3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

サマリー

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D 空間での議事録作成のサイトを検索する方法を説明します。

要約

遺伝子の空間的で、一時的な規制が適切な遺伝子発現を支配するの不可欠な部分であることが知られています。その結果、核空間内で転写が行われて、いつどこを理解し、エピソーム同じ細胞の核内に感染との関係を視覚化するが有益です。ここでは、蛍光抗体法 (IFA) と RNA の魚をされているに転写してカポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) エピソーム総収入を識別します。KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ) を染色によってウイルス エピソームが核内に存在する検索することが可能です。さらに、生産的な伝染の間にだけ表現されるウイルス遺伝子のイントロン領域を対象とする魚 RNA プローブを設計することによって初期の RNA 転写産物に配置できます。この分子プローブの組み合わせを使用して、大規模なウイルスの転写工場の組立を視覚化および分析 KSHV 再活性化中にウイルスの遺伝子発現の空間情報の制御することが可能です。抗 RNA ポリメラーゼ II 抗体の汚損などによる RNA ポリメラーゼ II (RNAPII) の集約と再アクティブ化の間に KSHV 転写関係を視覚化することも 1 つ。

概要

それは核の時空間の組織が真核生物で細かく調整された遺伝子の発現を調節する際に重要な役割を果たしていることがますます明らかになっています。ほとんどのティッシュ特定の遺伝子は多くの染色体に分散されているし、調整方法¹特定の刺激に応答するために同期的に規制する必要があります。細胞は、核の特定の空間¹遺伝子とそのシスのコンポーネントをまとめるための方法としてアクティブなクロマチン ハブ (ACH) を構築します。

それも実証されている様々 な研究によって核思われます非常に密な粘性が、生理活性分子を経由できること核より迅速に拡散²を経由。この一時的なプロパティは、結果としてほとんどの DNA 結合タンパク質 'ジャンプ' 結合により、高い適応性と汎用性の高い核²原子力の分野の周り自分の道を感じるサイトへサイトのバインドから。

核内の分子の動的挙動がこの、にもかかわらず核体膜なしなど (ただしこれらに限定されない) 核小体、カハール体および前骨髄球性白血病核体 (PML の-NB) がまだ存在します。それはタンデム DNA 繰り返し (仁)、rRNA (仁) と coilin (カハール体) など PML タンパク質などの様々 な蛋白質 (PML の-NB) これら構成要素一緒に^{3,4,5 を保持します。}.これらの構造と転写工場など他の集会だけでなく必要なコンポーネントのローカル集中を高めるが、またタンパク質や核酸最終的に作成するそれらの内の組成を調節する足場として、効率的な細胞機能⁶中央のサイト。

核構造のフォームは、エピジェネティクス研究に豊富な情報を提供しますいつ、どこの可視化。ウイルス学の観点から KSHV などの潜伏感染したウイルスの再活性化大幅核の風景とウイルス遺伝子を細胞の遺伝子から主に転写を最終的にシフトする核酵素の分布を変更するには完全に機能ウイルス子孫^7、8を生成します。KSHV はどのようにウイルスの遺伝子発現を促進する細胞遺伝子式機械を操作できますか。そのような情報は、細胞特異的な遺伝子発現制御機構に光を当てることができるも。

他のヘルペス ウイルスは、同様 KSHV 複製と遅延と呼ばれる 2 つのライフ サイクルがあります。KSHV は遅延関連遺伝子^9,10を除いて、式の沈黙で、ほとんどのウイルスの遺伝子の潜伏段階で主に存在します。生成 KSHV 待ち時間中に待ち時間は恒常とウイルスのゲノムを縛り、人間の染色体¹¹ウイルス クロマチンをテザー核抗原 (ラナ) を関連付けられています。ラナのウイルスのゲノムとの親密な関係のため、IFA および DAPI を使用して染色し、ウイルス エピソームがホスト クロマチンに関連していた検索することが可能です。

