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方法論記事

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

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DOI:

10.3791/56850

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2018年2月12日

 ,  ,  ,  , 
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

この記事について

サマリー

このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs の量のより良い理解とさまざまな研究や研究室から対応するデータの質的評価をことができます。

要約

RT qPCR は個々 のターゲットの Mirna を評価する最も一般的な方法の 1 つです。Mirna のレベルは一般に参照サンプルを基準にして測定されます。このアプローチは、ターゲット遺伝子の表現のレベルの生理学的変化を調べることに適しています。しかしより良い統計解析を用いた絶対定量遺伝子発現レベルの包括的な評価をお勧めします。絶対定量はまだ共通の使用します。このレポートでは、中古増幅の有無 Rt-qpcr を使用してプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。

EDTA 血漿の固定ボリューム (200 μ L) を意識したカニクイザルの大腿静脈から集められた血から調製した (n = 50)。総 RNA は、市販のシステムを使用して抽出しました。プラズマ miRNAs は miRNA 特定フォワード/リバースの PCR プライマーとプローブを含むプローブ ベースの RT qPCR アッセイによって定量化されました。絶対的な定量化のための標準的な曲線は、市販の合成 RNA オリゴヌクレオチドを使用して生成されました。合成 cel-ミール-238 は、正規化と品質評価のための外部コントロールとして使用されました。35 上記サイクル (Cq) 値の定量化を示した miRNAs は qPCR ステップ前にあらかじめ増幅.

検査 8 Mirna の中では、ミール-122、ミール-133a、ミール 192 ミール 1 とミール-206、ミール 499a の低発現量のため中古増幅に必要なに対しあった中古増幅なし検出。ミール 208a とミール 208b 検出されなかった中古増幅後でさえも。サンプル処理効率は、スパイクの cel ミール 238 の Cq 値で評価しました。この測定法の技術的な変化が 3 倍未満と推定され、定量化 (LLOQ) の下限が 102コピー/μ L、検討の miRNAs のほとんどのため。

このプロトコル プラズマ miRNAs の量のよりよい見積もりを提供でき、さまざまな研究から対応するデータの品質評価。体液、中古増幅 miRNAs の低い数字は悪いの検出を向上に役立ちます考慮した Mirna を表明しました。

概要

研究の増加する数の診断と癌の予後のバイオ マーカーとしてマイクロ Rna (Mirna) を探索または監視と非臨床および臨床的研究1,2,3 で他の疾患を検出.定量的リアルタイム逆転写 PCR (RT qPCR) は個々 のターゲットの Mirna を評価するため、この手法はより敏感なマイクロ アレイ4と RNA シーケンス ベースのプラットフォーム5よりも、最も一般的な方法の 1 つであります。一般に、miRNA の表現は、ΔCq 方法6を使用して参照サンプルを基準にして測定されます。このアプローチは、ターゲット遺伝子発現レベルでの生理的変化を調査に適しています。ただし、循環する Mirna の相対的な定量化は、少量のためユーティリティを制限されています。また、技術の変化、異なる所カスタマイズ RT qPCR 実験プロトコル、異なる矛盾につながるかも矛盾に起因するため、さまざまな研究からの結果を比較することは困難異なった調査7。

上記懸念の観点から絶対定量が体液の miRNAs の少量の評価に適してあります。絶対定量法は、対応するターゲット miRNA8と同じシーケンス合成の RNA オリゴヌクレオチドの既知濃度から生成される標準曲線を使用します。保健環境科学研究所 (HESI) ゲノミクス研究会は最近複数のテスト サイトのプラズマ Mirna 絶対測定結果を比較するための包括的な研究を実施しました。結果はことの Mirna 絶対 quantitation のための標準プロトコルを使用して複数のテスト サイト9間で同等の結果をもたらした。本研究では説明されている RT qPCR 測定法は HESI の標準のプロトコルは、複数の miRNA ターゲット、および低式 miRNAs の検出を支援するために中古の増幅の多重分析が含まれていますとほぼ同じです。

