Method Article

心筋細胞のシステム生物学における細胞構造の役割を研究する心筋細胞の構造的に現実的な有限要素の幾何学的なモデルを作成します。

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

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このプロトコルでは、電子顕微鏡や共焦点顕微鏡画像から心筋細胞の細胞内構造の空間的有限要素モデルを作成する手法について説明します。カルシウム シグナルと生体エネルギー転換の事例を使用してこの空間詳細モデルの力を発揮します。

Abstract

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電子線トモグラフィーなど三次元 (3 D) 画像処理技術の出現により、シリアル ブロック面走査電子顕微鏡と共焦点顕微鏡は、科学的なコミュニティは、大規模なデータセットへの前例のないアクセス サブミクロン建築改造を特徴づけるの解像度は、健康と病気心筋細胞機能の変化を伴います。ただし、これらのデータセットは、心筋細胞の機能細胞アーキテクチャの役割を調査するため利用されています。このプロトコルの目的は、高分解能電子顕微鏡と共焦点顕微鏡画像を用いた心筋細胞の高精度有限要素モデルを作成する方法の概要を説明することです。細胞アーキテクチャの詳細かつ正確なモデルには、心筋細胞生物学実験だけを集めることができます以上に新しい洞察力を提供するために重要な可能性があります。このメソッドの力は、計算上、心筋細胞の 1 つの統一された、詳細なモデルを開発する心筋細胞の微細構造の 2 つの異なる画像モダリティからの情報を融合する能力であります。このプロトコルは、電子線トモグラフィーと、心筋細胞の半筋節の有限要素モデルを開発する男性の大人の Wistar (白鼠の特定の品種の名前) ラット心筋細胞の共焦点顕微鏡画像を統合する手順をについて説明します。手順は正確、高解像度の描写を含む三次元有限要素モデルを生成する (〜 35 程度 nm) ミトコンドリア、筋原繊維と心筋細胞の必要なカルシウムを解放するリアノジン受容体クラスターの分布の筋原線維と細胞内コンパートメントに漿網状のネットワーク (SR) から収縮します。生成されたモデルとおりイラストが横行尿細管アーキテクチャまたは漿の網状のネットワークの詳細を取り入れていない、したがって、心筋細胞の最小モデル。それにもかかわらず、モデル既に適用できるカルシウム シグナル伝達とミトコンドリア生体エネルギー、示されていますと、次が表示されます 2 つの事例を用いて説明したセル構造の役割に基づくシミュレーション調査で、詳しいプロトコル。

Introduction

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興奮収縮連関 (ECC) 中心部には、重要な複雑な心筋細胞膜の電気的興奮と各ハートビートの中にセルの後続の機械的収縮カップリングを指します。数理モデルは活動電位1,2、生体エネルギー3、ゾル性細胞質カルシウムを調節する連結された生化学的なプロセスの定量的理解の開発に重要な役割を果たしているとその後収縮力発生。このようなモデルは、1 つのハートビートの変更を予測しているも正常にまたはこれらの生化学的なプロセスのいくつかは変更4,5を受けます。心筋細胞の非常に組織の微細構造は、セルと心臓全体の正常な収縮機能に重要な役割を果たすにますます認識されています。確かに、肥大6心不全7、および糖尿病性心筋症8疾患の生化学の変化と並行して形態と心筋の微細構造のコンポーネントの構成の変更が発生します。これらの構造変化が変化しマイナー、適応、または病理学的応答かどうか生化学的な条件はまだ未知9です。生物の形と機能の間の本質的に密結合を意味する実験的研究だけでは構造を改造と心筋細胞の機能間の相関関係よりも深い洞察を提供できません。よく研究の生化学的なプロセスと、細胞内のコンポーネントの構造のアセンブリを組み込むことができる数理モデルの新世代の関係の定量的、総合的な理解を開発する必要が構造, 生物化学と心筋収縮力。このプロトコルでは、このような調査に使用することができます心筋細胞の構造的に高精度有限要素モデルの生成に使用できるメソッドについて説明します。

