フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Summary

生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。

Abstract

フタル酸エステル (パエス) は残留性有機汚染物質の主要なグループの一人。・ パエスのグループ固有の検出が同族体の急速な成長のために望ましい。DNA アプタマーは、ますますバイオ センサー プラットフォーム上の認識要素として適用されているが、パエスなどの高い疎水性小分子目標に向かって選択するアプタマーはほとんど報告します。この作業では、・ パエスに DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するように設計ビーズ法について説明します。アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH₂) アンカー ターゲットを合成し、エポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、固定マトリックスの表面でフタル酸エステルのグループの表示を許可してしたがって、グループ固有のバインダーの選択。我々 は、磁気分離と結合の定量的重合連鎖反応によるアプタマー候補の解離定数を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーの競争の試金によって定められた磁気ビーズを添付アプタマー候補あった DBP NH₂限定事前どこと培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の潜在的な妨害物質。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。最後に、我々 は電気化学 aptasensor の作製を実証し、bis(2-ethylhexyl) フタル酸の超高感度かつ選択的な検出のためにそれを使用します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の洞察力を提供します。

Introduction

急速な経済発展に伴って、工業化と都市建設公害の加速は今までよりもより厳しいです。代表的な環境汚染物質は、重金属、毒素、抗生物質、農薬、内分泌攪乱物質、残留性有機汚染物質 (POPs) に含まれます。金属イオンおよび毒素のほか他の汚染物質が低分子化合物がかなり多くの場合は、同族の様々 な。たとえば、最も有毒なポップス、ポリ塩化ビフェニル (Pcb)、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ポリ臭化ビフェニル エーテル (PBDEs)、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (ダイオキシン類)、ポリ塩化ジベンゾ フラン (濃度)、フタル酸と酸エステル (パエス)^1、2、すべて多くの同族体から成っています。小分子の検出は、アプリケーション^3,4,5,6の多様性のためのクロマトグラフィー/質量分析法を用いたテクニックで主に行われています。オンサイト検出の抗体を用いた方法は最近開発された^7,8,9をされています。ただし、これらのメソッドは特定の同族体に非常に特有なので、複数のテストを実行する必要があります。深刻なは新規の同族が非常に高速にその抗体を生成できないことを成長します。したがって、1 つのテストですべての同族体のレベルの合計を監視するグループ固有のバイオ センサーの開発は環境汚染状況を評価するため非常に貴重な指標を提供可能性があります。

最近、核酸アプタマーは広く様々 なイオンと蛋白質と細胞^{10,11 小分子化合物からのターゲットを認識の彼らの能力のための様々 なバイオセンシング プラットフォームの認識要素として適用されています。 ,12}。アプタマーは、指数関数的濃縮 (SELEX)^13,14によって配位子の系統進化と呼ばれる体外法によって識別されます。SELEX から始まるランダム合成一本鎖オリゴヌクレオチド ライブラリは、約 10 の¹⁴-10¹⁵シーケンスが含まれています。ランダムなライブラリのサイズは、RNA または DNA 候補構造の多様性を保証します。SELEX の典型的なプロセスは、ライブラリが高い親和性と特異性をターゲットのシーケンスで濃縮されてまで濃縮の複数のラウンドで構成されます。最終的な豊かなプールがシーケンスをサポートしと解離定数 (K_d) と妨害物質などさまざまな手法によって決定されます潜在的な選択性フィルター、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、表面のバインディングプラズモン共鳴 (SPR)、等。¹⁵

非常に貧しい人々 の水の溶解度と表面固定化機能群の不足、Pop のアプタマー選択は理論的に難しい。SELEX にとって重要な進歩がアプタマーの探索を高速化します。しかし、Pop のグループ固有のアプタマーの選択はまだ報告されていません。これまでのところ、特定の同族体の高度だけ基板結合 DNA アプタマーの探索は、識別された¹⁶をされています。パエスはポリ塩化ビニール材料、硬質プラスチックから、弾塑性解析、可塑剤として作用するポリ塩化ビニルを変更することで主に使用されます。いくつかのパエス内分泌かく乱物質として識別されている、深刻な損傷を引き起こすことができる肝臓と腎臓機能、男性の精子の運動性の軽減、精子形態の異常および精巣癌¹⁷があります。化合物 - もグループ固有 PAE バインディング アプタマーが報告されています。