本研究では一定量 (200 μ L) EDTA 血漿、血液から調製したが意識したカニクイザルの大腿静脈から収集 (n = 50) 使用10だった。次のプロトコルでは、抽出、miRNA と Rt-qpcr、中古増幅を含む血漿検体の準備のための手順について説明します。もっと重要なは、よく修飾プロセスと組み合わせてターゲット miRNAs サンプルの数量を検証できるように、プロトコルに関する追加の技術情報が、含まれていた。まず、各 miRNA の標準曲線は、生体試料中の定量前にその個々 の検出範囲で検証されました。第二に、現在の方法論の質は、外部コントロール (cel-ミール-238) の Cq 値による総合的に行った。したがって、このプラットフォームでは、さまざまな研究や研究室からの結果を比較するためより有益で信頼性の高いデータが得られます。

8 miRNAs のプロファイルは、代表的な結果としてこのレポートに含まれているここで説明した測定法から。潜在的な安全性バイオ マーカーは、心 (ミール-1、ミール 208a、ミール-208b およびミール 499a) と、齧歯動物および人間3筋 (ミール 133a とミール 206) (ミール 122 とミール 192)、肝臓組織の損傷に関連付けられているこれらの Mirna が提案されています。 11,12,13。

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プロトコル

すべての実験は動物介護制度と株式会社第一三共使用委員会によって承認されました。

1. サンプル準備

  1. EDTA の 2 K を含むチューブにカニクイザルの大腿静脈から血 (少なくとも 0.5 mL) を収集します。
    注: クエン酸とヘパリンです・・・・これらの凝固を抑制するその後 PCR14,15
  2. 氷とコレクションの 2 時間以内に血漿分離のプロセスに収集されたサンプルをすぐに配置します。
  3. 4 ° C、5 分で 10,000 x g でサンプルを遠心します。
  4. 残留血小板細胞の残骸を削除する 5 分の 4 ° C で 16,000 × g で遠心分離後、2 mL のマイクロ チューブに上清を移します。
    注: miRNAs の定量化は、血小板汚染16大きく影響することができます。
  5. 新鮮な 2 mL のマイクロ チューブの上清 200 μ L 因数を置き、使用するまで-80 ° C で保存します。
    注: 各サンプルの固定量は RNA 抽出用します。したがって、因数のボリュームは正確でなければなりません。

2. RNA の抽出

  1. (手順 1.5) から氷の上凍結試料を解凍します。
    1. RNA 抽出時に氷の冷たいサンプルをしてください。溶解試薬を冷やすし、使用する前に氷のクロロホルムします。
  2. 溶解試薬、サンプル (200 μ L) のフェノールとグアニジン イソチオシアネートの単相性溶液の 5 冊 (1000 μ L) を加え、1分間ボルテックスによって精力的に混ぜます。
  3. 5 nM の合成の 5 μ L を追加線虫miRNA (Syn-cel-ミール-238-3 p)。
  4. クロロホルム、1 ボリューム (200 μ L) を追加し、1 分間ボルテックスによって精力的に混ぜます。
  5. 2 〜 3 分の氷の上を維持し、4 ° C 15 分で 12,000 × g でサンプルを遠心分離します。
  6. 新しいチューブに水相を慎重に転送します。
    注: 任意の有機相 (赤) または中間期 (白) は転送されません。収集水様段階のボリュームは、高められた技術的な変化の結果の矛盾を処理するため均一なはずです。このプロトコルで転送水相の通常の量は 650 μ L です。
  7. エタノールの 1.5 ボリューム (975 μ L) を追加し、上下にピペッティングでよく混ぜます。
  8. 対応する列とアダプター、真空乾燥真空マニホールドを使用して 3 分後にサンプルを転送します。試料の量が以上 700 μ L の場合は、残りの溶液を処理するこの手順を繰り返します。
    注: 列に基づく RNA の隔離は真空遠心分離法と互換性があります。
  9. エタノールの 200 μ L を 1 分の真空乾燥が続く列に追加します。
  10. RWT バッファーの 800 μ L を 2 分の真空乾燥が続く列に追加します。
  11. RPE バッファーの 800 μ L を 2 分の真空乾燥が続く列に追加します。
  12. 2.11 手順を繰り返します。
  13. エタノールの 300 μ L を 1 分の真空乾燥が続く列に追加します。
  14. 新しいチューブに列を置き、室温 (15 ~ 25 ° C) 1 分で 12,000 × g で遠心分離します。
  15. 列を新しいチューブに転送し、ヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L を追加します。
  16. 3 分、室温 (15 ~ 25 ° C) で 8,000 × g で 1 分間遠心するため部屋の温度 (15 ~ 25 ° C) に立ちます。
  17. 再溶出液を列に適用します。
  18. 2.16、手順を繰り返し、使用するまで-80 ° c の溶出液を格納します。