最後の十年は、3次元電子顕微鏡10、共焦点11、およびナノ ・ マイクロ スケールの組み立てに前例のない、高解像度の洞察力を提供する超解像顕微鏡12の重要な進歩を見ている、心筋細胞の細胞内コンポーネント。最近では、これらのデータセットは、心筋の微細構造13,14,15,16の計算モデルを生成する使用されています。これらのモデルでは、有限要素法17と呼ばれる確立されたエンジニア リング シミュレーション法を使用して、作成有限要素計算メッシュする生化学的なプロセスおよび心筋細胞の収縮をシミュレートできます。ただし、これらのモデルは解像度とディテール画像データセットに提供できる顕微鏡法によって制限されます。たとえば、電子顕微鏡は、セル構造のナノメートル レベルの詳細を生成できますが、モデルを作成する必要がありますイメージ内の特定の蛋白質を識別することは困難です。超解像光学顕微鏡で 50 程度の解像度で高コントラストな画像を提供できる一方でのみ、選択数分子コンポーネントのセルの nm。これら画像モダリティから補完的な情報を統合することによってのみすることができます 1 つ現実的に感度を調べる関数の構造の変化に。相関光学および電子顕微鏡はまだルーチンの手順と制限コンポーネント数が限られている可能性があります蛍光表示で染色、電子顕微鏡ビューと相関も苦しむことになります。

このプロトコルは、統計的手法19を使用して分析し、電子顕微鏡について他の心筋イオン チャネルの空間分布については光顕を融合計算手法18を提示します。筋原線維などミトコンドリアの微細構造コンポーネント。これは、心筋細胞の収縮を調節する生化学的なプロセスの心筋細胞内組織の役割を研究する生化学的なプロセスの生物物理のモデルで使用することができます有限要素モデルを生成します。たとえば、このプロトコルを使用してから健康的なモデルを作成できる、ストレプトゾトシン誘発糖尿病心筋細胞は糖尿病動物で観察される心筋細胞機能構造リフォームの効果を研究するモデル8。提案手法の統計的性質の付加的な利点はプロトコルにも示されている: メソッドは、セル構造の実験的に観察された変化を忠実に再現した有限要素のジオメトリの複数のインスタンスを生成することができます。

概要については、としてプロトコルの手順が含まれます: (i) 十分な解像度とコントラストの 3 D イメージを生成する電子顕微鏡検査のための心筋組織の準備(ii) 復興 3次元電子顕微鏡再構成および画像解析ソフトウェアを使用して電子顕微鏡データから 3 D 画像のスタックのセグメンテーションと呼ばれる IMOD20;(iii) iso2mesh21を使用して入力としてセグメントのデータを使用して有限要素メッシュを生成するには(iv) 新規アルゴリズムとコードを使用して、有限要素メッシュにイオン チャネルの分布をマップします。

各ステップへのアプローチの前提は、プロトコルに記載されている、代表的な結果は付属の数字で提供されます。生成された空間の詳細なモデルを使用するミトコンドリアバイオエナジェティックスと同様に、ECC、間にカルシウムの空間動態を勉強する方法を指定する概要を説明します。それらを克服し、さらに心臓システム生物学にセル構造の役割を定量的に理解を進める進められている新たな展開だけでなく、プロトコルの現在の制限のいくつか、説明します。他の細胞型の有限要素モデルを作成するこれらのメソッドを一般化する可能性がどのようにも解決されます。

このプロトコルのユーザーは、既存の電子顕微鏡画像のスタックへのアクセスを有すればステップ 1 とステップ 2 の復興の一部飛ばしてください。経験豊富な電子と共同で、データを取得しようとすると、ユーザーは、議論し、固定および汚損プロシージャ獲得のための最適なプロトコルを決定する専門家で手順 1 で比較するがあります。

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Protocol

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ここで説明したすべてのメソッドは、オークランド動物倫理委員会の大学、カリフォルニア大学、サンディエゴ動物介護施設ティッシュのプロトコルが開発された当初、利用委員会によって承認されています。

