方法論記事

西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

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DOI：

10.3791/56855

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2018年8月22日

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

この記事について

サマリー

しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル バッファー内セルを直接溶解に注意してください。

要約

造血幹細胞 (造血) 希少な細胞は、長い間 25,000 〜 表現型を含むマウス骨髄再 HSCs を長期的です。西部のしみが付くプロトコルの最適化され、造血 (500-15,000 細胞) の小さな数字の解析に適した。表現型の HSCs 精製、正確にカウント、塩化物イオンとサンプル バッファーに直接分離します。同じ数の細胞の溶解液はナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析されたとしみが準備され、次の標準的な西部のしみが付くプロトコルを処理します。このプロトコルは、2,000-5,000 を使用して HSCs を定期的に分析して 500 セル、ほとんどの出版物で報告される 20,000 に 40,000 セルと比較して少ないからいくつかのケースでデータを取得できます。このプロトコルは、その他の造血細胞に一般に適用されるべきし、少数の標準的な検査手順を使用してセルのルーチン分析が可能します。

概要

造血幹細胞 (造血) は、すべての血液系統に上昇を与えることができる自己更新のセルです。比較的希少な細胞の骨髄、生化学的解析を困難にレンダリングしています。アプローチ フローサイトメトリーなどの希少な細胞の解析に適しては、セル表面のマーカー、細胞内タンパク質の相対的な量を定量化するために非常に有用されています。細胞内タンパク質の解析抗体アクセスを有効にするセル透過手順の使用を必要とし、すべてではない細胞表面抗原生き残るこれら手順1,2。さらに、異なるタンパク質アイソ フォームや胸の谷間の製品を区別する抗体が多い、フローサイトメトリー用利用可能なしたがって調査官まだに依存西部のしみ特定のタイプの解析。

セル lysates の西部のしみの分析は、ほとんどの実験室の定期的なプロシージャです。細胞表面抗原のエピトープを保持するネイティブの条件下で細胞を浄化することが、セル lysates の準備および分析できる後。ただし、まれな一次電池しみの西部で人口におけるタンパク質の解析は十分なセルを取得する動物の数が多いを安楽死させる要求できます。いくつかの手順を微調整すること、によって、従来の西部のしみが付くプロトコル HSCs (500-15,000、興味の蛋白質によって) の比較的少数の蛋白質を検出することができた。調整は、セル、セルのセル損失を最小限に抑えるためのチューブ間の移管を軽減、細胞ペレットを慎重に処理を正確にカウントし、バッファー含むプロテアソームの集中載荷時とセルの定義された数を溶解し、ホスファターゼ阻害剤。パブリッシュされたレポートの多くは、20,000 以上 HSCs3,4,5,6,7で得られた西部のしみこの簡単な手順は、セルと 4 と 40 倍の間で相当のデータを生成するために必要な実験動物の数を減らすは。プロトコルは、内部統制ではなく、セルごとに結果を正規化する設計されています。これは、内部のコントロールにデータが正規化された場合に見落とすことができる蛋白質のレベルの全体的な削減の検出を可能。 にします。セルごとに正規化の重要性は、遺伝子発現データ8の分析について説明された、西部のしみによって蛋白質を定量化する同じ原則が適用されます。この最適化されたプロトコルは、細胞の小さな数字を分析する必要がある誰にとっても便利でする必要があります。

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プロトコル

すべてのプロシージャは、制度上の動物の使用およびケアのガイドラインに従って行われなければなりません。プロシージャは、マウス造血幹・前駆細胞 (造血および HPs) の解析用に開発されたが、他のセル人口の分析のため適応することができます。

1. マウス造血および HPs の流れフローサイトメトリー分離

  1. 文学6で説明するように、マウス骨髄細胞を収穫します。
    注:図 1と図 2に示したデータ、骨髄が c57bl/6 j マウスから収穫されました。
  2. 製造元の指示に従って、マウス系統の枯渇キットを使用して骨髄細胞の血統の枯渇を実行します。
  3. 説明7として興味のセル表面のマーカーに対する抗体と細胞を孵化させなさい。図 1および図 2に示すように実験、Sca 1、キット、Flt3、Mac1、Gr1、CD3e、B220、Ter119 系統 (Lin) マーカーに対する抗体を使用します。
  4. 2,000 20,000 林- Sca1 の並べ替え+キット+ Flt3-細胞 (造血) または Lin-Sca1-キット+細胞 (HPs) リン酸の 0.1 mL を含む 1.5 mL エッペン チューブに緩衝生理食塩水 (PBS) 2% 胎児ウシ血清 (FBS)。
    注意: データは、図 1および図 2に示すように、セル ソートされた 70 μ M ノズル流れの Cytometer を使用します。コレクションの最大ボリュームは、1.4 mL です。