3. cDNA 合成

  1. (ステップ 2.18) から凍結試料を解凍します。
  2. Mirna ターゲットに対応する総合的な RNA オリゴヌクレオチドの既知濃度を準備します。
    1. QPCR で標準的な曲線を生成する RNA の合成オリゴヌクレオチドを使用します。1 x 108コピー/μ L 濃度のストック溶液を調製して、ストレージ目的のため。
    2. 原液を 10 倍希釈標準曲線の最高濃度として 1 x 107コピー/μ L (ない中古増幅サンプル) または 1 × 105コピー/μ L (中古増幅サンプル) 実用的なソリューションを取得します。一般に、標準曲線の濃度の推奨範囲は 1 x 107 1 x 102コピー/μ L (ない中古増幅サンプル) 1 × 105 1 × 100コピー/μ L (中古増幅サンプル)。
  3. ターゲットの miRNAs の 20 x RT プライマーの平等なボリュームを混合することによって、多重 RT プライマー プールを準備します。
    注:図 2のように、最大 4 ターゲット Mirna を含むプールはプールの miRNAs のそれぞれの 20 x RT プライマーを混合することによって行うことが。Cel-ミール-238 (外部コントロール) は、各チューブのターゲット miRNAs の 1 つとして含める必要があります。少ない 4 ターゲット miRNAs の場合 20 x RT プライマーの代わりに 1/10 TE バッファーの平等なボリュームを追加します。
  4. RT 反応混合物の準備: RT プライマー (ステップ 3.3) からプールの dTTP の 100 mM dNTPs の 0.15 μ、1 μ L の逆転写酵素 (50 U/μ L)、RT バッファー x 1.5 μ 10、RNase 阻害剤 (20 U/μ L)、0.19 μ 3 μ と 4.16 μ L のヌクレアーゼ フリー水します。
  5. RT の反作用のミックス 10 μ L ピペットで 5 μ L の RNA のサンプル (ステップ 3.1) からまたはオリゴヌクレオチド (ステップ 3.2) から混ぜてし、氷上で 5 分間インキュベートします。
  6. サーマルサイクラー装置で逆のトランスクリプションを実行: 16 ° C、30 分、30 分、42 ° C の続きが 85 ° C で 5 分間で最終的な逆転写酵素不活性化ステップの-80 ° c ストア逆転写サンプルに使用されるまで。

4. プリアンプ (オプション)