1. 実験準備

  1. 0.15 M と 0.3 M ナトリウムの溶液 ph 7.4の表 1によると cacodylate のバッファーを準備します。
  2. グルタルアルデヒド固定液 (pH 7.4 で 0.15 M ナトリウム cacodylate バッファーの 0.2% タンニン酸 2.5% グルタルアルデヒド + 2% パラホルムアルデヒド (PFA)) を準備コンポーネントを使用して表 1 に示します。
    1. 一定攪拌しながらホット プレート上 60 ° C で蒸留水 20 mL に PFA 粉末 2 g を溶解します。
    2. ソリューションがクリアされるまでに 1 M 水酸化ナトリウム溶液を追加します。
    3. 溶液の温度が 40 ° C を下回るまで待つ、グルタルアルデヒドと 0.3 M ナトリウム cacodylate 20 mL 10 mL を追加します。
    4. タンニン酸 0.2 g を追加し、ソリューションに溶解します。
    5. 0.15 M ナトリウム cacodylate の 50 mL を追加します。
    6. 同じ日に使用する場合、4 ° C で氷または冷蔵庫の中に定着剤の 3 つまたは 4 つの 20 mL シンチレーション バイアルを格納します。
  3. 表 1のレシピによると 20 mM 2, 3 butanedione ジアセチルモノオキシム (BDM) とタイロード液を準備します。
  4. シリカフューム戸棚内部蛍光装置を構築します。
    1. 2 つの異なるレトルト スタンド、スタンド ベースから高さ約 70 cm に 2 つ 100 mL プラスチック注射器チューブをクランプしてください。
    2. プラスチック注射器管と 3 mm 内径のチューブと三方活栓を使用して、図 1に示すように、コネクタ チューブを接続します。
    3. チューブ、心臓を灌流固定接続されますコネクタの下に 3 mm 外径カニューレをフィットします。
  5. タイロード液と 37 ° C で固定液注射器管を埋める
    1. それらを通して注射器ソリューションを渡すことによりチューブ内の空気の泡を削除します。