この作業の目的は、ポップスの代表的なグループ ・ パエスといった高疎水性の小さな分子に DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するための代表的なプロトコルを提供するためにです。また環境汚染検出のため選択したアプタマーのアプリケーションを示します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の指導と洞察力を提供します。

Protocol

1 図書館およびプライマーの設計と合成

1. 最初のライブラリおよびプライマーを設計します。
   ライブラリ (プール₀): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   プライマー (FP) を転送: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   逆プライマーをリン酸化 (PO₄RP): 5'-PO₄- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. プール₀FP、PO を合成₄- RP 標準ホスホロアミダイト化学^18,19、20を使用して標準的な高速液体クロマトグラフィー (HPLC)²¹すべての Dna を浄化。
3. プール₀FP、PO を再構成₄- ヌクレアーゼ フリー グレードで RP 100 μ M、分注で水し、-20 に格納または 1 年間-80 ° C。
   注: プール₀FP と PO を格納すること強くお勧め₄可能なクロス汚染を避けるために 10-20 μ 因数で RP。

2. アンカー ターゲットとその固定化エポキシ活性化アガロース ビーズを合成します。

1. アンカー ターゲットとして、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH₂) を合成します。
   注: 合成と DBP NH₂の評価実験の詳細は文献²²に記載されています。
2. アンカー ターゲット溶解度の適切な媒体でターゲット在庫ソリューションを準備します。この研究のため 100 mM DBP NH₂ジメチルスルホキシド (DMSO) で原液を準備し、4 でソリューションを格納または-20 ° C、最大 1 年間。
3. DBP NH₂メーカーから修正されたプロトコルに従ってエポキシ活性化アガロース ビーズを固定します。
   1. エポキシ活性化アガロース ビーズの凍結乾燥粉末を 0.1 g を量り、蒸留水にそれを中断します。いくつかの因数で水 20 mL の蒸留水を使用して 1 h の中を洗ってください。0.2 M Na₂CO₃ (pH 12) 中を洗ってください。
      注: 媒体はそれに水を追加した直後に膨らみます。
   2. DBP NH₂ (46.7 mg、0.15 ミリ モル) を 500 μ L 結合バッファー (0.2 M Na₂CO₃バッファー) に溶かしてください。
   3. 媒体は配位子を含む結合ソリューションをミックスします。5 rpm でシェーカーを使用すると、室温で 48 時間。
   4. 0.1 M 酢酸緩衝液 (pH 4.5 0.5 M NaCl) を使用して順に 3 回、製品の洗浄を繰り返し、各洗浄サイクルの炭酸塩バッファー (0.5 M NaCl、pH 12) の 0.2 M。洗って、500 μ L の最終巻を作るためにプロダクトを中断します。
   5. 使用する前に 4 ° C で保管します。
   6. 元素分析によるターゲット固定化の成功を確認します。

