ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

サマリー

造血幹・前駆細胞 (HSPCs) ゼブラフィッシュ胚を量的に簡単な方法を紹介します。成熟した血液へと分化支持の要因とセルロースでめっき解離ゼブラフィッシュから HSPCs います。これにより血液の検出欠陥や薬剤のスクリーニングを簡単に行なうことができます。

要約

造血は造血幹・前駆細胞 (HSPCs) が分化成熟した血液を構成する異なる細胞系譜の多数、重要な細胞プロセスです。これらの HSPCs の分離・同定は難しいので定義された事後彼らは、特定のセルにその分化後だけ定義できます。過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) 造血を調査するモデル有機体となっています。ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex、開発し、48 時間後受精 (hpf) によって HSPC 分化を評価するために決定的な HSPCs アッセイを生成していると移植を利用した増殖機能が開発されているとそれ以降。共焦点顕微鏡を用いた特殊な形質転換線の可視化に加えて造血システムの再構成。ただし、これらの試金はコストが法外な技術的に困難で、多くの実験室では時間がかかるです。HSPCs を評価するための in vitroモデルの開発はより速く、費用対効果になるし、以前に比べて現在の少ない困難に HSPC 生物学に影響を与える突然変異や薬物の画面をすばやく評価する所を可能にするメソッドが記述されています。HSPCs を評価するためにこの小説の in vitroアッセイは、めっき解離全体ゼブラフィッシュ胚とだけ HSPC の分化と増殖を促進する追加の外因性の要因によって実行されます。胚が単一のセルに分離される、単一の前駆細胞から生じるコロニー形成単位 (CFUs) を生成させる HSPC 支持のコロニー刺激因子とメッキします。これらの試金からの分子経路のより注意深い検査ように HSPC 増殖、分化および脊椎動物の造血の基盤とその調節不全を理解する研究者を可能にする規制を担当中に病。

概要

増結は、生物の生存に必要な成熟した血液細胞の多数を作るプロセスです。成熟した血液を構成する発達制限携帯各種に造血幹細胞 (造血) の分化を含むキーの発達プロセスです。これらの造血システムが枯渇しないように、初期胚から死に至るまで維持されている必要があります更新する必要があります。ポスト mitotic の血液細胞の大半を十分に補充するために、脊椎動物の造血幹・前駆細胞 (HSPCs) の定数の分化・増殖を必要な毎日がリサイクルされていると。HSCs は制限された幹細胞のサブセットに最初の差別化によって成熟した血液細胞を生成します。一般的なリンパ球前駆細胞 (CLPs)¹、最終的に T、B、NK 細胞を作り出す、および一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp)²顆粒球、赤血球、巨核球マクロファージを生成します。これらの前駆細胞が特定の細胞系譜を生成するのにコミットしているし、骨髄赤芽球系前駆細胞 (Mep) 顆粒球や血小板、赤血球を生成するなどの詳細の発達制限前駆細胞へと分化好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージの²を生成するマクロファージ前駆細胞 (省)。識別し、これらの前駆細胞を分離することにより重要な分子経路の同定、造血分化に関与して白血病などの多くの造血器疾患発生これらの前駆細胞が正常に失敗するとき区別します。

過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) モデル システム胎児および成体造血研究重要な研究ツールとなっています。ゼブラフィッシュ遺伝子解析に適しているで、系統発生的に最も低い脊椎動物のモデル種と同様血管と人間に造血システムを持つ。Zebrafish の胚が子宮、ex開発し、48 時間ポスト内受精 (hpf) は HSPCs^{3,4,5,6,7、8}を生成します。ゼブラフィッシュは、また非常に肥沃な女性シングル クラッチで 100 個の卵を産卵大きいサンプルの大きさおよび実験的レプリケーションを可能にします。Zebrafish の胚が光学的に透明な造血系の顕微可視化を可能にします。蛍光遺伝子組換え数行ゼブラフィッシュrunx1など HSCs をマーキング: EGFP 魚⁹、 cd41: EGFP 魚¹⁰、およびkdrl:mCherry;cmyb: GFP³二重肯定的な動物、HSC の出現と拡大生体内で^{3,4,7,8、ライブ、リアルタイムの可視化を可能にします。 9}。ゼブラフィッシュの速い世代時間と開発子宮 exにおける突然変異誘発の研究^{11,12,13,14,15}と薬物使用につながっています。^{16,17,18,19、20}人の血液疾患の治療の約束を保持する化合物をスクリーニングします。全体的にみて、造血系、存在と形質転換線、および迅速な再生時間を容易に開発の保全したゼブラフィッシュ造血の研究のための安価な迅速、柔軟、かつ理想的なモデル。