2. 心筋細胞微細構造の電子顕微鏡データを取得します。

  1. 切除と心の化学固定の動物を準備します。
    注: このプロトコルは、大人男性 Wistar (白鼠の特定の品種の名前) ラット心筋組織を処理する手順を説明します。プロトコルは、心筋組織が他の種から供給されるとき変更を必要があります。
    1. 腹腔内投与で 250 U/mL のヘパリンの 0.5 ml (体重 200-250 g) ラットを扱うことによって動物を麻酔します。ペントバルビ タール (210 mg/kg 体重) の腹腔内注入ラットを扱うまで、10 分間待ちます。
    2. つま先ピンチ反射をテストすることによって麻酔の適切な学位を確認します。
    3. 頚部転位によって、動物を安楽死させます。
    4. 以前公開されたゼウス記事に似たような郭清術を使用して心22,23、それからそれを置き氷冷生理食塩水での収穫。
    5. 上行大動脈を隔離し、cannulate。カニューレの先端は、冠状動脈が分岐を半月弁のすぐ上座っていることを確認します。上行大動脈の周りにしっかりと糸を結ぶ。
    6. カニューレを 〜 70 cm システム (図 1) の基盤上で重力駆動蛍光装置に接続します。
    7. 2 〜 3 分の 20 mM BDM (ミオシン阻害剤) を含むタイロード液で心臓を灌流して蛍光システムの活栓をねじる。
    8. 0.15 M ナトリウム cacodylate 37 ° c 10 分の 0.2% タンニン酸、2.5% グルタルアルデヒド 2% パラホルムアルデヒド固定液による血液灌流を開始するコックをひねます。成功した場合、中心部が淡い茶色を回すし、硬くなりゴムのような。
    9. 左心室 (側の) 自由壁からティッシュのブロックを解剖し、かみそりの刃を使用すると、組織ブロック約 1 mm3の大きさ。
    10. ストア 2 h. のための氷に同じ固定液の予冷 20 mL シンチレーション バイアルのサンプル、バイアルにできるだけ多くのサンプルを保存してソリューションのサンプルが水中に沈むこと。
      注意: サンプルの下の 100% の脱水のステップの後まで寒さを維持する重要です。
  2. さらに固定および電子顕微鏡用試料の汚損します。
    1. ガラス ビーカーに 0.15 M ナトリウム cacodylate バッファーを 100 mL 注ぎ、氷で冷やします。
    2. 4% 四酸化オスミウムと 0.3 M ナトリウム cacodylate、フェロシアン化カリウム 2% 2% 四酸化オスミウムと 0.15 M ナトリウム cacodylate を含む重金属染色溶液にフェロシアン化カリウム 0.08 g の添加に続いての平等なボリュームを準備します。氷の上の解決策を冷やして下さい。
    3. ピペットのうち定着剤、バイアルに試料が水没する十分な冷たい 0.15 M のナトリウム cacodylate バッファーを置き換えます。5 分間氷の上には、バイアルを配置します。
    4. 手順 2.2.3 0.15 M ナトリウム cacodylate 余分な定着剤を削除するとあと 4 回。
      注意: 小さな破片がサンプルに得ることができるティッシュ ブロック中にダイヤモンド ナイフを台無しにすることができますのでガラス ピペットを使用しないでください。事前のサンプルにそれらを追加する前に氷の上のすべてのソリューションを冷却することが重要です。サンプルに (部分的なカバレッジ以上数秒の非常に短い期間容認されるかもしれない簡単にソリューションの交換中に) すべての時間ソリューションによって覆われて残ることが重要です。洗浄またはソリューションを置き換えると、以前のソリューションを削除した後新しいソリューションを迅速に追加します。シンチレーション バイアル洗浄の間氷の上を保ちます。注意この手順は時間に依存しません、ティッシュのブロックが必要な場合は、少し長く洗浄が可能します。
    5. 冷たい重金属染色ソリューションとナトリウム cacodylate バッファーを交換し、一晩氷の上それを格納します。フェロシアン化はバイアルを手で振ることによってよく混合することを確認します。ソリューションが黒く必要があります。
      注意: は、オスミウムは有毒であるために、この手順を実行するとき、発煙のフードで動作します。
    6. 在庫 UA ソリューションの平等なボリュームと二重蒸留水を使用して 2% 4% 水溶液ウラニル酢酸 (UA) 原液 (表 1) を希釈し、氷でクールダウンします。
    7. 氷冷却 0.15 M ナトリウム cacodylate バッファー、重金属汚れに置き換えるし、氷で 5 分間インキュベート サンプルを聞かせてください。
    8. 過剰な重金属染色ソリューションを洗い流す氷の上 4 回 2.2.7 のステップを繰り返します。
    9. リンス サンプル 4 回 2 分の待ち時間の間に精製水 (ダブル蒸留で十分です)。
    10. 精製水を交換して冷えた 2% と UA とサンプル分間インキュベート 60 120 氷の上。
    11. 脱水の手順で使用する氷の上 5 の 20 mL シンチレーション バイアル (十分なサンプルが水没する) エタノールのクールダウンします。六つのバイアルがある蒸留水中のエタノールの割合が高まって: 20%、50%、70%、90%、100%。
    12. エタノール瓶と一緒に氷の上、別の 20 mL シンチレーション バイアルとクールに純粋なアセトンを注ぐ。
    13. 過剰な UA を洗浄する氷の上 4 回 2 分の待ち時間と精製水のサンプルをすすいでください。
  3. エタノールのサンプルを脱水します。
    1. 連続して氷の上、次のようにサンプル バイアル内のソリューションを置き換えることによって冷たいエタノール シリーズの脱水: 20% のエタノールの 10 分。10 分間; 50% エタノール70% のエタノールの 10 分。90% のエタノールの 10 分。その後、10 分間 2 回の 100% エタノール。
    2. 最後の 100% エタノールを冷却の純粋なアセトンに置き換えることにより部屋の温度にサンプルを移行し、10 分室温実験室ベンチにサンプル瓶を配置します。
    3. バイアル内で観察可能である結露を削除する室温で純粋なアセトンの 1 以上 10 分の洗浄を実行します。抱卵中、アセトン/樹脂溶液を作る。
    4. バイアルに純粋なアセトンを純粋なアセトンとエポキシ樹脂 (エポキシ樹脂部品メーカーによって前述の比率) を 50: 50 に置き換えます。同じバッチからすべてのコンポーネントを使用します。ローターで一晩樹脂充填サンプル瓶を残します。
  4. 樹脂に試料を埋め込みます。
    1. 75% 樹脂 (25% アセトン) 50: 50 樹脂を交換し、さらに潜伏/室温で 4 h の 100% 樹脂含浸により 3 h インキュベートします。
    2. 新鮮な 100% 樹脂 100% 樹脂に置き換え、組織サンプルに樹脂のより深い浸透のために夜通しサンプル瓶のまま。
    3. フラット ベースをバイアルからサンプルを取るおよびレンジ可の容器に置いて、アルミや銀の箔をベーキング カップはたとえばこの目的のため使用できます。
    4. (サンプルの変位を避けるため) にそっと注ぐ新鮮な (従って樹脂サンプルの埋め込み) サンプルを樹脂し、樹脂・ 48 h の 60 ° C のオーブンでサンプルを重合。
  5. 断面の画像セルに樹脂製ブロックを向き。
    1. 24セルの向きを評価するためにガラスのナイフで、ウルトラミクロトームを使用して樹脂ブロックから 1 μ m 厚テストのセクションを取得します。
    2. 20 厚テストのセクションを染色 1% トルエン ブルーと 1% ホウ砂 s。
    3. 明視野顕微鏡下で筋肉細胞の向きを確認します。
    4. 染色テスト セクションの画像から推定される方向に基づき、再向き縦または斜め指向 (図 2 aに類似) 細胞で断面 (カットされますガラス ナイフに公開されようにブロックを樹脂同様に図 2 b)。
  6. 電子線トモグラフィーを用いた画像ティッシュ セクション。
    1. 厚切切片を得る (~ 300 nm) 向きを変える組織のダイヤモンドを使用してブロックがナイフし、銅グリッド25にセクションを移動します。
    2. 2 %ua と佐藤リード25厚のセクションを染色します。
    3. セクション25の両側には、金コロイド粒子を適用します。
    4. +70 °25-70 ° から投影画像のシングルまたはデュアル軸傾斜シリーズのセットを取得します。
  7. 3 D 画像のスタック (単一電子断層レントゲン写真撮影のセクションの 3 D 情報を提供する, 二次元画像のシリーズ) を再構築する IMOD20を使用してセルの。この再建されたスタックは、次の手順でセグメント化されます。

