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方法論記事

副鼻腔癌と嗅神経芽細胞腫の 2 つの可能な分子マーカーとして OTX1、OTX2 の同定

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DOI：

10.3791/56880

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2019年2月28日

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1Department of Medicine and Surgery, University of Insubria, 2Department of Surgical and Morphological Science, University of Insubria, 3Department of Biotechnology and Life Science, University of Insubria

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ホメオ ボックス遺伝子は遺伝子発現しばしば大人の有機体の腫瘍に関連付けられています。免疫組織化学的および正常および炎症性鼻粘膜や副鼻腔腫瘍診断と治療対象としてそれらを使用するためにリアルタイム PCR 解析による発現の比較を行った。

要約

OTX (HB) ホメオ ボックス遺伝子は胚形態形成期および大人の有機体の嗅上皮の開発中に表されます。これらの遺伝子で発生する突然変異は人間の腫瘍頻繁に関連しています。OTX遺伝子と鼻腔内の腫瘍の可能な相関について現在利用可能なデータはありません。この作業の目的は、 OTX1 、 OTX2を鼻腔内腫瘍の開発の分子マーカーとして考えることがかどうかを理解することです。我々 は、鼻腔と副鼻腔の腺癌の免疫組織化学的およびリアルタイム PCR 解析を通じてOTX1 、 OTX2遺伝子の発現を調査するを選択します。OTX1 、 OTX2欠席した副鼻腔腸型腺癌 (ITACs) のすべてのサンプルで。OTX1 mRNA は、嗅神経芽細胞腫 (アドオン) でのみ発現していたOTX2 mRNA 中非腸型腺癌 (NITACs) でのみ確認されました。副鼻腔腫瘍の種類を区別するために有用な分子マーカーをことがありますOTX1 、 OTX2遺伝子の遺伝子発現を確認しました。

概要

OTXHB 遺伝子ショウジョウバエ orthodenticle 遺伝子 (otd) の脊椎動物ホモログと彼らは転写因子が胚の形態形成時に通常のエンコードしますが、異なる機能を持った大人の有機体で表すこともできます。.萌芽期の開発の間に細胞の識別、細胞分化および体 axis¹ の位置決めの仕様を制御します。OTXファミリには、さまざまな機能を表示するOTX1 、 OTX2遺伝子が含まれています。OTX1は脳および感覚的な器官の開発に関与しています。大人の有機体のそれは感覚器官で表され、下垂2; の前葉の低レベルで転写されます。また、多能性造血前駆細胞3で表現される造血に役割を果たしています。OTX2は吻側のヘッドの開発に関与し、モルフォゲンとして翻訳されたタンパク質行為を他の遺伝子をグラデーションを生成するのでがアクティブ化またはセルに貢献時空間的な抑圧増殖・分化します。大人の有機体では、 OTX2は脈絡叢および pineal 腺4排他的に見られます。

OTX遺伝子の突然変異は先天性、体や代謝の不具合に人間の姿によく関連しています。OTX遺伝子の利得または損失の突然変異は、細胞の成長や分化5を正しく制御することがされていない場合、腫瘍を促進でした。白血病や悪性リンパ腫も多くの固形腫瘍 (あり髄芽腫6など、積極的な非ホジキン リンパ腫2乳房癌7、大腸癌8、および網膜芽細胞腫9) のように、OTX HB 遺伝子の発現はよくとり上げられる10です。また、 OTX2突然変異は、無眼球、microphtalmia11目の開発の制御のこの遺伝子の重要な役割のための例で実証されています。

固形腫瘍の中では、分子および表現型マーカーの発見、診断、分類、および腫瘍の11鼻腔と副鼻腔で発生するものを含むいくつかの種類の治療のための重要な課題副鼻腔。実際には、それにもかかわらずこれらの区域を占めるのみささやかな解剖学的スペース、粘膜上皮、腺、軟部組織、骨、軟骨または神経/神経と hematolymphoid 細胞はしばしば複雑で、組織学的に別の起源のサイトをすることができます。腫瘍のグループ。副鼻腔管を含む腫瘍の種類は、通常上部延びる気道消化管または12体のほとんどの部分も全体に見られるものを克服するための機能の様々 なを紹介します。副鼻腔の悪性腫瘍はまれであり、1: 100,000 人の住民の年間発生率を世界中に存在、ので、腫瘍と代替治療戦略のテストに関与する経路に関する研究できません。これ、画像診断の進歩にもかかわらず、外科的アプローチと放射線治療副鼻腔癌の臨床管理を改善しています。さらに、細胞株、動物モデル、がん遺伝プロファイリングの開発現在将来癌標的治療13の基礎となります。日には、鼻腔、副鼻腔、上咽頭の腫瘍におけるOTX1および/またはOTX2式に関する報告はありません。以来、我々 は以前OTX1 、 OTX2が乳房癌7で関与していることを観察している、我々 はこれらの遺伝子が通常鼻の粘膜だけでなく、鼻腔内の腫瘍だけではなく存在できれば疑問。我々 は、「オスペダーレ ・ ディ ・ Circolo」ヴァレーゼ サンプルで正常粘膜および 2012 年までの 1985 年から収集し、分類される世界保健機構 (WHO) によると鼻腔と副鼻腔の腺癌の病理科から得られるこの目標を達成するには頭と首の腫瘍の分類。リアルタイム PCR および免疫組織化学的解析を通じてそれらを分析することを選択し、彼らがこれらのタイプの腫瘍の分子マーカーを考えることができるかどうかを決定するOTX1 、 OTX2式を評価しました。