分離して造血をテストの多数の方法は、哺乳類の造血システムで開発されています。調査官は、流出色素^25,26HSCs の能力を悪用すると同様、HSCs^21,22,23,24をマークに細胞表面受容体の組み合わせを利用できます。彼らにラベルを付ける蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの物理的な分離ができます。セルが、HSC であることを証明するには、内因性 HSPCs、推定 HSCs 移植と成熟した血液細胞の種類すべての長期的な多系統の再構成を観察することを破壊するホスト動物を照射する必要があります。これらのアッセイは、造血細胞移植免疫のマッチングを容易にする近交系マウス系統と多数細胞表面の抗体があるのでマウスでよくはたらきます。ただし、いくつかのゼブラフィッシュ造血細胞表面の抗体は、生成された²⁷, 同定と HSCs の分離を妨げることをされています。マークし、ゼブラフィッシュ HSCs を分離する最も一般的な方法は、トランスジェニック動物、セル固有のプロモーターは、蛍光タンパク質の発現を運転するという。研究は可視化して、背側大動脈の腹側の壁の HSCs の列挙にはこのテクニック^3,4,8,9を利用した顕微鏡。他の研究室は、ゼブラフィッシュ^28,29系統のクローンを生成しているし、MHC 一致動物³⁰の成功移植を実行しています。ただし、これらのテクニックは、多くの実験室は膨大なコスト、技術的に困難でありは時間がかかる。これらの問題に対処するため研究所は存在、増殖率と HSPCs^{31,32,33、分化能力をテストするためのいくつかの in vitroアッセイを生成しています。 34,35,36}。これらの試 HSPCs体外^{31,32,33,34,35,36}, の救助の増殖・分化を示す造血障害³⁶と発見とサイトカイン^33,34,35のテストのための効率的な方法です。彼らはまた、HSPC 生物学^31,32の遺伝子を識別するために利用されています。この研究では、私たちが一歩これらの試さらに、ゼブラフィッシュの胚の HSPCs の定量を可能します。これらの試また変異動物の HSPCs の数を量的に利用することができ、動物が破壊的造血薬で治療します。本質的に、これらの試金は高速、現在のいくつかの技術的な課題、HSPC 数字を量的に表わす、彼らの増殖を調べるし、分化におけるブロックを調査する安価な方法をあります。

プロトコル

カリフォルニア州立大学、Chico、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 諮問委員会は、以下に述べるすべての方法を承認しました。

1. 漂白剤 48 hpf ゼブラフィッシュ胚

1. 15 cm (w) x 15 cm (l) 7 cm (h) プラスチック容器 × 3 の洗い場を作成: 1000 mL 胚中 (E3;表 1参照) で 5% の漂白剤の 1 mL と 1)、2) 滅菌 E3 と 3) 滅菌 E3。胚が水没する溶液 500 mL を各コンテナーにいるを確認します。
   注: テスト条件ごとに、少なくとも 10 の胚が必要でしょう。この洗浄方法は、最大 200 の胚を収容できます。
2. 転送ピペット茶漉しに胚を配置し、5 分 (内の胚) と茶漉しを削除し、洗浄駅 #2; 5 分間の手洗い所 #1 の卵が水没最後の 5 分間洗浄駅 3 番に繰り返します。
3. 最後の洗浄後茶漉しクリーン 10 cm シャーレを逆さま回すと胚を優しく洗浄からすすぎ胚は滅菌 E3 と茶漉しと転送ピペットをオフします。

2. Dechorionate 胚

1. 転送ピペットと削除し、シャーレからできるだけ多くの E3 を破棄、胚に dechorionation プロテアーゼ (10 mg/mL) 500 μ L を追加します。5 分は軽く絨毛を完全に削除するシャーレの側の室温で孵化させなさい。
2. 血清ピペット滅菌 E3 プロテアーゼを希釈するの 20 mL を追加します。胚を解決することを許可し、転送ピペットで E3 を削除します。このステップを 3 回繰り返します dechorionation プロテアーゼの痕跡をすべて削除します。