3. セグメント筋原線維と EM 3 D 画像データセットからミトコンドリア地域

  1. IMOD プログラム"3dmod"を実行します。
  2. 3dmod グラフィカル ユーザー インターフェイス内「.rec」のアドレスを入力するか、3 D を含む".mrc"ファイル エントリ ボックスに (2.7 の手順で生成された) セルの画像データセットを再構築"画像ファイル:"、"OK"を押します。
  3. 「ファイル」メニューの下で新しいモデルを選択し、「保存としてモデル」を使用して適切な名前を持つファイルを保存...「ファイル」の下のメニュー項目。
    注: IMOD 内のオブジェクトは、「オブジェクト」を構成するセグメント化されたコンポーネントのコレクションを含めることができます。既定では、新しいモデルには id「#1」の新しいオブジェクトが含まれています。
  4. 「特別な」メニューの下には、「描画ツール」を選択します。図 3 aに示すような新しいツール バーが開きます。
    注: 異なるオルガネラの境界の周りの輪郭を作成するのに使用できるいくつかのツールがあります。これらのツールを使用する方法の詳細なヘルプは、IMOD20ドキュメントで参照できます。
  5. 「描画ツール」メニューで「スカルプト」オプションを選択し、イメージ ウィンドウへマウスを上に移動マウス ポインターを中心とした円形の輪郭が表示されます。
  6. ミトコンドリア (分界図 3Aで緑の輪郭線によって示されているように、画像ファイルの暗い領域) をマウスの中央ボタンを押し、その境界の形に円の輪郭の境界をドラッグします。
  7. ミトコンドリア境界の輪郭が完了すると、中ボタンを放すし、データで各ミトコンドリアに対して、手順 3.6。各輪郭は、同じオブジェクト内の新しい輪郭として IMOD によって自動的に認識されます。
  8. 下、「編集 |オブジェクト」メニュー、新しいオブジェクトを作成するには「新しい」を選択します。これは自動的に 1 つずつオブジェクトの合計数と、この番号を新しいオブジェクトに割り当てます。
  9. 3.6、3.7 セグメントし、筋原線維の輪郭を保存する手順を繰り返します。
  10. 同様にセルの境界を分割する手順 3.6、続いて手順 3.8 を繰り返します。
  11. 「ファイル」メニューの下でモデル ファイルを保存します。
  12. 各オブジェクトのバイナリ マスク図 4A ~ Cに示すようにグループ化に変換するコマンド ライン ウィンドウで次のコマンドを実行します。
    1. モデル「imodextract オブジェクト modelfile outputmodelfile"、"オブジェクト"が抽出するオブジェクトの番号から特定のオブジェクトを抽出します。
    2. そのオブジェクトのマスクを作成する: imodmop-マスク 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. ファイルを tif スタックに変換: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. セグメント化されたコンポーネントから有限要素メッシュを作成します。

