有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

Summary

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。

Abstract

本論文では、肝細胞における環境有機塩素農薬(OSP)による代謝障害の原因をより深く理解するための、肝ミトコンドリア機能の検出に関する詳細な方法を紹介する。ヘプG2細胞は、一般集団における内部曝露の等価用量で24時間のβ−ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。肝細胞における超構造を透過電子顕微鏡(TEM)で調べ、ミトコンドリアの損傷を示した。ミトコンドリア機能は、さらに、β-HCHでインキュベートされたHepG2細胞におけるミトコンドリア蛍光強度、アデノシン5'-三リン酸(ATP)レベル、酸素消費率(OCR)およびミトコンドリア膜電位(MMP)によって評価された。ミトコンドリア緑色蛍光プローブで染色後のミトコンドリア蛍光強度を蛍光顕微鏡で観察した。ルシフェリン-ルシメラーゼ反応を用い、ATPレベルを決定した。MMPを、カチオン色素JC-1によって検出し、フローサイトメトリー下で分析した。OCRは細胞外フラックス分析装置で測定した。要約すると、これらのプロトコルは、ミトコンドリアの損傷を調査するために肝細胞におけるミトコンドリア機能を検出するのに使用された。

Introduction

健康に対する有機塩素農薬(OMP)の影響、例えば生殖障害、免疫毒性、代謝変化は^{、以前に検討}された^{1、2、3。2,3}細胞代謝を検出し、ミトコンドリア機能障害を発見する方法は、科学者がミトコンドリア機能の役割を理解することを可能にしました (すなわち.、 ミトコンドリア STAT3レベル、 乳酸、 ピルビン酸、 乳酸とピルビン酸比、 コエンザイム Q10、 ミトコンドリア陽子漏れ、生体精エネルギー、生物発生、および動力学) 老化、肥満、糖尿病、心血管機能、癌、および安全毒性^4,,55,6,,7.本論文では、オプスによるミトコンドリア機能障害の評価方法について述べている。

HepG2細胞をヒトの内部暴露に相当する用量で24時間の代表的なOCPであるβ-ヘキサクロロシクロヘキサン(β-HCH)に曝露した。まず、TEMを適用して、核、ミトコンドリア、小胞体⁸などの肝....

Protocol

すべての実験と実験プロトコルは、関連するガイドラインと規制に従って行われ、南京医科大学の地元の倫理委員会によって承認されました。

1. TEMによるミトコンドリア超構造

1. HepG2細胞の収集
   1. 100 mm の皿の種 HepG2 細胞。37°C、5%CO2で₂保管。
   2. 1.5 mLEPチューブに0.25%EDTAを有する消化細胞。
   3. 室温(RT)で3分間1000 x g で遠心分離機。上清を捨てます。
   4. 4-6 x 10⁵ HepG2細胞を収集します。
2. ピペットを用いて5%グルタルアルデヒド(溶媒:二重蒸留水)を1 mL加え、4°Cで2時間インキュベートします。
3. リン酸緩衝液の4 mL(Na2₂HPO4、KH2_2PO4、NaClおよびKCl、pH 7.4を含む)の4つの変化に加えて洗浄し、それぞれ15分。₄ピペットでリン酸バッファーを吸い出します。
4. 200 μmの1%オスミウム(溶媒:二重蒸留水)を加え、4°Cで2時間黒色サンプルにインキュベートします。
   注意: オスミウムは非常に有毒で揮発性の物質です。それは慎....

Results

β-HCHに曝露したHepG2細胞のミトコンドリアクリステは著しく損傷を受けた。散在したミトコンドリアは、比較的異常なミトコンドリア建築で、著しく膨張し、不規則な形状、およびミトコンドリア尾根が消失した軽度であった(図1)。

ミトコンドリアを表す平均ミトコンドリアグリーン蛍光強度は、β-HCH(図2)に曝露されたHepG2細胞およびATPレベルで減少した(図3)。蛍光強度とATPレベルは、暴露濃度の増加に伴って徐々に減少した。潜在的に、ミトコンドリア数の減少、またはミトコンドリアの損傷により、観察されたミトコンドリア蛍光強度を引き起こし、その結果ATPの産生が減少した。

Discussion

検出プロトコルの成功に不可欠なのは、表現型からメカニズムまで研究をカバーしてきた様々な実験方法の使用である。本研究では、ヘプG2細胞をペニシリンおよびストレプトマイシンおよび10%胎児ウシ血清でDMEMで培養した。細胞が合流率40~50%に達すると、β-HCH(0,10,100 ng/mL)を加え、24時間インキュベートした。代表のPPSによる肝細胞の超構造変化を示すTEMをまず用いたβ-HCHは、ミトコンドリア構造の障害を示す(図1)。)さらに、蛍光染色アッセイ(図2)、ルシファーゼ-ルシフェリンATPアッセイ(図3)、JC-1アッセイ(図4)) <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透過型電子顕微鏡	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	高コントラスト、高分解能イメージング、低線量観察・イメージング、低温観察、優れた分析性能、利便性と性能の自動化
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Greenは、生細胞のミトコンドリア特異的蛍光染色に使用できるミトコンドリア緑色蛍光プローブです。
レーザー走査型共焦点顕微鏡	Zeiss	700B	デザインはコンパクトで安定しており、光路は最短で、高い光精度、創造的な技術、洗練されたスキャン技術が一緒になって、完璧な3次元の標本画像を生成します。
エンハンスドATPアッセイキット	Beyotime	S0027	エンハンスドATPアッセイキットは、一般的な溶液、細胞、または組織中のATP(アデノシン5'-三リン酸)レベルを検出するために使用できます。細胞と組織サンプルを分割してサンプル調製を完了することができ、検出感度は最大0.1nmol / L、化学発光は30分間持続できます。
ルミノメーター	ベルトルト	・セントロ LB 960	ルミノメーターは化学発光検出器で、試験サンプル自体は光で、刺激する必要はありません。ルミノメーターは、化学発光を検出する装置です。
BCAプロテインアッセイキット	Beyotime	P0012	BCAプロテインアッセイキットは、タンパク質濃度を検出するために最も一般的に使用される方法の1つです。
マルチモードリーダー	TECAN	InfiniteM200	マルチモードリーダーは、タンパク質の同意を検出するために使用します。