単一 episome レベルおよび感染細胞内の他のウイルスのエピソーム関連付けで KSHV を再活性化を勉強するには、手段を使って、積極的にその場でウイルス クロマチン転写を設置します。したがって、ラナとイントロン RNA 魚と RNAPII を対仏投資庁に結合されたは KSHV K Rta のキーのウイルス蛋白質のイントロン領域 (泉谷ラボの最新出版物⁸シーケンスを見つけることができます正確なプローブ) にバインド魚 RNA プローブを生成することによって不可欠と KSHV 再活性化-それは識別すること十分な転写が取っていた実際にどこの場所^{8,11,12,13,14,15}.このイントロン RNA 魚の技術すぐに融着接続、細胞質^16,17にエクスポートする前に、mRNA が転写されている視覚化することも可能。 にします。

KSHV ホルボールエステル 12-O-Tetradeconoyl-ホルボールエステル-13acetate (TPA) などを含む様々 な化学的刺激によって再びアクティブにできます、酪、さらに KSHV などヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が誘導され、過剰発現による再アクティブ化ウイルスの転写因子、K Rta¹⁹。研究者は再活性化¹⁸を誘導する前にセルのサイクルを同期することによって正常に KSHV 再活性化の効率を増加しています。したがって、これらの特定の研究は、細胞は二重チミジン ブロック (下記のプロトコル) を使用して、短時間 TPA とドキシサイクリン (Dox) インキュベートに同期されました。これらの実験に利用されている細胞株はドキシサイクリン誘導された K Rta カセットは、cDNA から複製された、K Rta のイントロン領域は含まれませんので、ドキシサイクリンが使用されました。再アクティブ化することが可能だが K Rta 式を誘導 KSHV を使用してのみ、それは、さまざまな異なる生化学的要因により K Rta 式だけがかすかな再活性化刺激²⁰と証明する他の研究者によって証明されています。これらのすべてを組み合わせることで、薬物孵化に時間の短い期間を制限することにより、イメージングの堅牢な過度に人工的ではない KSHV 再活性化が達成されました。

ラナ、RNAPII、ラベリング後 K Rta イントロンととしての DNA は、このペーパーで説明、広視野デコンボリューション顕微鏡を用いた 3 D 蛍光イメージングを行った。イメージング ソフトウェアとの処理の後は、アクティブなウイルス エピソームの空間分布を正しく評価できます。この手法を使用すると、アクティブなクロマチン ハブやその他の核構造の形成の基本的な性質に関する中央の質問を学ぶことができます。同じ規制要素を処理する単一のセルに同じウイルス エピソームを持つ時空間の遺伝子発現制御機構の理解を深めるためのユニークな研究ツールがあります。

異なる時点で固定する複数の細胞標本が、本質的に動的分子プロセスを特徴付けるためのイメージングの制限事項は蛍光分布の微妙なあるいは小規模の変化が検出されているまたは取るに足りないと判断します。これはまれなインスタンスの観察のすべてのセルが同じの微妙な変化を表示されない場合です。したがって、アクティブなウイルスの転写およびその他の核構造の全時空間関係批判的に評価できません固定のイメージングを使用します。これらの技術的な課題に対応するには、最善の方法は、ウイルス エピソームをマークしている生きた細胞をイメージし、時間の経過とともに細胞の主要な酵素の場所に従うことです。

プロトコル

注意: この手順で使用される細胞感染ウイルスを含んでいる、注意、レベル 2 BSL 施設以上時だけ進みます。

1. セルの準備とメンテナンス

1. TREx K-RTA BCBL 1 細胞の培養 (または別 KSHV 感染 PEL セルライン) 15% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン ストレプトマイシン グルタミン溶液添加 RPMI1640 培地で。
2. 継続的に成長し、1:4 の比率は、2-4 日おきにセルを分割するように 5% 二酸化炭素 (CO₂)、37 ° C で細胞を成長します。
3. 良い細胞増殖と形態は、それ以外の場合に細胞培養を再起動するか、または細胞培養条件を調整するは、勧めを確認する毎日光顕微鏡による培養細胞を監視します。