3. 胚サンプルの準備

1. P1000 ピペットを使用して、単一の滅菌 1.5 mL 遠心チューブに 10 胚を配置します。
2. ピペットで E3 を削除し、破棄します。
   注意: ピペット ケアでの胚は容易に転置され、次の洗浄手順中に破棄されます。

4. 解離過程の胚の準備

1. 層流フードのサンプルを転送し、1 mL を追加することによって胚を洗って滅菌 E3。P1000 ピペットで上澄みを外し、管の底に沈殿する胚を許可します。3 洗浄の合計に対して繰り返します。
2. 最後の洗浄後、E3 を削除し、破棄します。粘液コーティング (胞子、酵母やそれに閉じ込められる可能性があります細菌) 周囲の萌芽期のゼブラフィッシュを削除する E3 で 10 mM ジチオトレイトール (DTT) の 1 つの mL を追加します。微量遠心チューブを水平に置くし、層流フードの 25 分間室温でインキュベートします。

5. 胚解離

1. サンプル (Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) を持つ滅菌 DPBS 1 mL で 3 回洗います。最後の洗浄後 (Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) の DPBS の 500 μ L と 5 mg/mL (26 U/mL) 解離プロテアーゼの 5 μ L を追加します。
   注意: この酵素は、Ca^{2 +}と Mg^{2 +}を必要があります、ので、DPBS にこれらのイオンが含まれていることを確認します。
2. 層流フードで 60 分位サンプルの 180 rpm 水平軌道シェーカーで 37 ° C でサンプルをインキュベートし、サンプルは完全に分離されるまで、P1000 を持つ胚をカップ刻んだ。
   注意: は、彼らが解離になるときを判断する定期的に胚を確認します。胚ソリューションの組織の存在のいくつかの量が必要それは、完全に均質なしないでください。過剰のダイジェスト (補足図 1を参照) の HSPCs を破壊します。

6. 解離胚の準備

1. 5 mL ポリスチレンの上部の貯水池にピペット、10 解離胚はラウンド 35 μ m の細胞のストレーナー キャップと底部チューブです。
2. ピペット、リンス (いいえ Ca^{2 +}や Mg^{2 +}) を持つ滅菌 PBS と転写液 5 mL ポリスチレン管を含むペトリネット チューブ フィルター ステップ 6.1 からの細胞。液 4 mL、5 mL のポリスチレン管に存在までを繰り返します。
   注: PBS、DPBS、または他の等張バッファー ソリューション可能性があります使用するこの段階で彼らは、Ca^{2 +}や Mg^{2 +}を含まない限り、
3. 4 ° C および均質化細胞サンプルをペレットに 5 分間、300 x g でチューブを遠心します。ピペット、削除、丸底チューブから上澄みを廃棄します。チューブの下部に小球形細胞を妨害しないように注意してください。100 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。

7. セルロースの調製

1. 完全なセルロース (表 1) 原液 x 1 を生成し、16 G 針、3 mL シリンジと滅菌丸底 14 mL チューブに 2.5 mL を追加します。テスト条件ごとに 1 つの管を使用します。
2. サイトカイン、小さい分子、または各サンプルを調査する他のエージェントを追加します。
   1. 骨髄性分化 1% 鯉血清および 0.3 mg/mL 組換えゼブラフィッシュ顆粒球コロニー刺激因子 (Gcsf)³⁴メチル セルロース培地を追加します。スヴォボダらを参照してください。³⁷鯉血清および組換えサイトカインを生成する方法について完全な説明のため。
   2. 赤血球分化・ メチル セルロース培地に 1% 鯉血清と 0.1 mg/mL 組換えゼブラフィッシュ エリスロポエチン (Epo)³⁸を追加します。
   3. 血液前駆細胞を調べると、Epo と Gcsf を追加します。
      注意: サイトカイン ・添加物ないの合計の総容積の 10% 以上媒体は個々 のコロニーを識別する十分な粘性できません。