3. SELEX

1. 500 mL の超純水や 20 mm Tris· グレードのヌクレアーゼ フリー水で PAE 結合バッファーを準備します。HCl、100 mM の NaCl、2 mM MgCl₂, 5 mM KCl、1 mM CaCl₂1 %polyoxyethy レネ (20) sorbaitan monolaurate、および 0.03% 非イオン性界面活性剤 (pH 7.9)。滅菌 0.22 μ m 硝酸セルロース フィルターを介してバッファーをフィルター、ヶ月の 20 ° C より高い温度で保存できます。
   注: PAE 結合バッファーでパエスの良好な分散状態を維持するために重要です。複数の界面活性剤の種類は、パエス水溶液への溶解度を高めるために必要です。ただし、界面活性剤の数は、PAE 分子カプセル化界面活性剤ミセルの形成を避けるために最小限に抑える必要があります。非イオン界面活性剤は簡単に 20 の ° C より低い温度で沈殿し、したがってバッファーを 20 ° C 以上の高温で保存する必要があります。
2. PAE 結合バッファーの 490 μ L で 100 μ M プール₀(~1.0 nmol 10¹⁴-10¹⁵シーケンス) の 10 μ L を希釈します。5 分間氷の上管 95 ° C 10 分の場所で水のお風呂セットで薄肉管遠沈管にプール₀因数 (5 × 100 μ L) を加熱し、その後室温 (この作品で ~ 25 ° C) で 5 分間チューブを孵化させなさい。
3. 選択範囲の最初のラウンド: プール₀と DBP−NH₂−coated 培地による培養。
   1. DBP−NH₂−coated 媒体を 200 μ l 添加を PAE 結合バッファーの 500 μ L で 3 回洗います。ミックス DBP−NH₂−coated 媒体は₀をプール、小さな揺れの下 1 時間室温で混合物を孵化させなさい。
   2. 別 DBP−NH₂−coated 中縛られてアプタマーと非連結の Dna から 100 kDa の分子切断を限外ろ過不適切限外ろ過チューブ。4 ° C で 10 分間 9,168 × g で媒体を PAE 結合バッファーの遠心分離機 500 μ L で 3 回洗浄します。
4. 選択範囲の最初のラウンド: DBP−NH₂−coated メディアからアプタマー溶出します。
   1. 洗浄中、熱振動の下で 9 分間の 90 ° C で混合物に PAE 結合バッファーの 50 μ L を追加します。
   2. 限外濾過法による溶出の Dna を含む上清を収集します。この溶出過程を 3 回繰り返すよりバインドされた Dna を回復します。
5. 選択範囲の最初のラウンド: PCR
   1. 小規模な PCR
      1. 小規模な PCR²³ (4 × 20 μ 因数) 15 〜 30 を使用してを実行サイクル。²⁴ PCR 反応を次のように設定: RNase フリー水 6.5 μ、10 μ M の各プライマーの 1 μ L (FP、PO₄RP 0.01 nmol)、1.5 μ L 溶出セクション 3.4 (または陰性対照として RNase フリーの水) からプール、予混合の 10 μ L の反応混合物を含むdNTPs、ホット スタートのポリメラーゼおよび 2 × PCR 反応バッファー (20 mM tris·HCl、100 mM KCl、3 mM MgCl₂、pH 8.3)。
      2. PCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行: 95 ° C、1 分; の 1 サイクル30 サイクルの [95 ° C、30 s; 56 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];4 ° C で 72 ° C、2 分の 1 サイクル楽器は、拡張ステップ、15、20、25、20^th秒と 30 サイクル、pause キーを押して実行する中に、計測器カバーを開く、1 つのチューブに乗りし、PCR を再開するもう一度一時停止キーを押します。
      3. 12% 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ)^25,26を準備します。尿素、超純水、10 × トリス/ホウ酸の 1 mL の 6 mL の 4.8 g をミックス/エチレンジアミン四酢酸 (TBE)、40% アクリルアミドの 3 mL、10 μ L のテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) と 100 μ L 10% 過硫酸アンモニウム (AP)、その順序で。よくかき混ぜて、完全に凝固するゲルを確実に 1.5-2 時間待ちます。
      4. サイクルの最適化の結果の分析: 5 μ L の RNA 読み込みバッファー (62.5% ホルムアミド、0.4 M ホルムアルデヒド、1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic 酸緩衝液、0.02% キシレンシアノール FF、0.02% ブロモフェノール ブルー) との 4 μ L 各 PCR の製品の 1 μ L を組み合わせるRNase フリー水;95 ° C 10 分の混合物を熱するし、すぐに氷の上の 0 の ° C に冷やしてください部屋の温度で 5 分間インキュベートします。12% の 5 つの井戸に負荷変性ページ;45 分の 170 V で 1 × TBE バッファー内垂直電気泳動システムで電気泳動を実行します。
      5. 電気泳動、染色 1 × 核酸ゲルの 3 μ L をゲルを 10 分の 1 × TBE バッファーの 30 mL で汚し、ゲルのイメージを取る後。
   2. 大規模 PCR:不要な副産物がなければ正しいサイズのマーカーで最高強度のバンドを生成するサイクルの適切な数を選択します。大規模な PCR (20 × 100 μ 因数) 利用条件と適切なセクション 3.5.1 で決定サイクル数を実行します。
      注: ことができる単一座礁させたライブラリの最終的な金額は PCR テンプレートのない濃度の総量に比例。通常、ライブラリの 1 nmol を得るためには、一本鎖のプールは 2 mL PCR を必要です。PCR は非常に敏感、容易に外 dna 汚染されました。手順は、手袋、滅菌のヒントを使用して、ないチューブに唾を吐き、遠心分離前に PCR チューブのキャップが開かないなどの汚染のチャンスを減らすために取られるべき。
6. 選択範囲の最初のラウンド: エタノールの沈殿物によって PCR の製品の浄化。
   1. PCR の混合物の 2 つの管を 1 つの管 (各 200 μ L) にまとめた。すべてのチューブのため、この手順を繰り返します。