2. チミジン同期と溶解誘導

1. 10 cm シャーレで TREx K-Rta BCBL 1 細胞作りたてメディア (メディアの 1 x 10⁶セル/2 mL)
2. 200 mM チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) 皿にミックスし、18 時間孵化させなさい。
3. 遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。
4. 8 h に S 段階を終了するセルを許可します。
5. チミジンを追加 (最終濃度: 2 mM) をミックスして 16 時間孵化させなさい。
6. 遠心分離機 500 x g に 5 分のセル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機、作りたてメディアで細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。作りたてのメディアで再懸濁します。
7. ウイルス再活性化を誘導するには、細胞培養に 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA、最終濃度 20 ng/mL) とドキシサイクリン (DOX、最終濃度 100 ng/mL) を追加、ミックス、4 時間インキュベートします。K Rta 誘導カセットなしセルライン、TPA (最終濃度 20 ng/mL およびナトリウム酪 (1 mM)) を使用して再活性化を刺激するため。
8. 遠心分離機 500 x g に 5 分セル洗浄と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x セル、再び、遠心分離機および完全な培地で細胞を再懸濁します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。完全な文化メディアで再懸濁します。
9. 24 h に成長する細胞を許可します。

3. 固定・透過

メモ: 先に進む前に必ず固定ソリューション (DEPC 処理 PBS で 3.7% ホルムアルデヒド)、ジエチル pyrocarbonate 処理リン酸緩衝生理食塩水 (DEPC PBS)、グリシン DEPC PBS (グリシンの最終濃度: 100 mM) および permeabilizating 溶液 (50%アセトン、50% メタノール) を用意しています。通常、各スライドが少なくとも 50 万の細胞を必要とする、必要に応じて乗算し、細胞が健康ではない場合に特にを背面に余分なセルが含まれています。

1. 1.5 mL 遠心チューブに細胞を収集します。
2. 3 回で 1 mL の滅菌の DEPC PBS セル 200 x g. 洗浄で 2 分間細胞を遠心分離機します。1.2 mL の DEPC PBS に再懸濁します。
3. 6 ウェル プレートの底に coverslips (実験のセットアップによって決まります) の適切な数を配置します。
4. セルに各 coverslip DEPC PBS 混合物の 200 μ L をピペット、少なくとも 50 万の細胞が各スライド上にあることを確認します。2 分のために解決の細胞し、細胞の薄い層だけを残して余分な DEPC PBS を吸引します。このプロセスで、削除するセルは正常です。
   注意: PFA は有毒である、適切な保護具を着用します。
5. 慎重に各カバー スリップするソリューション (DEPC PBS で 3.7% ホルムアルデヒド) の修正の 1 つの mL を追加します。10 分間を修正するセルを許可します。
6. Coverslips DEPC PBS で 3 回洗います。
7. 慎重にグリシン DEPC PBS の 1 mL を追加 (グリシンの最終濃度: 100 mM) 各カバー スリップします。5 分急冷するセルを許可します。
8. 5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加または 1 分吸引超過の DEPC PBS のためしっかりと、優しく手を振る。セルを破壊しないように注意します。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。
9. 慎重に構造の各カバー スリップに (50% アセトン、50% メタノール) ソリューションの 1 つの mL を追加します。15 分間 permeabilize セルを許可します。
   注: この時点で、coverslips はもはや一週間以上の-20 ° C のフリーザーで格納できます。凍結を避けるか、画像の品質が急激に低下、冷凍庫に費やされる時間を最小限に抑えます。確認するときにセルのまま冷凍庫ウェットとメタノールまたはアセトンと彼らは正しく冷凍庫から取り出した後 DEPC PBS で補給できるように屋根付き。
10. 5 分のシェーカーで 1.5 mL の DEPC PBS のいずれかの場所を追加またはしっかりと振るが手に優しく 1 分超過の DEPC PBS を吸引、セルを破壊しないように注意してください。3 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。

4. IFA と RNA 魚

注: 魚 RNA プローブのラベル付けと準備について: の K-Rta 959 塩基対、31 の異なるプローブであるイントロンが生成され、20 塩基対、各 GC を含む約 50% の満足していました。プローブの作業、在庫ソリューションであった 100 μ M 及び 2.5 μ M の濃度に避けよう。

