方法論記事

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

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DOI：

10.3791/56913

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2018年4月3日

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

この記事について

サマリー

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア ウイルス療法が、それが他的に容易に適応することができますウイルスのプラットフォームまたは一般にウイルスの複製を調節する宿主遺伝子を発見するため。

要約

高スループット ゲノムワイド RNAi (RNA 干渉) スクリーニング技術は、ウイルスの複製に影響を及ぼす宿主因子を発見するため広く使用されています。具体的には強化療法の目標と Maraba ウイルス、腫瘍溶解性ラブド ウイルスについて、ワクシニア ウイルスの複製を調節する発見のホスト ターゲットにこの技術のアプリケーションをご紹介します。腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルスで使用するプロトコルをテストされています、このアプローチ他腫瘍溶解性ウイルスに適用されます、哺乳類細胞でのウイルス増殖を調節するホスト ターゲットを識別することができます活用も一般的です。このプロトコルは、開発および哺乳類細胞、重要な考慮事項と準備手順プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングとステップバイ ステップのガイドを行うために重要でハイスループット RNAi スクリーニング アッセイの検証について説明します。プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングの実施さらに、それは広くセカンダリ画面検証・第三紀の検証研究を行う方法をについて説明します。ハイスループット RNAi スクリーニングができる広範かつ公平な方法、感染などの in vitroアッセイを開発 1 つのウイルスの複製のあらゆる側面を調節する宿主因子で、カタログに 1 つの利点はバースト サイズ毒性。それは現在の知識に基づいて生物学的製剤ターゲット不測の事態を明らかにする力があります。

概要

高速全ゲノム RNAi スクリーニングは、ウイルス生物学などの多様な分野で生物学的洞察力を明らかにするための貴重なツールであると証明しました。広くウイルスの複製 (1,2,3,4のレビューを調節する宿主遺伝子を識別するの大規模な RNAi スクリーニングのセルベースの過去 10 年間以上にわたり多数のグループが実施しています。,5,6,7). 癌細胞、ワクシニア ウイルス8,9,10 を含む現在の腫瘍溶解性ウイルス候補であるウイルスといくつかの興味深いことに、これらの画面の数が多いを行った、Maraba ウイルス15水胞性口炎ウイルス13,14, 単純ヘルペス ウイルス12粘液腫ウイルス11。貴重なデータがのこれらのデータ セットから採掘される可能性ウイルスの複製のいくつかの側面に影響を与えるホストの要因を識別するのではなく、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するための生物学的製剤のターゲットを識別するこれらの研究のほとんどの焦点中、この点では。腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために強力な潜在性がない完全に悪用されるは明らかです。

腫瘍溶解性ウイルス プラットフォームの茄多は、後期臨床試験で明白な成功を収めているヘルペス シンプレックス ウイルス、レオウイルス、ワクシニア ウイルスを含む前臨床および臨床研究で現在テストされています。これらのプラットフォームの大半、努力に向かっていたウイルスのゲノムを変える治療を強化します。例えば、腫瘍特異性を増加する特定のウイルス遺伝子削除されたか通常の細胞が腫瘍細胞ではウイルスの複製を大幅に制限する変異します。いくつかのケースでの GM-CSF (顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子) を免疫反応を増強するまたは NIS (ナトリウム ヨウ化シンポート) in vivoイメージングと細胞における放射性の取り込みを有効にするような遺伝子が追加されて治療目的。ただし、ホスト/腫瘍の遺伝子を操作し、探索の腫瘍溶解性ウイルスの複製のホスト/腫瘍遺伝子の影響に焦点を当ててほとんどの仕事がずっとあります。ハイスループットス クリーニング技術の出現により、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する宿主ゲノムを操作する機会を解読する、ゲノム規模でのホスト ウイルスの相互作用を調査することが可能です今 (見直し16, 17,18)。