   2. 各チューブに-20 ° C で (3 M, pH 5.2) 酢酸ナトリウム溶液 15 μ、DNA ・ RNA の沈殿物キャリア ソリューションの 4 μ L と 2.5 倍量の予冷エタノールを追加します。均等にそれらをミックスします。
      注: DNA ・ RNA の沈殿物のキャリアは広くエタノール沈殿実験し低濃度の DNA ・ RNA の回収率を大幅に向上します。PCR やシーケンスなどの下流のアプリケーションと干渉しません。
   3. 4 ° C で 20 分間 20,627 × g で混合物を遠心分離機し慎重に上澄みを廃棄し、白色沈殿物を残します。
   4. 70% の沈殿物を洗うように各管に-20 ° C でエタノールを予冷の 400 μ L を追加します。4 ° C で 5 分間 20,627 × g で混合物を遠心分離機し慎重に上澄みを廃棄し、白色沈殿物を残します。洗浄ステップをさらに 2 回繰り返します。
   5. チューブ カバーを開く封止膜を刺す白い沈殿物が透明になるまで暖房のブロックに 40 ° C で揮発エタノールができます。-20 ° C で沈殿物を保存します。
      注意: 精製 PCR の製品が-20 ° C で保存することができます。
7. 選択範囲の最初のラウンド: 一本鎖 DNA ジェネレーション (ジェネレーション濃縮プール₁) リン酸化逆鎖を消化する λ exonuclease 反応を実行することによって。
   1. 小規模な λ exonuclease 反応
      1. セクション 3.6 精製 PCR 産物を含む 1 つのチューブに RNase フリー水の 100 μ L を追加します。渦管の沈殿が完全に溶解する管。
      2. 5 遠心チューブを用意し、各チューブに無料の水と 2 μ L 10 × 反応バッファー (670 mM グリシン-KOH、25 mM MgCl₂ 0.1% (v/v) トリトン X-100 pH 9.4) の上記の解決策は、rnase - 11 μ L の 5 μ L を追加します。
      3. 2 μ L の水またはこれらの管に 2 U、5 U、8 U、10 U λ exonuclease をそれぞれ含む希薄 λ exonuclease ソリューションを追加します。軽くピペッティングでよくソリューションを混ぜます。10 × 反応バッファーは、プロバイダーを λ exonucleasefrom と一緒に提供されます。
      4. 37 ° C、80 ° c、15 分で 35 分間チューブを孵化させなさい、4 ° C で保持
      5. 12% ネイティブ ページを準備します。超純水、10 × TBE、40% アクリルアミド、TEMED の 10 μ L、100 μ L の 10% の 3 mL の 1 mL の 6 mL を混ぜて AP の場合、その順序で。よくかき混ぜて、完全に凝固するゲルを 60-90 分待ちます。
      6. 各反応染料と RNase フリーの水の 4 μ L 読み込み、およびこれらの混合物を読み込んで 12% ネイティブ ページ (45 分 150 V) の 5 つの井戸の 1 μ L で 5 μ L を組み合わせることによって、反応の結果を分析します。
         注: ゲルの 20 bp 二本鎖 DNA の梯子を読み込むもできますが、ない必要があります、ゲルの PCR の製品と生成された単一の孤立したライブラリの明瞭なバンドを示すので。
         注: λ exonuclease 反応の構造に高い選択性があります。(アンチセンス鎖は 5' 末端にリン酸基を持つラベル) 二本鎖 PCR の製品は、非常に広い濃度範囲 (図 4) で λ exonuclease の存在下での単一座礁させたライブラリに完全に消化できます。小規模 λ exonuclease 反応の単一座礁させた DNA を生成できます完全に λ exonuclease の最小量は、大規模な λ exonuclease 反応も使用されます。Λ exonuclease はその構造の選択性と製品の収率を失うことがなく広い濃度範囲でよく動作するので、λ exonuclease の高濃度も使用可能性があります。Λ exonuclease 反応は、塩の高い濃度で抑制されます。PCR の製品の不完全な消化力は通常 PCR の製品にあまりにも多くの塩が存在することを意味します。エタノールの沈殿物 (セクション 3.6) によって PCR の製品の浄化は、イソプロパノールの沈殿物かなり頻繁により精製 PCR の製品にあまりにも多くの塩が含まれている通常このステップとの互換性。
   2. 大規模な λ exonuclease 反応:大規模な λ exonuclease 反応の単一座礁させた Dna を生成ことができます完全に λ exonuclease の最小量を選ぶ。反応がこの条件によると比例してスケール アップ。たとえば: 2 U が必要な λ exonuclease の最小量の場合のミックスには、Rnase フリー水の 38 μ L、バッファー x 10 の 10 μ、50 μ L の DNA プール₁ 10 U/μ L λ exonuclease の 2 μ L。
8. 選択の最初のラウンド:エタノールの沈殿物によって単一座礁させたプール₁の浄化。
   1. 3.6 ステップの指示に従います。
   2. 濃度精製プール₁ 260 UV 吸収を決定する nm。
   3. PAE 結合バッファーの適切なボリュームで 90% 精製プール₁を再構築します。選択の次のラウンドのために得られた十分な DNA が存在しない場合は、セクション 3.5 3.8.2 を繰り返します。
      注: PAE 結合バッファーのボリュームは図書館と SELEX の次のラウンドでライブラリの目的の最終的な集中量に応じて 500 μ L に 200 から通常によって異なります。
9. 2 番目、3 番目、4 番目、および 5 SELEX のラウンド。
   1. 第四に、第三に、第二を行うし、SELEX その後同様の手順の 5 番目のラウンドは上記 (セクション 3.2 3.8) ~ 300 pmol ライブラリが選択の金詰りを高めるため入力されたことを除いて。
   2. 媒体に DNAs の無指定の吸収を最小限に抑えるためシェーカー 3 番目で 30 分間に変更されていない中でプールを孵化させなさいし、DBP−NH₂−coated 培地で培養する前に選択範囲の第 4 ラウンドします。
      注: SELEX のプロセスが大量のゲルに移行しなかった高分子量製品によって明らかに Dna の深刻な橋渡しのため第 5 ラウンドで終了しました。