2. サンプル準備

注: この手順は重要です。サンプルを非常に慎重に処理します。上清を取り外す場合は、細胞ペレットを邪魔しないように非常に注意します。

  1. 遠心分離機、1.5 mL チューブが 4 ° C でスイング バケツ ローターの並べ替えセルを含む、500 x g、5 分削除以外のすべての約 100 μ L のセルから上澄みのペレット ピペットと 20 μ L ピペット チップを使用して非常に穏やか。ペレットが不可でした。
    1. サンプルは、5,000 未満のセルを含む、並べ替えられたサンプルの合計量は 0.2 mL 未満、最初低結合 0.2 mL PCR チューブ遠心分離前にセルを転送します。
    2. サンプルには、5,000 未満のセルが含まれています、量は 0.2 mL 以上、4 ° C、500 × g で 5 分間遠心分離機でセルをスピンダウンします、上清 200 μ L がすべて削除します。再培養上清の残りの 200 μ L の小球形にされたセルを中断し、0.2 mL PCR チューブにセルを転送、再びスピンダウンします。2 番目のスピンの後ペレットからすべてが 20-30 μ L を削除し、再度セルを中断します。
  2. チューブに上清左の細胞を再懸濁します。必要であれば 2% 追加 PBS を追加 FBS/PBS (2% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用することもできます/PBS、または単独で PBS)、濃度が 5 x10 5 x 105セル/mL に4 。
    注: セルをカウントの使用セルを中断するために使用量を推定するためのフローサイトメトリーによって収集されます。
  3. 再浮遊細胞の 2-5 μ L を使用すると、(製造元の指示に従って) 自動化された細胞カウンターまたは検定9を使用して正確な細胞濃度を決定します。
  4. 必要な新しい 1.5 mL チューブに細胞数を含む再浮遊細胞の量を転送します。図 1に実験のため、1,000、2,000、または 500 の HSCs または HPs に移した。必要な細胞数は西部のしみ、によって得られる信号強度に依存し、は、経験的に決定します。20 μ L または 100 μ L エッペン ピペット チップを使用して転送を実行します。
  5. スイング バケツ ローター 4 ° C、500 × g で 5 分で細胞を遠心します。
  6. 原液 x 100 を生成するための製造元の指示に従って DMSO にプロテアソームとホスファターゼ阻害剤を溶解します。
  7. 2 x Laemmli サンプル バッファーを準備するには、蒸留水の相当量を製造元から提供された 4 x Laemmli サンプル バッファーを希釈します。阻害剤 x 2 2 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を取得するホスファターゼとプロテアソーム阻害剤の 100 x の在庫の適切な量を追加します。
    注: 2 x Laemmli サンプル バッファー、事前に行うことが、プロテアソームとホスファターゼ阻害剤は、次の手順で説明するように、2 x Laemmli サンプル バッファー (プラス阻害剤) 細胞ペレットに細胞を溶解するを追加する前にすぐに追加必要があります。
  8. 慎重に細胞ペレットおよび細胞ペレットをチューブに残って上清に上澄みの部分を削除、2 の x Laemmli サンプル バッファー プラス 500 の最終的な集中を達成するためにプロテアソームとホスファターゼ阻害剤の等量を追加細胞/μ l 1 x Laemmli サンプル バッファー内。
    注: たとえば、ステップ 2.5 でチューブ、ペレットから上澄みの 18 μ L を削除する必要があります (ステップ 2.6) 細胞を遠心分離後、残りは上澄みの 2 μ L に 20 μ L の総ボリュームで 2,000 のセルを転送する場合は追加の等しいボリューム (2 μ L) 2 x 500 細胞/μ L 1 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を達成するために塩化物イオン サンプル バッファー。
  9. できるだけ早く、ライセートを生成するペレットを再懸濁します。この時点で、サンプルは SDS ページのゲルを通ってすぐに electrophoresed することができます。 またはスナップがリキッド N2でフリーズし、将来使用するため-80 ° C で保存することがことができます。