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プロトコル

インフォームド コンセントを書かれており、ヴァレーゼの Insubria 大学の倫理委員会の承認とヘルシンキ (1975 年) の宣言によるとすべての研究を行った。

1. サンプルの収集

  1. 収集し、すべての人間の Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) サンプルを14頭と首の腫瘍の WHO の分類によると別のサブグループに分けます。
    注:ここで次のサンプルを使用: コントロール (10 サンプル); として通常副鼻腔粘膜倒立乳頭腫 (ICD-O コード 8121/1 IP)副鼻腔 ITAC (ICD-O コード 8144/3 32 サンプル);NITAC (ICD-O コード 8140/3 12 サンプル);腺様嚢胞癌 (ACC、ICD-O コード 8200/3);多形性腺腫 (ICD-O コード 8941/3 PA)(ICD-O コード 9522/3 13 サンプル);不十分な低分化神経内分泌癌 (PDNEC、ICD-O コード 8041/3 19 サンプル);神経内分泌腫瘍 (NET、ICD-O コード 8041/3)。

2. 免疫

  1. Deparaffinization セクションの退避とステータス復元
    1. 30 分の 60 ° C のオーブンでスライドのサンプルを加熱し、水にアルコール系を使用して 3 μ m 厚 FFPE セクションを水分補給。
    2. 簡単に 10 分のキシレンのスライドを洗浄し、この手順を繰り返します100% アルコールに 5 分用のスライドを洗浄し、連続 95%, 85%, 75% のアルコールを使用してこの手順を繰り返します。蒸留水で 5 分用のスライドをすすいでください。
  2. 内因性のアクティビティをブロック
    1. 12 分間 3% 過酸化水素でスライドを配置することによって、内因性の活動をブロックします。
  3. 抗原検索
    1. 10 mm クエン酸緩衝液 (6) マイクロ波治療で 10 分間処理することによって抗原検索を実行します。
  4. 一次抗体の孵化
    1. TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、ブロッキング溶液中 10 分間を追加します。
    2. TBS バッファー (pH 7.4) のセクションを洗浄し、0.2% トリトン X を追加します。
    3. ヤギ抗ひと OTX2 抗体希釈 1: 100 で 4 ° C で一晩インキュベートします。
  5. 二次抗体の孵化
    1. ビオチン標識ウサギの反やぎ二次抗体希釈 1: 200 ABC ペルオキシダーゼ複合体が続くと部屋の温度で 1 時間セクションを孵化させなさい (教材の一覧表を参照してください)。
  6. 導管を開発
    1. 3, 3'-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride を用いた抗原抗体反応の開発および counterstain ハリス ヘマトキシリンで核。
  7. 取り付けとイメージング
    1. 三日月のアルコール スケールを使用してセクションを脱水してテルペン由来の清算物質を使用してそれらを明らかにする (材料の表を参照してください)。メディアをマウントのセクションを埋め込む、顕微鏡スライドの上セクションに配置およびセクションを光学顕微鏡で観察します。

3. RNA の抽出および逆のトランスクリプション

  1. RNA の抽出
    1. 免疫沈降プロトコル (セクション 2.1 を参照) の最初のステップを実行することによって、セクションから RNA を抽出し、蒸留水でスライドを保ちます。対応するヘマトキシリン-エオシン染色が関心のフラグメントを識別するためにセクションを染色無染色のセクションをオーバー ラップします。
    2. FFPE サンプル (材料の表を参照)、次の製造元の指示の商業 RNA 抽出キットを使用して RNA の抽出を実行します。
  2. RNA 逆転写
    1. レトロは cDNA に、RNA を転写する市販のキットを使用して (材料表参照) プロトコルに従います。いくつかを分析するための総 RNA の少なくとも 1,000 のレトロ-議事録 ng。