我々 は報告、最初研究デモの概念実証ハイスループット遺伝の腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する操作することができるホストのターゲットを識別するためにスクリーニングを使用するためです。Maraba ウイルス腫瘍、現在フェーズでテストされている腫瘍溶解性ラブドウイルスーを調節する宿主遺伝子を発見するには、私と第 II 試験を行った全ゲノム RNAi 画面 siRNA (短い干渉 RNA) と重複で 3 つの異なる腫瘍細胞株全体18,120 遺伝子15をターゲット ライブラリ。ヒットの画面で特定の経路分析では、(小胞体) 小胞体ストレス応答経路のメンバーの濃縮を明らかにしました。主な画面のものと異なるターゲット シーケンスに siRNA を用いた二次検証のためこれらの経路内で 10 安打を選びました。第三紀の検証の一環として、ire1 α とレスキュー実験を行い (イノシトール要求酵素 1 アルファ) あたりがターゲットにされたことを確認します。体外と体内ire1 α の小分子阻害薬を使用してテスト結果大幅に強化された腫瘍溶解性効果。

Workenheら12もプール レンチ ウイルス shRNA (短いヘアピン RNA) を使用して全ゲノム RNAi スクリーニングを実施したひと単純ヘルペス ウイルスを制限するホストの要因を識別する 16,056 遺伝子をターゲット ライブラリ タイプの胸の 1 (HSV-1) 変異 KM100 を介した腫瘍癌細胞。プライマリ画面彼らはモック感染細胞; 上 KM100 感染細胞の細胞毒性の強化につながるのノックダウンの 343 遺伝子を同定しました。彼らは二次検証のためのこれらの遺伝子の 24 を選択されています。24 遺伝子のうち 8 遺伝子がそれらの 1 つを持つセカンダリ画面で確認された第三の検証中に遺伝的レスキュー実験を使用して確認された後 (セリン/アルギニンリッチ スプライシング因子 2) SRSF2 をされています。グループは SRSF2 のリン酸化の減少、吐蕃担癌マウスの拡張生存率にこの阻害剤リードと HSV 1 KM100 の組み合わせ治療, DNA トポイソメラーゼ阻害療法を識別するようになった。

前述の調査で似たようなワークフローが続いた。各選択プライマリ画面で特定のヒット数でセカンダリ画面が続く主な全ゲノム RNAi スクリーニングから始まった。これはヒットした対象であることを確認含まれている第三の検証研究が続いた遺伝を実行してターゲット遺伝子プロダクトの vivoの操作によって実行される究極の検証と実験で試験管を救出します。この記事でまずウイルスの量と感染症の最適なトランスフェクション条件の決定は、高スループットの siRNA スクリーニング アッセイの開発性の一般的なプロトコルを提供します。セカンダリ画面検証および第三紀の検証の実行方法の全体的な説明と同様、高スループット siRNA スクリーンもプライマリを実施するための詳細なプロトコルを承っています。

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プロトコル

1 開発とハイスループット siRNA スクリーニングアッセイの検証

注: すべての実験、Hepes バッファー成長媒体のセル行ごとに適切なを使用します。アッセイ条件の最適化から第三紀の検証までのワークフローの概要については、図 1を参照してください。