1. 実験に必要な情報または区別のラベルのいくつかの並べ替えを持つ顕微鏡スライド ラベルを付けます。
2. 湿ったペーパー タオルでヒートシール可能なプラスチック製の容器の底を並べ。
3. 一次抗体溶液を調製 (1.5 μ L ラナ抗体、0.75 μ L の RNA Pol II 抗体、ベーカーの 3 μ L の酵母まで 30 μ L の DEPC PBS、tRNA) とそれぞれの coverslip の存在のためのレシピを乗算します。各ラベル付き顕微鏡スライド上に一次抗体ソリューションの場所 30 μ L。
   1. まず興味の一次抗体を滴定し、最適な量を使用します。必ず使用して精製された IgG 血清 (腹水) が RNase の大量を含んでいる可能性があります。
4. ラベル付き顕微鏡スライド上に coverslip (ソリューションを直面しているセル) を置き、湿ったペーパー タオルでコンテナーにスライドを移動します。気泡を導入することに注意してください。プラスチック製のラップとコンテナーの外装をカバーします。1 h の 37 ° C に設定インキュベーターにコンテナーを移動します。
5. (2 x 生理食塩水のナトリウム クエン酸バッファー (SSC) (最終)、10% ホルムアミド、90% DEPC dH₂O) 魚洗浄バッファーを準備します。
6. 交配バッファー x 2 を準備 (4 x SSC、20% デキストラン硫酸)。
7. 二次抗体と魚イントロン プローブ バッファーを準備 (交配バッファー (Hyb バッファー x 最終 1) x 2 の 20 μ L、パン酵母の 4 μ L tRNA (最後の 10%)、ホルムアミド (最後の 10%)、イントロン K Rta プローブの 4 μ L (最終的な 125 nM)、0.8 の二次抗体、DEPC dH₂ μ g40 μ L まで O)。必要なすべてのスライドのためのレシピを乗算します。
8. インキュベーション後、3 回 5 分 6 ウェル プレートで DEPC PBS のセルを洗浄します。
9. 3 回各 5 分の魚洗浄バッファーで洗浄します。第二に抗体とイントロンのプローブ (ステップ 4.7) の混合物の準備完了するまで魚洗浄バッファーの coverslip を維持します。
10. きれいなガラスのスライドは、一次抗体の孵化の交配のために使用されます。
11. 二次抗体とスライド グラスの上にソリューションを含む魚イントロン プローブの場所 40 μ L。
12. 泡を導入するしないように注意をする、バッファー上に下向きセル側でスライド上に細胞を coverslips を配置します。
13. 底に湿ったペーパー タオルでプラスチックの容器にスライドを配置します。最初のラップとし、アルミ箔とプラスチックの容器をラップします。
14. 16-24 h 37 ° C でスライドを持つコンテナーを孵化させなさい。
15. インキュベーション後、慎重にスライド、coverslip スライド ガラスの端から 6 ウェル プレート、上向きに戻す、3 回 5 分 6 ウェル プレートで魚洗浄バッファーを持つセルを洗浄します。
16. 2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。
17. 2 に DAPI (1:1, 000) を追加 x SSC し、室温で 5 分間座ることができます。
18. 2 回で 2 セルを洗浄して x SSC。
19. 交配用スライド ガラスをきれいにしガラス スライド上にソリューションを装着の 10 μ L を追加します。
20. Coverslips フェイス ダウンをマウント ソリューションを配置します。気泡を導入することに注意してください。
21. 研究所の組織と細胞をスカッシュに触らない、余分なマウント ソリューションを注意深く取り外します。
22. マニキュアを使用して、coverslips の端のまわりの十分な層を適用して乾燥することができます。
23. 蛍光顕微鏡を実行に進みます。

5. 3 D 蛍光顕微鏡

注: プロトコル使用蛍光顕微鏡システムの種類で異なりますが、次の手順、定量分析のための最適な画像データの取得を保障を助けます。

1. 固定サンプルを前処理し、イメージング中に蛍光退色を遅延する耐フェード メディアでマウントします。
2. 全体のセル (またはセルの核) をキャプチャすることができます (60 X 1.42 N.A 油浸型レンズなど)、高品質の目的を使用して、ビューのフィールドで。
3. 正と負のコントロールのサンプルを使用して、それぞれの蛍光カラー チャンネルの露出パラメーター (例えば、励振電力、露光時間) を設定します。蛍光画像を取得します。
   注: のみ 1 つの蛍光ラベルを含む肯定的な制御サンプルは、「クロストーク」カラー チャンネル間のレベルを決定するのにも使用ください。画像固定細胞標本の退色を最小限に抑えるため、(わずかにより長い露光時間) と蛍光励起電力を削減できます。
4. イメージングのプロトコルを確立すると、維持同じ露光パラメーター研究のすべてのサンプルに対する一貫性のある-ので、画像データを正確に分析および比較が可能します。
5. 買収後の画像処理と 3次元復元を実行します。特定 RNA 魚信号 (赤) で K Rta 成績証明書、ラナ分子蛍光抗体法 (緑) と核クロマチン (該当する場合) 染色 DAPI (青)。
   注: K Rta とラナが共同クラスターである細胞核の領域従ってウイルス転写工場および複雑なレプリケーションに関連する考えられています。