注: Cq 以降 qPCR で 35 以上上記値を示す miRNAs はあらかじめ増幅です。

  1. (ステップ 3.6) から凍結試料を解凍します。
  2. 総合的な RNA オリゴヌクレオチド; から RT 製品の 10 倍のシリアル希薄を作る1 x 105 1 × 100コピー/μ L 標準曲線を生成するため。
  3. 200-fold 希釈されて各アッセイ プライマーの最終的な集中とターゲットの miRNAs のアッセイ プライマー x 20 の等しいボリューム (5 μ L) を混合することによって多重アッセイ プライマー プールを準備 1,000 μ L の最終巻で TE バッファーによって。
    注: がターゲットの miRNAs は後続の qPCR 中古増幅と cel-ミール-238 (外部制御) のためのそれらなしで検出することができます分析プライマーはプライマー プールには含まれません。
  4. 中古増幅反応混合物の準備: 2 に使える preamplification 試薬、アッセイ プライマー プール (手順 4.3) からの 3.75 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 6.25 μ L × 12.5 μ L。
  5. 中古増幅反応のミックス 22.5 μ L ピペット (手順 4.1) から逆転写サンプルまたはオリゴヌクレオチド (ステップ 4.2) からの 2.5 μ L でミックスし、氷上で 5 分間加温します。
  6. サーマルサイクラー装置で反応を実行: 95 ° C、10 分;15 s と 60 ° C で 4 分間使用するまで-80 ° C で増幅された事前サンプルを店のため 95 ° c 12 サイクルが続きます。

5. 量的なリアルタイム PCR (qPCR)

  1. (ステップ 3.6 またはステップ 4.6) から凍結試料を解凍します。
  2. サンプルを 5 倍希釈滅菌水で。
  3. 総合的な RNA オリゴヌクレオチド; から派生した RT 製品の 10 倍のシリアル希薄を準備します。1 x 107 1 x 102コピー/μ L (中古増幅サンプルない) または 1 × 105 1 × 100コピー/μ L (中古増幅サンプル) 標準的な曲線を生成するために。
  4. QPCR 反応混合物の準備: すぐ使える増幅検出試薬、試金の試薬、前進/後進 PCR プライマーおよびプローブ ターゲット miRNA に対応するを含む x 20 の 1 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 7 μ L × 2 の 10 μ L。
  5. QPCR 反応混合物から高速光 96 ウェル反応板に 18 μ L を転送し、井戸に (ステップ 5.2 または 5.3 ステップ) から希釈サンプルの 2 μ L を追加します。
    注: サンプルと qPCR の基準の重複設定されます。
  6. 接着フィルム、プレートを密封し、遠心分離機の簡潔に。
  7. リアルタイムのサーマルサイクラーで反応を実行: 95 ° C、20 s、95 ° c 45 サイクルが続く 1 s の 60 ° C、20 s。

6. データの分析

  1. 対応するリアルタイム サーマルサイクラーと連動するデータ解析ソフトウェアを使用して各サンプルのプレーン テキストのコピー数を計算します。
    注: しきい値を表す線は、その Cq 値との比較による再現性を確認するため、研究では, すべてのプレートに「1.0」に手動で設定。カットオフ レベル Cq に設定 > 40 サイクル。
  2. 重複するコンテンツの各サンプルのプレーン テキストのコピー数の平均値を計算します。
  3. Cel-ミール-238 対応する管のすべてのサンプルからのコピー数の平均 cel-ミール-238 各サンプルでのコピー数で割って補正係数を計算します。
    注:図 2のように、各チューブを cel-ミール-238 (外部コントロール) を含む 4 ターゲット miRNAs まで含まれています。したがって、cel-ミール-238 の対応する値を使用して各チューブの補正係数が計算されます。
  4. 各サンプルの (ステップ 6.3) から補正係数を (ステップ 6.2) から各サンプルの平均生コピー数を割ることによって調整されたコピー数を計算します。
  5. (ステップ 6.4) から各サンプルの調整済み raw コピー数を乗じてによって絶対コピー数を計算、各サンプルの希釈倍率。
    注: 希釈倍率はステップ 5.2 から派生したこのプロトコルでは「5」です。
  6. ログ cDNA 濃度に対する各シリアル希釈の Cq 値のプロットの斜面からの PCR 増幅の効率を計算します。
    注: 効率の計算式E = (10(-1 斜面/) -1) x 100%。
  7. Cel-ミール-238 式 E を使用してすべてのサンプルからの Cq 値を使用して技術的な変化の計算 = (2 x 増幅効果)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq))。
    注: 手順 6.5 と 6.7、プロシージャの品質評価に使用されます。