  1. 最適なトランスフェクション条件の決定
    1. 腫瘍のセルラインをオンまたは理想的には複数の腫瘍細胞のトランスフェクション条件 (例えば786-O、U20S、シマロン 8 U373 SF268 NCI H226; 細胞株の選択の詳細についてを参照してください) を最適化するための行。
    2. トランスフェクション試薬またはいくつかのテストを選択します。有毒または指定したセルの行に他のものより効率的ないくつかすることができるいくつかのトランスフェクション試薬をテストする必要があります。また、一部がウイルス感染に影響を与える可能性がありますまたはイメージングに高いバック グラウンド信号を生成可能性がありますに注意してください。
    3. 正を決定 [e. g. siRNA の細胞死を誘導する PLK 1(Polo Like Kinase 1) mRNA ターゲット] と負のトランスフェクション コントロール (例えば非ターゲット siRNA)。
    4. 特定のトランスフェクション試薬のトランスフェクション プロトコルに従ってが、トランスフェクション試薬 (例えば0.05、0.1、0.15、0.2 μ L/ウェル) と播種量 (例えば625、1250、2500 細胞/ウェル) 細胞の量が異なります。次の条件の複製が含まれます: 細胞を放置、模擬 transfected セル (細胞すなわちプラスのトランスフェクション試薬) と正と負のトランスフェクション コントロール siRNA の細胞 (サンプル プレートを図 2 aを参照してください。レイアウト)。
      1. 一般に、各 siRNA の 80 nM 希薄を 10 の井戸の最終的な集中に備える nM (ライブラリによって siRNA 濃度が高い必要があります)。指定しない限り、siRNA トランスフェクション試薬の希釈剤で希釈します。トランスフェクション試薬の希釈液を準備します。
      2. ピペット 5 希釈トランスフェクション試薬の 5 μ L に続いてウェルあたり siRNA の μ L。この手順を容易にするには、U 下 96年ウェル プレート、siRNA ミックスおよび siRNA の希釈液の (未処理とモック transfected セル) の単独での列に沿って配布します。2 番目の列、希薄化後のトランスフェクション試薬とトランスフェクション試薬の希釈液 (未処理細胞) のためだけに沿って配布します。
        1. 希薄化後のトランスフェクション試薬のトランスフェクション試薬の希釈 5 μ L/ウェルに続いて電子ピペット、ピペット 5 μ L/ウェルの 384 ウェル プレート対応する井戸に siRNA や siRNA の希釈剤を含む最初の列の内容を使用して、2 番目の列。
      3. 1026 × g、室温で 1 分でプレートを遠心し、トランスフェクション試薬のために規定時間孵化させなさい (例えば5 ~ 20 分)。
      4. プレートをインキュベートすると、別の密度の細胞懸濁液を準備します。ピペット 30 μ L/ウェルの細胞懸濁液の。インキュベーターでプレートを配置すること、前に細胞19制服セトリングように室温で 45-60 分間座っている板をしましょう。
        注: siRNA トランスフェクション試薬の規定する潜伏期間が短い場合は、孵化する前に細胞懸濁液を準備します。
      5. 選択画面のノックダウンの所望の長さに応じて 48 に 72 時間インキュベートします。
    5. 固定および汚損ホルムアルデヒド、ヘキスト 33342 と 4% のホルムアルデヒド 5 μ G/ml ヘキスト 33342 の各ウェルに最終濃度の PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で構成されるソリューションを準備します。必要に応じて場合は、信号が弱すぎるか強すぎる、それぞれ高い (例えば7.5 μ G/ml) またはヘキストの低濃度 (例えば2 μ G/ml) をください。
    6. すべての井戸に直接固定と染色ソリューションの 30 μ L を分注します。37 ° C で 30 分の版を孵化させなさい4 ° C でプレートを保存します。非共焦点の顕微鏡を使用している場合は、プレート ワッシャー; を使用して PBS でプレートを洗浄します。ほとんどの場合、共焦点の顕微鏡を使用する場合、洗濯が必要。
    7. ウェルあたりの細胞数を定量化するためのスクリプトを開発します。
      注: いくつかのソフトウェア スイート利用可能なこの目的のためあり、それぞれことがありますスクリプトを生成するさまざまな方法がありますが、彼らすべて一般に強度を計算すると同様、核、細胞および関心の領域を識別するための手段と形態学的プロパティ。スクリーニング スクリプトを開発するとき、プレートごとのスクリプトを実行し、おそらく処理時間を最小限に抑えるためだけに不可欠な測定を追加するために必要な時間を考慮することが重要です。たとえば、細胞数を定量化する 1 つはヘキストよく指定された強度; 上記面積を計算する可能性があります。そしてウイルス広がりを定量化する GFP (緑色蛍光タンパク質) も、指定された強度上記面積を計算することも 1 つ。「簡略」スクリプトは、重要な情報が失われないようにより複雑なスクリプトと比較する必要があります。