  1. Iso2mesh は、TIFF 画像のスタックを体積の四面体有限要素メッシュに変換する自由に利用できる MATLAB プログラムです。ダウンロードし、iso2mesh.sourceforge.net から iso2mesh を MATLAB のパスに追加します。
  2. ソース コードと github のウェブサイト https://github.com/CellSMB/RyR-simulator からメッシュの RyR クラスターをシミュレートするためにデータをダウンロードします。
  3. CardiacCellMeshGenerator MATLAB アプリケーション (図 5) を開始します。
  4. GUI の左上側の 3 つのプッシュ ボタンを使用して MATLAB に異なるオルガネラ コンポーネント マスクを読み込みます。
  5. 筋原繊維および図 6 aに示すように、ミトコンドリアの間のギャップを設定する別のバイナリ画像のスタックを作成します。
    1. ImageJ を開きます。
    2. ファイルを使用して |ダイアログ ボックスを開く、プログラムに筋原繊維およびミトコンドリアの tiff スタックをロードします。
    3. イメージの追加プラグインを開始を選択して"プロセス |電卓プラス」。
    4. I1 として原画像のスタックを選択し、ミトコンドリアは画像のスタックと i2 は、「追加」演算子を選択します。「OK」をクリックします。
    5. 4.5.4 の結果を表す新しい画像のスタックが表示されたら、選択"編集 |図 6Aに似た画像のスタックを生成する"を反転します。
  6. CardiacCellMeshGenerator プログラムの"RyRGapsFile"ボタンを押して筋原繊維およびミトコンドリアの間のギャップのバイナリ画像のスタックを含むファイルをロードします。
  7. GUI の「メッシュを生成」を押します。これは図 4 eに類似した四面体メッシュを生成する 'cgalmesh' オプションを指定して iso2mesh コマンド v2m がトリガーされます。3 つのファイルがこの手順の終わりで出力されます: .ele ファイル、.face ファイル、および要素、面を構成するノードを構成するノードの一覧、およびノードの座標を含む .node ファイル、それぞれ。

5. 数学的に有限要素メッシュに関心のイオン チャネルの空間的に変化の密度をマップします。

  1. RyR シミュレータの GUI の生成 RyR シミュレータ入力のラベル ボタンを押して必要な入力を生成します。
    注: ボタンは、ステップ 4 から次の情報を使用して、入力を生成する関数 generateRyRsimulatorInputs.m をトリガーします。
    (1) outDir: RyR クラスター シミュレーションに必要な出力ファイルの場所。
    (2) imres: 画像のスタックの 3 つの方向のピクセルの解像度。
    (myofibril_file 3):図 4 bに示すようなバイナリ画像のスタックを含むファイル。
    (sarcolemma_file 4): 4 a を図に示すようなバイナリ画像のスタックを含むファイル。
    (ryrgaps_file 5):図 5 aに示すようなバイナリ画像のスタックを含むファイル。
    1. この関数を実行すると、outDir パスとして指定されたディレクトリ以下のファイルが作成されていることを確認します。
    • d_axial_micron.txt は、z ディスクの位置と画像のスタック内のピクセルの残りの部分の軸方向の距離を表します。
    • d_radial_micron.txt、RyR クラスターの可能な場所のセット内の各ピクセルから z ディスク平面上のピクセルにユークリッド距離 (軸のコンポーネントを除く) を表す。
    • W_micron.txt は、RyR クラスターに存在するすべての利用できる位置の空間座標のリストを表します。
    • フォルダーに残りの 3 つのファイルは、これらのファイル内の値はピクセル座標形式書かれたことを示すために"_micron"ではなく接尾辞"_pixel"を含まれています。
  2. 筋原繊維のバイナリ画像のスタックの RyR クラスター分布をシミュレートします。
    1. 「R でオープンの RyR シミュレータ」のラベル ボタンを押して R プログラムを開始します。
    2. R-gui で選択"ファイル |オープン」と「設定ファイルを見つけるR"RyR シミュレーター パッケージ (RyR-シミュレータ/ソース/設定します。R)。
    3. またファイル ryr シミュレータ並列を開きます。R (RyR-シミュレータ/ソース/ryr-シミュレータ-平行に位置します。R). Rstudio (https://www.rstudio.com) またはプレーンのコマンド ライン インターフェイスを使用できるような環境では、例えばシェルまたはコマンド ウィンドウで R64 コマンドを使用します。
    4. 設定のパラメーターを変更します。R 以下のファイルのとおり:
      1. Path2 を RyR クラスターと筋原線維の実験的に得られた共焦点画像のスタックの 5.1.2 に示すファイルが含まれているフォルダーのアドレスに設定します。
        注: github のリポジトリ フォルダー入力ファイル/マスター-細胞/以前に収集した画像のスタックの生成されたファイルが既に含まれています。
      2. 5.1.2 のステップで生成されたファイルが格納されているフォルダーのアドレスに Path4 を設定します。
      3. Path3 ポイントをユーザーが保存するシミュレートされた RyR クラスターの場所を望んでいるフォルダーに設定します。
      4. (通常は 200 ~ 300 の範囲) モデルでシミュレートする RyR クラスターの数 N のセット。
      5. Etol RyR クラスター分布測定と RyR クラスター分布シミュレーション モデルの違いの設定許容範囲を設定します。
      6. RyR シミュレータ必要があります etol 値を満たす模擬 RyR クラスター パターンを見つけるための試行回数を制限する numIter を設定します。
        注: etol および numIter の値は、設定内の典型的な値に設定されています。R ファイル。
      7. NumPatterns をシミュレートするユーザー別の RyR クラスター パターン数に設定 (通常、統計的信頼性を高めるのための 99 のパターンをシミュレートする有用な練習なのです)。
      8. 高速並列処理点パターンをシミュレートするために R を複数の CPU スレッド (コア) の使用を有効にするのに numCores を設定します。
    5. 以下のパッケージは、パッケージ インストーラーを使用してインストールされていることを確認してください r: 雪、doSNOW、doparallel、foreach、反復子、および保険の gui。
    6. R のコマンド ウィンドウで次のコマンドを入力して、シミュレータを実行: ソース (' ryr シミュレータ並列へのパス。R'、chdir = TRUE)
      メモ: RyR シミュレータ プログラムの出力 (numPatterns ファイルが生成されます) N 行での座標のリストを含む .txt ファイルの一覧では、x、y、および z 座標の n を表す 3 つの列、シミュレート RyR クラスター。
  3. CardiacCellMeshGenerator を用いた計算モデル上に空間密度としてポイントをマップします。
    1. ボタンのラベルを選択して「RyR ポイント ファイルの選択」、RyR シミュレータによる出力をしたものから模擬 RyR クラスター分布のテキスト ファイルを選択します。
    2. MATLAB で GUI で「RyR 密度マッパー」を実行します。これは、4.8 球状カーネルの強度推定法26と呼ばれる方法を使用しての手順で生成された有限要素メッシュ歩 5.3.1 で .txt ファイルでシミュレートされた RyR クラスターの空間位置をマップします。
      注: この手順の出力は各メッシュ ノードで球状体積比イオン チャネルの数値の密度の値の一覧を含む .txt 拡張子を持つファイルです。