4. 高スループット シーケンス

1. 互換性のあるプライマーによる PCR 増幅シーケンスのセクション 3.9.2 からプール₄を準備します。
   1. 設計・合成 6 インデックス付き前方プライマー シーケンス解析を容易にする 5 ' 端に nt。
      前方プライマー (FP シーケンス) をインデックス: 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   2. 1,000 µLPCR 反応を次のように設定: RNase フリー水 380 μ、10 μ M プライマーを各 50 μ L (PO₄FP 配列-RP、0.5 nmol)、セクション、3.9.2 から溶出したプールの 20 μ L と 500 μ L の予 dNTPs を含む反応混合物、ホット スタートのポリメラーゼ、および 2 × PCR 反応バッファー。約数 10 PCR チューブに混合物。3.5.1.2 のセクションで説明されているように同じの PCR 条件を使用します。
2. シーケンス処理施設の要件を満たすために PCR の製品を浄化します。たとえば、製造元の指示に従ってページ-ゲルの DNA の回復キットを使用します。
3. シーケンス機能によって必要な送料の条件下でシーケンス処理施設に浄化された PCR の製品 (〜 2 μ g) を送信します。たとえば、徹底的にシーケンス処理施設に氷のパックで密封のキャップが遠心分離機管の PCR の製品を出荷します。
   注: は、シーケンス処理されたプールの充実を評価するために各シーケンスのコピー数に応じてシーケンスをランク付け結果を受け取った。トップのシーケンスは、DBP 1 が命名された (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3')。その親和性と選択性は、次のプロトコル (セクション 5 と 6) により測定しました。セクション 7 で電気化学的にバイオセンシングへの応用をその後示した。