結果

やや弱めのプロトコルを行った BCBL 1 セルを用い、ラナと K Rta RNA のみ染色 (図 1)。この実験では、積極的に転写のウイルス エピソームがあると細胞の人口に KSHV 再活性化刺激への反応の不均一性を調べることが出来ます。図 1の矢印で示されたセル、密接にウイルス エピソーム (ラナでマーク) の分布に一致する領域で異なる K Rta 蛍光は KSHV ゲノムに近い場所を取ってアクティブな転写のための証拠。同じサンプルでは図 1の矢印で示される 1 つのような細胞が観察できます、くらい弱いとびまん性 K Rta 蛍光大幅と重複しないラナとを表わす。これは細胞の人口の内で再活性化刺激への反応の程度にはかなりの変動があること一般的な所見を示しています。

ディスカッション

異常な状況に合わせて変更することができますプロトコルのいくつかの側面があります。固定・透過バッファーの選択を変更することも。固定バッファーのパラホルムアルデヒドも効果的で、透過性のエタノールを使用ことができます。

ホルムアルデヒドがウシ血清アルブミン (BSA) の不在で抗体を無効にするを防ぎますが、グリシンの PBS のステップをスキップできます、coverslips を洗って徹底的に十分な場合、PBS お勧めグリシンとホルムアルデヒドを焼入。プロトコルでは、ブロッキング液としてウシ血清アルブミンを使用して避けてください。パイロットによる RNA の劣化と思われる RNA 魚、弱いシグナルを示した泉谷ラボで実施。一次抗体のブロックが必要な場合は、RNase フリー BSA を使用することをお勧めします。過去の経験、それがついた、抗体が特定の場合 BSA の包含は反応に必要ありません。ただし、それは常に酵母すべて孵化の tRNA のステップ超過額を含める推奨 RNA の劣化を防ぐ。これは、エージェントをブロックとして tRNA を使用して、特定の RNA 魚信号が増加したことが注目...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI medium 1650 GlutaMAX	Gibco by Life Technologies	61870-036	37°Cまで温める必要があります。C
ウシ胎児血清	オメガサイエンティフィック株式会社	FB-11
ペン 連鎖球菌性グルタミン (100x)	Gibco by Life Technologies	10378-016
チミジン	シグマ アルドリッチ	T9250
ダルベッコS リン酸緩衝液	Gibco by Life Technologies	14190-144
TPA	Sigma Aldrich	P1585
酪酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	B5887
ホルムアルデヒド溶液	シグマ アルドリッチ	252549	腐食性、毒性、健康被害
ジエチルピロカーボネート	シグマ アルドリッチ	D-5758	急性毒性
グリシン	シグマ アルドリッチ	410225
アセトン	シグマ アルドリッチ	179124	可燃性、有毒
メタノール	フィッシャーケミカル	67-56-1	可燃性、毒性、健康被害
ラット モノクローナル抗体 KSHV/HHV-8 ORF73	Advanced Biotechnologies	13-210-100
抗 RNA ポリメラーゼ II 抗体クローン CTD4H8	EMD Milipore	05-623
リボ核酸、パン屋からの転写酵母(S. cerevisiae)	Sigma Aldrich	9014-25-9
生理食塩水クエン酸ナトリウムバッファー 20x (SSC)	サーモフィッシャーサイエンティフィック
ホルムアミド	Sigma Aldrich	295876
Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution	EMD Milipore	1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306
slowFade Gold 退色防止試薬	Life Technologies	S36936
マイクロカバーガラス 22x22	松波	C022221
VoloCITY		3Dイメージングソフトウェア
DeltaVision顕微鏡
Superfrost/Plus顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-550-15