3. 電気泳動

  1. 95 ° C で熱ブロック内、または 5 分間水を沸騰の溶解液を加熱します。
  2. 標準プロトコル10を使用して 100 v で SDS ページのゲルを通って (20,000 セル同等まで 500 から含む) 溶解液の 1 40 μ L を electrophorese します。
    メモ: ライセートのゲルにロードのボリュームは、望ましい信号の生成に必要なセルの数によって決まります、利子および抗体の品質の蛋白質の豊富さによって異なります。図 1のデータは、2,000、1,000、500 セル相当ライセートと得られました。井戸の幅切られるべき 3 mm に 1.5 mm. 歯をすることができます 1.5 mm の範囲で市販の櫛から広い歯のはさみを使用しています。

4. 転送し、ブロック

注: は、次の標準的なプロトコル11西部のしみを実行します。手順は簡単にここで記載されています。

  1. 10 s、それから簡単に膜の洗浄に蒸留水、メタノールとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜を前処理します。
  2. 転送装置の製造元から提供されるマニュアルの指示に従って膜に SDS ページのゲルからタンパク質を転送します。
  3. 2 ml の 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBST の膜をブロック転送を以下 (0.1% と PBS トゥイーン) 4 ° C 以下の標準プロトコル11で一晩。

5. 抗体の分類

  1. ベンダーによって推奨の抗体希釈を使用して 4 ° C で一晩シェーカーで抗体を膜を孵化させなさい。
    注: 材料表 HSCs と HPs と対応する抗体の希薄を検証しましたが、抗体が表示されます。標準的な手順8を使用して抗体の分類を実行します。

6. 検出

  1. 3 回、室温で PBST で各洗浄のため 5 分、膜を洗浄します。
  2. 2 mL の部屋の温度で 1 分の化学発光のバッファーを持つ膜を孵化させなさい。次の製造元の指示、またはオートラジオグラフィー フィルムとフィルムのプロセッサ イメージング システムを使用して信号を検出します。

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結果

500-2,000 精製造血および HPs の代表的な結果は、図 1と図 2のとおりです。500 HSCs から図1 β-アクチン信号を検出できるし、HPs が 1 つのマウスの骨髄から精製しました。Lysates を読み込んで 1.5 mm 井戸生産 3.0 mm 井戸への読み込みよりも 500 HPs から非常に強い信号であることに注意してください。図 2は EIF4G の西部のしみ、Rps6 のリン酸化 (p Rps6)、どちらのタンパク質翻訳12の星細胞の調節に関与しているし、HPs と幹細胞による刺激なしで体外(SCF) 要因。

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ディスカッション

西部にしみが付くことは、組織や細胞の特定の蛋白質とシグナル伝達経路の活性化を検出するための一般的な手法です。一般的に使用されるプロシージャを微調整を導入し、15,000 HSCs と 500 HSCs として、いくつかのいくつかのケースで日常的に 15 の異なった蛋白質 (資材表) を検出することができました。The most このプロトコルの重要なステップは、: 1) 正確にセルをカウント、2) 転送管の数を最小限に抑え、3) 塩化物イオン サンプル バッファーに直接細胞を溶解します。細胞ペレットから上澄みのすべてを削除して再代わりにチューブに上清の小さいボリュームを左し、同等のものを追加、塩化物イオンとサンプル バッファー内に中断はなく、わかったときに塩化物イオン サンプル バッファーを持つ細胞ペレットを溶解、塩化物イオン サンプル バッファー x 2 のボリュームは、我々 は、セル損失を回避できました。スイング バケツ ローターで細胞を遠心分離と、セル損失のリスクも減少しました。検出の感度を改善櫛歯をトリミングすることによって井戸の幅を減らします。