8. 解離胚セルロース添加

1. ピペットを使用して、遺伝子組換えサイトカインと鯉の血清と準備されたセルロースの表面に解離 10 胚の 100 μ L を追加します。キャップのふたとサンプルを完全に均質に優しく渦です。各チューブは今 10 胚解離の組織を含める必要があります。
2. 3 mL 注射器や 16 G 針、2 別の 35 ミリメートルのシャーレにサンプルの分注 1 mL を使用しています。サンプルはペトリ皿に完全に分散していることを確認します。サンプルごとに繰り返します。
3. 15 cm シャーレにセルロースの細胞と 35 mm ペトリ皿を配置します。それぞれの 15 cm の皿に 5 mL のサンプルを湿らせるために滅菌水 1 つの 35 mm ペトリ プレートを追加します。32 ° C および 5% CO₂で 7-10 日間インキュベートします。

9. HSPC 由来コロニー形成単位 (CFUs) の可視化

1. 7 日間をインキュベート後 40 〜 100 倍の可視化と列挙に倒立顕微鏡にサンプルを配置します。この時点で、個々 のコロニーをピペットで分離され、染色や遺伝子解析を受けることができます。

結果

HSPC ゼブラフィッシュ胚の数を評価するために 48 の hpf 胚消化、造血支持の外因性の成長因子とセルロースでメッキされ (図 1A) の 7 日間の培養します。7 日後、コロニー形成単位 (CFUs) が列挙 (図 1B) とイメージ (図 1C)。追加別のサイトカインを制御することによって生産の植民地の種類を制御できます: Epo は赤血球分化に必要な Gcsf は骨髄性の分化に必要な。鯉の血清は、哺乳類の組織培養; 牛胎児血清の使用に似ています一般的な成長因子の情報源です。図 1Epo、Gcsf と鯉血清が追加されました、赤芽球系、顆粒球、および混合の erythromyeloid 植民地の列挙を許可します。これらの植民地は...

ディスカッション

ゼブラフィッシュ モデル システムかつ決定的に原始的な脊椎動物の造血を勉強するための効率的で効果的かつ安価なモデルとなっています。高速で安価なといくつかの技術的な困難の試金の世代は、小分子をテスト、突然変異体の胚を分析、HSPC 生物学の重要な分子経路の解明に利用できます。体外メッキ HSPCs のアダルト ゼブラフィッシュからは突然変異誘発、サイトカイン、造血障害研究する効果的な方法です。このプロトコルは、これらの研究に基づいていますが、ゼブラフィッシュの胚を利用します。ゼブラフィッシュの胚にこれらのアッセイを適用するより迅速なデータ収集、(薬剤スクリーン) の少ない薬の使用より少ない物理的なスペースの使用により、テストの mRNA 発現および/または特定の遺伝経路の morpholino (MO) ノックダウンが可能します。重要なは、初期の脊椎動物の開発でのみ発生する造血の段階の検討もできます。

このアッセイの柔軟性のためそれは簡単に多くの多様なニーズを満たすために変更することができます。このプロトコルの変更の 1 つは発達のタイミングの変調胚利用の年齢を変更...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IscoveのMDM StemCell Technologiesにおける10%ウシ血清アルブミン		9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+	Life Technologies	14080-055
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
DMEM 500 mL	Corning CellGrow	10-017-CV&
nbsp;Ham's F12 500 mL	Corning CellGrow	10-080-CV
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HEPES 100 mL (1 M)	Gibco life technologies	15-630-080
ペニシリン/ストレプトマイシン (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)	Corning Mediatech	30-009-CI
ゲンタマイシン硫酸塩 10 mL (50 mg/mL)	CorningMediatech	30-005-CR
1.5 mL MCF チューブ	FisherBrand	05-408-129
3 mL 23gx1 注射針 ルアーロック付き	BD セーフティグライド	305905
5 mL ポリスチレン丸底チューブ セルストレーナーキャップ付き	Corning Falcon	352235
Methocel MC	Sigma-Aldrich	64630
14 mL ポリスチレン丸底チューブ	コーニングファルコン	352057
10 mmポリスチレンイージーグリップペトリディッシュ	コーニングファルコン	351008
Librease TM	ロシュ シグマ-アルドリッチ	5401119001	解離プロテアーゼ
プロナーゼ	シュシグマアルドリッチ	11459643001	デコレーションプロテアーゼ
15cmペトリディッシュ	コーニングファルコン	351058
AB	ゼブラフィッシュ国際リソースセンター(ZIRC)	ZL1	ゼブラフィッシュ株使用
ジチオールスレイトール(DTT)	Sigma-Aldrich	646563