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Results

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図 2から図 7は、このプロトコルのいくつかの主要ステップの代表の結果を提供する: (i) の可視化と組織ブロック断面電子顕微鏡ビューの方向(ii) 生成する 3次元電子顕微鏡画像のスタック;(関心のオルガネラの細胞内微細構造 iii) 分割(iv) iso2mesh; を使用して有限要素メッシュの生成(v) 現実的なメッシュの RyR クラスター分布をシミュレートします。(vi) 計算メッシュ空間密度としてこの空間分布をマッピングが続きます。

図 2縦方向のセルの表示方法を示す典型的な明視野画像が表示されます (図 2 aL のラベル)、斜め (図 2 a...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記のプロトコルでは、心筋細胞微細構造の新しい有限要素の幾何学的モデルを生成する重要な手順について説明します。メソッドにより空間細胞アーキテクチャの詳細を含む心筋細胞動態のより包括的な計算モデルを開発する各種の顕微鏡 (または、原則として、その他のデータ) 計算の融合療法です。現在では、心筋細胞のようなモデルの作成に利用可能な他のプロトコルはありません。

ステップ 1 では、灌流固定のためのプロトコルについて説明します。また、心臓摘出より小さな部分に解剖でき固定液に浸漬します。ただし、このプロセスはすぐに行う必要があります、サンプルのサイズによって結果を変えることが。筆者の経験では、灌流は組織や細胞固定液の徹底した浸透を確認します。著者も以前中心にクレブス Henseliet ソリューションと心臓を灌流固定前にビート。これは、固定する前に作業中心の測定を有効になります。

ステップ 2 の電子顕微鏡検査処理手順は電子線トモグラフィーの典型的であります。シリアル ブロック面走査電子顕微鏡、イオンビーム顕微鏡

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Disclosures

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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgements

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この作品は、ロイヤル会のニュージーランド マースデン高速起動許可 11-UOA-184、人間フロンティア科学プログラム研究助成 2013 年 RGP0027 月とオーストラリアの研究評議会発見プロジェクトの助成金 DP170101358 によって支持されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
材料
塩化ナトリウムSigma-Aldrich746398
塩化カルシウムSigma-AldrichC8106
塩化マグネシウムSigma-AldrichM2393
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761
塩化カリウムSigma-AldrichP5405
デキストロースSigma-AldrichD9434
水酸化ナトリウムSigma-AldrichS8045
プロベネシドSigma-AldrichP8761
2,3-ブタンジオン モノキシムSigma-AldrichB0753
25% グルタルアルデヒド EM グレード (500 ml ボトル)メルク354400-500ML
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148
タンニン酸Sigma-Aldrich403040-500G100g EM グレード
カコジル酸ナトリウムSigma-AldrichC0250
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichP4593
四酸化オスミウムSigma-Aldrich75632-10ML4% 水、5 ml ボトル (または 10 ml ボトル)また利用可能)
酢酸ウラニルEM科学2240025gボトル
カリウムフェロシアン化物メルクミリポア104973
トルエンブルーシグマアルドリッチT3260
ホウ砂シグマアルドリッチS9640ホウ酸ナトリウム
タノールシグマアルドリッチ792780とも呼ばれ、さまざまなパーセンテージに希釈されています。純水
アセトンEM サイエンスRT10017
レジンキットEM サイエンス14040ACM Durcupan はよく効く
塩酸シグマ・アルドリッチH98921Normal solution
Equipment
UltramicrotomeライカEM UC7
透過型 電子顕微鏡サーモフィッシャーサイエンティフィックテクナイ F30http://www.leica-microsystems.com/
レトルトスタンドProscitechT752
チューブバイオストラテジー75831-346ランゲンドルフ灌流装置用、直径 3 mm をお勧めしますが、必須ではありません
ストップコックSDRQP13813ランゲンドルフ チューブ用; 製品は一例であり、ユーザーは任意のものを選択できます
レトルトスタンドクランプProscitechT715
ゲンドルフ装置の溶液用シリンジSDRQPC1108
カニューレ挿入シルク縫合糸、7-0TeleFlex15B051000ランゲドルフ装置の心臓を結ぶための
ニューレ3 mmの外径スチール針から作られ
ました ゴム製ペトリ皿マットProscitechH068固定心解剖時のまな板として使用
カミソリの刃EM処理用の小さなブロックに固定心を切断するためのProscitechL056
ガラス瓶固定およびEMビーカーの処理中に溶液を保存するためのBioStrategy89000-236
BioStrategy213-0477を一時的および灌流
中に保存するためのEM処理中の組織サンプル用BioStrategy548-2170
解剖キット動物解剖用ProscitechT161
シリンジフィルター酢酸ウラニルの精製用ProscitechWS3-02225S
アルミニウム/銀箔ベーキングカップ任意のベーキング製品店から
デュポンダイヤモンドナイフBioStrategy102680-78035度の角度バージョンは、最高の切片を生成します。
コロイダルゴールドBBIソリューションEM。GC1515 nmコロイド金
EMメッシュグリッドProscitechGCU150さまざまなサイズをテストできます:GCU150h、GCU200hたとえば
プラスチック廃棄ピペットProscitechLCH20
SerialEMボルダーモグラフィー取得
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD University of Boulderand segmentation
iso2meshavailable at http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji または同様の画像処理ソフトウェアImageJFiji はバイナリ画像の操作のために https://fiji.sc で利用可能な Just Image J ですスタック
RyR-Simulator コード/データCellSMB グループ
https://github.com/CellSMB/RyR-simulator CardiacCellMeshGeneratorCellSMB グループには、RyR-Simulator のフォルダ "gui-version" に付属しています。
R-統計ソフトウェアR-projecthttps://www.r-project.org
spatstatR-projectからダウンロードRプログラムによるインストール
rglRプロジェクト Rプログラムによるインストール
doparallelRプロジェクトRプログラムによるインストール
各Rプロジェクトによるインストール Rプログラムによるインストール
doSNOWRプロジェクトによるインストール Rプログラムイ
テレータRプロジェクトによるインストール
は、エランプラスチックカ 組織 溶液シンチレーションバイアル 、は、特に樹脂ソフトウェアトで作業するときにプラスチック使い捨てを使用するのが最適です Image alignment 、によるによるインストール によるインストール Rプログラム

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