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開示事項

著者は宣言する利害の衝突があります。

謝辞

健康の国民の協会付与 R01 CA149976 (N.A.S) はこの仕事を支えた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Fisher ScientificBP166-500SDS-PAGE
TEMEDFisher ScientificBP150-20SDS-PAGE
30% アクリルアミドル Bis 溶液Bio-Rad1610158SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8TEKNOVAT1588SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8TEKNOVAT1068SDS-PAGE
過硫酸アンモニウムフィッシャーサイエンティフィックBP179-25SDS-PAGE
ミニプロティアン 3 コームバイオ・ラッド1653360SDS-PAGE
ミニプロティアン テトラセルバイオ・ラッド1658005EDUSDS-PAGE
トランスファー システムバイオ・ラッド1704155EDUトランスファー
PowerPac HC 電源バイオ・ラッド1645052EDU電気泳動
イメージングシステムBio-Rad1708195シグナル検出
4x Laemmli サンプルバッファーBio-Rad1610747EDUサンプル調製
10x Tris/Glycine/SDS 電気泳動バッファーBio-Rad1610732EDU電気泳動
2-メルカプトエタノールBio-Rad1610710EDUサンプル調製
RTA Mini PVDF Transfer Kit、40 個用ブロットバイオ・ラッド1704272転写
プロテアーゼ阻害剤 カクテルシグマ11697498001サンプル調製
ホスファターゼ阻害剤 カクテルゴールド バイオテクノロジーGB-450-1サンプル調製
EIF4G細胞シグナル伝達2469WB 抗体、1000 細胞で検証済み
抗体濃度: 1:1000
参照(図): 図2
p-Rps6Cell signaling4858WB 抗体、1000 cells
抗体濃度:1:1000
参照(図):Fig2
actin(HRP conjugated)abcamab49900WB 抗体、500 cells
で検証 抗体濃度:1:5000
参照(図):Fig1、Fig2
LC-3Abcamab48394WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5(図5)
S6Cell Signaling2317WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5 (Fig4)
4EBP1Cell Signaling9644WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度: 1:1000
参考文献(図): ref5 (Fig4)
p-4EBP1Cell Signaling2855WB 抗体,15000 cells
で検証済み 抗体濃度: 1:1000
参考文献(図): ref5 (Fig4)
TSC2Cell Signaling4308WB 抗体,15000 cells
抗体濃度: 1:1000
参考文献(図): ref5 (Fig4)
HSP90Cell Signaling4877WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5(図5)
PTENCell Signaling9188WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5(図S1)
mTORCell Signaling2983WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5(図S1)
p-mTOR細胞シグナル伝達5536WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参照(図):ref5(図S1)
PP2ABCell Signaling4953WB抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度: 1:1000
参考文献(図):ref5 (FigS1)
p-AMPKaCell Signaling2535WB 抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:1000
参考文献(図):ref5 (FigS1)
actinSanta Cruzsc-47778WB 抗体、15000細胞で検証済み
抗体濃度:1:3000
参考文献(図):ref5 (Fig4)
系統枯渇キット(マウス)Miltenyi Biotec130-090-858血幹細胞および前駆細胞精製
LSカラムMiltenyi Biotec130-041-305血幹細胞および前駆細胞精製
SCFPeproTech250-03リン酸化刺激
APC-Cy7 c-kit抗体ThermoFisherA15423細胞選別
抗B220ThermoFisher48-0452-82細胞選別
抗CD3eThermoFisher48-0031-82細胞選別
反Mac1ThermoFisher48-0112-82細胞選別
反Gr1ThermoFisher48-5931-82細胞選別
反Ter119ThermoFisher48-5921-82細胞選別
1.0mm一体型スペーサープレートスペーサーバイオ・ラッド1653311SDS-PAGE
BSA研究製品 国際A30075膜ブロッキング
血清アトランタバイオロジカルズA12450培地サプリメント
細胞カウンターInvitrogenAMQAF1000細胞計数
用血球計算盤サーモフィッシャー S17040細胞計数
flimデンビルサイエンティフィックE3012信号検出
医療フィルムプロセッサコニカSRC-101A信号検出
スーパーシグナル ウェストフェムト 最大感度 基板セロムサイエンティフィック34096信号検出
アレグラ X-15R 遠心分離機(ローター SX4750A)ベックマン・コールターX-15Rサンプル準備
BLUEstain タンパク質ラダーゴールドバイオテクノロジーP007-500電気泳動
細胞選別機BDFACSAria IIサンプル調製
IncublockDenville ScientificI0510電気泳動
造造

参考文献

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