5 しますK_d Magnetic Bead-Based 定量的 PCR (qPCR) を使用して選択したアプタマー候補決定。

1. DBP 1 qPCR および標準ホスホロアミダイト化学を使用してプライマーを合成し、標準的な高速液体クロマトグラフィーによる浄化します。
   アプタマー候補 (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
   QPCR (FP qPCR) のためのプライマーを転送: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
   逆に qPCR (RP qPCR) のためのプライマー: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
   注: テスト シーケンスのプライマー領域は、プール₀ 3 のセクションで使用のものとは異なる。プライマーの領域を変更の目的は、単独で、プライマー地域を除くコア シーケンスのアフィニティをテストすることです。
2. 製造元の指示に従ってカルボン酸をコートした磁気ビーズに DBP NH₂を固定します。
   1. 25 mM 2-(N morpholino) で 2 回カルボン酸をコートした磁気ビーズを洗う ethanesulfonic 酸 (MES) (pH 5.0) を使用して磁気ビーズ (100 μ L) の等量戻バイアル (エンド オーバー エンドまたは類似の) 良い混合と 10 分のため。
   2. 使用前にすぐに冷たい 25 mm MES (pH 5.0) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) 溶液 50 mg/mL を準備します。
   3. 使用前にすぐに 50 mg/mL の冷たい 25 mm MES (pH 5.0) N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 溶液を準備します。
   4. EDC ソリューションを 100 μ l 添加し、NHS 溶液 100 μ L を混ぜて洗浄ビーズと遅い傾斜回転室温で 30 分間インキュベートします。
   5. 孵化後 4 分のための磁石にチューブを入れて、上澄みを廃棄し、ビード冷たい 25 mM MES (pH 5.0) の 100 μ L で 2 回洗浄しなさい。
   6. 6 μ 100 mM DBP NH₂原液と 25 mM MES (pH 5.0 290 μ L) 5 rpm の低速傾斜と少なくとも 30 分室温でまたは 4 ° C で 2 h 回転下活性化ビーズをインキュベートします。
   7. 孵化後 4 分のための磁石にチューブを入れ、上澄みを廃棄します。4 回コーティングを施したビーズを洗浄し、使用するまで PAE 結合バッファーと 4 ° C でストアの 200 μ L でビーズを再懸濁します。
3. K_dは、滴定曲線を収集します。
   1. 300 13 から PAE 結合バッファーに様々 な濃度で DBP 1 ソリューション (500 μ L) のシリーズを準備 nM。
   2. DBP NH₂の 10 μ L を追加-各 DBP 1 ソリューションに 5.2.7 セクションで説明した磁気ビーズをコーティングします。回転の下で室温で 1 時間インキュベートします。
   3. 4 分のための磁石にチューブを置き、上澄みを除去します。4 回使用して 200 μ L PAE 結合バッファーのビードを洗います。
   4. 各チューブに PAE 結合バッファーの 60 μ L を追加します。95 ° c で 15 分間収集管磁気分離による溶出の DBP 1 を含む上清を孵化させなさい。連結 DBP 1 を回復するには、この溶出過程を繰り返します。
   5. 想定し, 浸出液ソリューションを 100 倍希釈し、リアルタイムの qPCR の 3 μ L を取る。QPCR 反応を次のように設定: RNase 自由水の 3 μ、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (FP、PO₄RP 0.01 nmol)、3 μ L の溶出し、DBP-1、希釈、10 μ L の予 dNTPs、ポリメラーゼおよび 2 x PCR 反応バッファーを含む反応混合物。
   6. QPCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行して、各サンプルの DBP 1 の数字を決定: 95 ° C、30 の 1 サイクル s;30 サイクルの [95 ° C、30 s; 45 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];72 ° C、30 s および 4 ° C で開催の 1 サイクル
   7. 滴定曲線をプロットし、1:1 の結合比²⁷と仮定すると曲線の非線形当てはめによってK_dを決定します。

