔE 2 つの最もよく研究 γ セクレターゼ基板は、γ-セクレターゼ¹³の病原性および生理学的な活動を一緒に表します。我々 の調査結果分泌 β、γ-セクレターゼ本研究で説明の基質特異的細胞アッセイによって実証されてさらに、CL 387,785 によって ErbB2 のダウンレギュレーションは優先的にアプリ C99 の定常状態レベルを減らすことができます。現在のプロトコルは、したがって新規 γ-セクレターゼ変調器の発見のための効率化手法を提供します。

この γ-セクレターゼ特.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
VictorLight 発光プレートリーダー	PerkinElmer	2030-0010
Class II, Type 2 生物学的安全キャビネット	Thermo Scientific	1300 Series A2
CL-387,785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	Merck	565770
Dulbecco'サーモ	ッシャー	12100046	成長培地の主な成分
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャー	16000044
ブラストシジン	サーモフィッシャー	A1113903
ゼオシン	サーモフィッシャー	R25005
ハイグロマイシンB	Gibco	10687010
血球計算量	Sigma-Aldrich	BR717805 Aldrich
96 ウェルマイクロプレート	Nunc	156545
テトラサイクリン	Sigma	T7660
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma	D2650
Steady-Glo ルシフェラーゼアッセイ試薬	Promega	E2510
加湿 CO2インキュベーター	Revco	Ultima II
T-REx293細胞株	Invitrogen	R71007
Wallac 1420 ソフトウェアバージョン 3.0	PerkinElmer		発光マイクロプレートリーダーの装置制御ソフトウェア

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