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結果

RT qPCR による miRNA アッセイのワークフロー、品質 assessment
図 1は、qPCR10を使用して血液サンプルからミルナ アッセイのワークフローを示しています。実験の品質は、cel-ミール-238 として外部からの制御を含む、検証できます。これは RNA の抽出の技術の変化を明らかにし、その後 RT qPCR 処理します。本研究では、50 サンプルから計算された Cq 値の平均 ± SD は 21.0 ± 0.4 (表 1) をだった。Cel ミール 238 中古増幅ステップのため希釈し、Cq の価値は 24.2 ± 0.4 (表 1) をだった。ここで説明する測定法、技術的な変化の範囲 Cq 価値観の違いに基づく 3 倍未満であると推定されました。変化の程度は、中古増幅する追加の手順が含まれているべき持っていた場合でも...

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ディスカッション

私たちの包括的な評価には、個々 のサンプルのばらつきの大きさだったテスト miRNAs の間で非常に異なることを明示するダイナミック レンジの範囲のより厳密な統計的分析が用意されています。これらのバリエーションは、その少量の体液中に起因するかもしれないが、ことこれらのデータ反映生物学的変化だけでなく、技術的な変化に留意。技術的な変化のほとんどは、他の分析プラットフォーム18で使用されている外部コントロール (cel-ミール-238) の Cq 値による評価できます。以来、miRNA 解析に標準化された内部統制をされているはありません、技術的な変化については試金19の品質を決定するための分析に含める必要があります。技術的な変化が 3 倍未満と推定されたこのレポートで説明した方法で。他の研究に匹敵する技術情報の不足のためこの手順の品質レベルを決定することはないが、このような情報を含む、信頼性の向上に貢献しての間の互換性を保証さまざまな研究。

最近の論文数は、検体の取扱い、保管条件、処理する前...

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開示事項

著者には、利益相反を開示するはありません。

謝辞

本研究は、公共、商業、または非営利セクターの資金調達機関から任意の特定の助成金を受信しませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BDマイクロテーナーチューブ(K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974採血用
エッペンドルフPCRチューブ、0.2 mLエッペンドルフ0030124359
Eppendorf Safe-Lockマイクロ試験管  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lockマイクロ試験管  2.0 mLEppendorf0030120094
合成オリゴヌクレオチドHokkaido SystemScience-IndividualmiRNA (0.2 μmol,HPLCグレード)
Tris-EDTAバッファー (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
RPEQIAGEN-miRNeasymini kitの含有量 
Buffer RWTQIAGEN-miRNeasymini kitの含有量 
miRNeasy ミニキットQIAGEN217004
ヌクレアーゼフリーウォーター QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-miRNeasymini kitの含有量 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC アダプタータイゲン バイオサイエンスS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well
Block GeneAmp PCR System 9700サーモフィッシャーサイエンティフィック社9700
マイクロアンペア 高速光学式 96 ウェル反応プレートThermo Fisher Scientific Inc.
マイクロアンペア光学接着フィルムサーモフィッシャーサイエンティフィック(株)
TaqMan Fast Advanced Master Mixサーモフィッシャーサイエンティフィック社
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-122-5p)サーモフィッシャーサイエンティフィック インク4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-133a-3p)サーモフィッシャーサイエンティフィック4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-192-5p)サーモフィッシャーサイエンティフィック インク4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-206)サーモフィッシャーサイエンティフィック インク4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-208a-3p)サーモフィッシャーサイエンティフィック インク4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-208b-3p)サーモフィッシャーサイエンティフィック社4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (has-miR-499a-5p)サーモフィッシャーサイエンティフィック インク4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
転写キット		Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp Master Mix (2回;)サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)
クロロホルム 和光純薬035-02616
エタノール (99.5)和光純薬品057-00456
434690743119714444557 インク43665974391128品

参考文献

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