6. 相対的親和性と競争の試金による特異性試験

1. DBP NH₂の 10 μ L を追加-DBP 1 ソリューション (500 μ、1 μ M) に磁気ビーズをコーティングします。回転の下で室温で 1 時間インキュベートします。4 分のための磁石にチューブを置き、上澄みを除去します。4 回は PAE 結合バッファーの 200 μ L を使用してビーズを洗浄し、PAE 結合バッファーの 10 μ L でそれを再懸濁します。
2. DBP NH₂の 10 μ L を追加-各 10 μ M の 110 μ L に DBP 1 コーティング媒体バインド テスト サンプル (DBP NH₂DBP、DEHP、ブチル ベンジル phthalate(BBP)、重金属イオンなど)。磁気分離による 1 h. 収集上清の室温で孵化させなさい。
3. 上清を 100 倍希釈し、qPCR 定量化のため 3 μ L を取る。QPCR 反応を次のように設定: RNase 自由水の 3 μ、10 μ M の各プライマーの 2 μ L (FP、PO₄RP 0.01 nmol)、3 μ L の溶出し、DBP-1、希釈、10 μ L の予 dNTPs、ポリメラーゼおよび 2 x PCR 反応バッファーを含む反応混合物。
4. QPCR サーマルサイクラーを使用して次の設定を実行して、各サンプルの DBP 1 の数字を決定: 95 ° C、30 の 1 サイクル s;30 サイクルの [95 ° C、30 s; 45 ° C、30 s; 72 ° C、30 秒];72 ° C、30 s および 4 ° C で開催の 1 サイクル
5. DBP 1 DBP 1 PAE 結合バッファーのビードからリリースの数によってサンプルの存在下でビーズからリリースの数を割ることによって相対的な親和性を計算: 相対的親和性 = N_サンプル/N_{バッファー}。

7. 作製と DEHP 電気化学バイオ センサーの電気化学測定

1. チオール コア シーケンス (HS-DBP-1) と標準ホスホロアミダイト化学を用いた信号プローブ (DBP 1 C Fc) を合成し、標準的な高速液体クロマトグラフィーによる浄化します。
   HS-DBP-1:5 ' - HS を-(₂CH)₆- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'
   DBP-1-C-Fc: 5' - GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(₂CH)₆Fc-3'
   注: センサー プローブの合理的な設計は、私たち以前の pbulications^18,22で説明しました。
2. HS DBP 1 と 100 μ M、分注、グレードのヌクレアーゼ フリー水の DBP-1-C-Fc を再構成し、-20 に保管または 1 年間-80 ° C。
3. 5 分間 microcloth に 1、0.3 0.05 μ m Al₂O₃粉末と鏡のような表面を慎重に金電極を磨くし、残留 Al₂O₃を削除する 5 分間超純水で超音波。+1.2 V、0.4 から 35 連続サイクリックボルタンメトリー (CV) のスキャンによる電気化学的研磨加工で電極をきれい (Hg Hg₂対など₄) 0.5 M H₂SO₄ 100 mV/秒で。
4. 0.5 μ M HS DBP 1 と 0.5 μ M の混合物を準備, pH 7.4 (PBS) 1 M の NaCl を含む 100 μ L 10 mM リン酸緩衝で DBP-1-C-Fc。10 分、95 ° C で水のお風呂セットで薄肉・遠心管中混合物を熱し、ゆっくりと部屋の温度に混合物を冷却します。
5. トリス-(2-carboxyethyl) ホスフィン塩酸塩 (TCEP、10 mM、貯蔵液) 1 μ L を混合物に追加します。1 時間室温で維持します。
6. 12 時間は、上記の解決策できれいな金の電極を浸したり、室温で一晩します。
7. PBS で電極を洗浄し、1 mM [S (₂CH)₂(OCH₂CH₂)₆OCH₃]₂の電極を浸す (例えば HS₆- 青梅) 1 のため PBS で PAE を使用して徹底的に電極を洗うバッファーをバインドおよび PAE 結合バッファーで電極を浸します。
8. ターゲット無料 PAE 結合バッファーで背景の矩形波ボルタンメトリー (SWV) スキャンを取る。
   1. きれいにすべての実験装置: 電解槽、ゴールドの作用電極、白金対極、カロメル参照電極 (SCE)。
   2. インストールされているソフトウェアをアクティブにします。SWV 測定の実験的パラメーターを設定します。
      注: 次の実験的パラメーターあった SWV 実験用: 潜在的な範囲: から-0.2 0.7 V;変調振幅: 25 mV。パルス幅: 5 ms。スキャン レート: 50 mV/秒;潜在的なステップ: 1 mV。
   3. 電極、白金対極、SCE、ポテンシオスタットにして金を接続し、PAE 結合バッファーを含む電解セルにこれらの 3 つの電極を置きます。
   4. SWV の測定を実行します。
      注: 一度 SWV 測定開始 SWV 曲線になります、コンピューターの画面に表示されます。スキャンは、スキャンは定数であり、ピークの高さや形状のさらなる変更は観察されるまで繰り返されます。
9. DEHP 濃度を含む PAE 結合バッファーで作用電極を浸す (例えば22) 室温で 30 分間。PAE 結合バッファーを使用して徹底的に電極を洗浄し、対向電極と SCE の PAE 結合バッファーで電極を浸します。セクション 7.8 で説明した同じ条件下で SWV 曲線を収集します。
10. 繰り返しステップ 7.9, ことを除いて DEHP 濃度 (例えば100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μ M) 順番に増加しました。滴定曲線をプロットします。
11. 特異性テスト:DEHP を含む PAE バインド バッファーは必要な濃度で潜在的な妨害物質を含む PAE 結合バッファーに置き換えられますことを除いて 7.3 7.9 の手順を繰り返します。