4. リアルタイム PCR およびデータ解析

  1. リアルタイム PCR
    1. プローブ ベースの技術と定量的リアルタイム PCR 解析 (qRT PCR) を実行 (材料の表を参照してください)、サーマルサイクラー。
  2. PCR の反作用の組合せの準備
    1. プローブ ベースのマスターの組合せの 12.5 μ L を使用して PCR 反応混合物の準備、ACTB、OTX2、OTX1 各 1.25 μ プローブ (材料の表を参照)、50 ng の cDNA とヌクレアーゼ フリー水総量の最大 25 μ L。
    2. 遺伝子発現のレベルを正規化する内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた 3 通すべての反応を実行します。
    3. 3 分間 1,109 x gでプレートを遠心し、実験まで 4 ° C で光から保護プレートは保管します。
  3. 熱 cycler を設定
    1. 50 ° c 2 分、95 ° C 10 分サイクルの初期のホット スタートでサーマルサイクラー プロファイル設定は続いて 40 サイクル 95 ° C で 15 秒と 1 分の 60 ° C で最終的なサイクル。
  4. 遺伝子発現レベル解析
    1. 内因性制御として ACTB 遺伝子を用いた比較サイクルしきい値 (ΔCt) による遺伝子発現レベルを正規化します。
    2. 2-ΔCt法を用いた遺伝子発現レベルを評価し、結果をプロットします。
  5. 統計解析
    1. 学生のtを使用して統計解析の実行-テスト、 p < 0.05 と統計的に有意な結果を考慮しました。

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結果

正常粘膜 OTX 遺伝子繊毛の偽重層型呼吸上皮と粘膜下腺細胞 (図 1 a) の両方の強く、同種原子力反応が見られました。すべて NITACs のサンプル (図 1 b)、少し中または不在の免疫で OTX1 の核式 ITACs (図 1) で強調表示されたが分かった。強い免疫反応性があったすべてのアドオン (図 1)。PDNECs、間 OTX 式は強度と陽性細胞 (図 1E) の割合で変化。免疫組織化学的統計解析実行 Chi 正方形やフィッシャーの正確確率検定と実証 ITAC サンプル OTX 遺伝子の不在が有意 (n = 23、 p < 0.01)。

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ディスカッション

本研究は、はじめてであり、mRNA レベルに基づいて HB 遺伝子 OTX1 OTX2 通常副鼻腔粘膜と粘膜下腺、炎症性ポリープ、副鼻腔 Schneiderian 乳頭腫と別の表現と神経外胚葉性上皮腫瘍、扁平上皮癌、非腸型副鼻腔腺癌、唾液腺型腫瘍、神経内分泌腫瘍、およびアドオンを含みます。

変更とトラブルシューティング:

RNA の劣化を避けるためには、病理研究室で deparaffinization プロトコルを実行します。我々 はスライド傷後、すべてのサンプルが急速に冷却し、さらに使用までドライアイスに保管されます。無菌実験条件を維持するために、RNA の汚染を避けるために、滅菌のヒントと専用ピペットのセットを使用して層流安全フードの以降のすべての解析を行った。

技術の制限:

技術の主要な制限は、副鼻腔の空洞の腫瘍は、まれなので、サンプルの可用性に依存します。抽出した RNA の量は別の重要な問題、FFPE サンプルからの ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事に支えられセントロ グランディ楽器そして dell'Insubria、財団 Comunitaria ・ デル ・ Varesotto 財団・ デル ・ モンテ ・ ディ ・ ロンバルディアとスタンパーリアラヴェッロ アンナ ヴィラ e フェリーチェ Rusconi。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RecoverAll Total Nucleic Acid IsolationApplied BiosystemAM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystem4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNGApplied Biosystem4326614
ABI Prism 7000 Applied Biosystem270001857
ACTBプローブApplied Biosystem生産終了。著作権
OTX1プローブBiosystem生産終了。著作権OTX2プローブによって保護されている配列
Biosystemは生産終了です。著作権により保護されている配列
Acqueous Hydrogen PeroxideMerk1072090250
Citrate BufferSigma-Aldrich20276292
TritonSigma-Aldrich101473728
TrisMerk108382
NaClMerk106404
Goat Anti-OTX2 AntibodyVector Laboratories生産終了。カタログ番号はありません
ウサギ 抗ヤギ抗体ベクター研究所BA5000
ABC-ペルオキシダーゼ 複合体ベクター研究所PK6100
3,3'-ジアミノベンジジン テトラヒドロクロライド (DAB)シグマ-アルドリッチD5905
ハリス ヘマトキシリンバイオプティカ0506004/L
ペルテックカルテック SRL1560
バイオクリアバイオプティカW01030799
によって保護されている配列Applied Applied

参考文献

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