Results

私たちは設計・ アンカー ターゲット (図 1 階) として、アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH₂) を合成します。・ パエス DBP NH₂を使用してアンカー ターゲットとして、次の古典的なターゲット固定ベース メソッド (図 2) の DNA アプタマーの選択を行った。各ラウンドでパイロットの PCR は PCR (図 3) のサイクル数を最適化する変性のページを用いて行った。高いサイクル数でネイティブのゲルに疑われる高分子量副産物が実際に架橋複合体である我々 と他の同僚を発見したので変性] ページで、ネイティブのページの代わりにお勧め適切なサイズのシーケンス。したがって、変性のページのバンドの強度は本当に適切な製品の量を反映できます。単一の孤立した DNA 生成は別の重要なステップと、このステップのための多くの方法が報告されている

Discussion

アプタマーの顕著な利点の 1 つは抗体が生体内で免疫反応を介して生成された SELEX、体外法によって識別されます。したがって、アプタマーは抗体が生理的条件に限定しているに対し、適切に設計された実験条件下で目的のターゲット特異性と選択できます。

無料シーケンスからバインドされたシーケンスの分離を容易にするいくつかの変更された SELEX 最近報告されている、キャピラリー電気泳動³⁰、³¹マイクロ流体、磁気/アクリル ビーズ/アガロース ビーズ¹⁴、 など、硝酸セルロース フィルターまたはより効率的な分離を達成するために親和性列に置き換えています。ビーズ法これらの技術の間で簡単なため小分子ターゲットのアプタマー選択のため最も広く使用されているセットアップ、簡単操作、および小分子の解析に適しています。

小さな分子のアプタマー選択の一般的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV-2550	島津	製作所、日本プロトコール、セクション3.8.2
	GE Healthcare(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)	10220020	アルガロースビーズ、セクション2.3および3.3
Dynabeads M-270カルボン酸磁気ビーズ	Invitrogen、米国	420420	磁気ビーズ、セクション5.2.および5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara、大連、中国	R028A	ポリメラーゼ、セクション3.5.1.1
PARAFILM シーリング膜	ベミス、米国	PM-996	セクション3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided with λ exonuclease. 10 × 反応バッファーは、プロバイダーによって & エキソヌクレアーゼと共に提供されます。
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara,Dalian,China	9094	section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Invitrogen, USA	1811838	nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara,Dalian,China	RR820A	ポリメラーゼとdNTPsを混合したポリメラーゼミックス、セクション5.3.5
2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)	Sigma-Aldrich	CAS:1132-61-2	セクション5.2.1
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)	Invitrogen, USA	CAS:25952-53-8	セクション5.2.2
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	セクション5.2.3
メルカプトヘキサノール(MCH)	Sigma-Aldrich	CAS:1633-78-9	セクション7.7
電極	Shanghai Chenhua	CHI101	セクション7.4.-7.11
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS:51805-45-9	セクション7.5
O-(2-メルカプトエチル)-O'-メチル-ヘキサ-(エチレングリコール)	Sigma-Aldrich	CAS:651042-82-9	セクション7.7
フタル酸ジエチルヘキシル(DEHP)	国立計量研究所、中国	CAS:117-81-7	セクション7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS:9005-64-5	ポリオキシエチレン(20) ソルバイタンモノラウレート
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS:9002-93-1	非イオン性界面活性剤
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	10 mM リン酸緩衝液1 M NaCl、pH 7.4