    8. トランスフェクション試薬量および播種密度の重要な細胞死 (0-30% セル存続) 結果、最小限 (90-100%など細胞に有毒であるセルにある最適なトランスフェクション条件を決定する結果を分析します。細胞の生存)。注: それは長い倍増回細胞株における細胞死の表現型を観察する時間がかかります。図 2 bおよび2 C代表の結果を参照してください。また、非ターゲット siRNA 発現細胞、後で 1 つはこの密度の細胞に感染しますと固定の時点で約 90-100% 合流を確認します。
  2. ウイルスの最適な量と感染の長さの決定
    1. (参照 1.1.4.1 に 1.1.4.4) 上記; 逆トランスフェクションと同じステップを実行します。ただし、(1.1.8 参照) 最適なトランスフェクション条件のみを使用 (例えば786 O 細胞の: 1500 細胞/ウェルと RNAiMAX の 0.05 μ L/ウェル) と、さらに、[例えば井戸未処理細胞、模擬ウイルスに感染して余分な井戸がありますtransfected セル、セルをトランスフェクトした非ターゲット siRNA、および肯定的なウイルス コントロール場合 (すなわちsiRNA を阻害またはレプリケーションを強化する宿主遺伝子をターゲット) を知られているものをトランスフェクトした細胞]。
      1. サンプル プレート レイアウト図 3 aを参照してください。48-72 時間インキュベートします。
    2. 追加のウイルス井戸に感染 (モア) (例えば10 に 0.001; の多重度の範囲で蛍光レポーター蛋白質 (例えばGFP) を発現する腫瘍溶解性ウイルス感染します。選択された範囲が異なります抵抗のレベルまたは細胞の感受性。)。感染していない井戸だけでなくが含まれます。ピペット 40 80 μ L の最終巻の井戸あたり各ウイルスの希釈の μ L。室温で 30 分間 400 x g で各プレートを遠心します。
    3. 次感染、細胞高コンテンツをライブ画像は、定期的に顕微鏡を自動化 (例えばすべての 4-8 h)。図 3 b と 3 Cを参照してください。
    4. ウイルス拡散 (ウェルあたり例えばGFP エリア) を定量化するためのスクリプトを開発 (1.1.7 を参照)。画像を分析し、時間-ポイントとスプレッドの増減の検出を可能にする MOI を選択します。スプレッドの小さな変化の検出が容易に線形範囲内モイ秋時点を確認します。Z 係数の推定 (または Z') 与えられた時点と MOI のため。
      注: 推定 Z 係数 = 1-3 (σp + σn)/| μpμn| どこ σp肯定的なウイルス コントロールの標準偏差、σnは負のウイルスの標本標準偏差コントロール;μp肯定的なウイルスのコントロールと μn否定的なコントロールのサンプル平均の標本の平均値です。0.5 - 推定 Z 係数 1.0 は優れた分析を考慮し、20,21をスクリーニングに適してです。
    5. 否定的なウイルス コントロール siRNA 影響を与えませんウイルスの複製にモック transfected と未処理井戸と比較することによってを確認します。しばしば、コントロールすることができますウイルスの複製に影響を与えるいくつかの否定的な siRNA として複数の否定的なコントロールをテストするのには必要です。
  3. 高スループット スクリーニング アッセイの最終的な検証
    1. 最適な慣性モーメントを持つこの時間感染細胞のみ 1.2.1、1.2.2、上記の手順を繰り返します。ライブ イメージングではなく修正し、最適で (前述 1.1.5 と 1.1.6) プレートを汚れ時点 (1.2.4 を参照してください)。
    2. イメージ プレート。画面に使用する同じスクリプトを使用して結果を分析 (1.1.7 と 1.2.4 を参照してください)。(井戸の良い打撃すなわち肯定的なトランスフェクション コントロールと負のトランスフェクション コントロールをトランスフェクトした井戸で最小限の毒性トランスフェクション) トランスフェクション条件を確認します。アッセイの信頼性を決定する Z 係数の推定 (1.2.4 を参照してください)。
  4. さらにテストと高速スクリーニングを行うための考慮事項
    1. 複数の板はすぐに遠心分離し、蓋が置かれた場合は特に、いくつかのプレートが、遠心分離中に亀裂が、マイクロタイター プレートの耐久性をテストします。蓋なし遠心分離機、割れを減らすのため (提供されるプレート シールを持っている)、バケットごと遠心分離板の数を増減します。
    2. 時間をかけて、トランスフェクション試薬ミックスの安定性をテストします。トランスフェクション試薬をプレートに追加すると、セルの加算の前に大幅な遅延があります。そのため、トランスフェクション試薬ミックスが効果的に留まる時間の期間を知ることが重要です。画面には、プレートにトランスフェクション試薬ミックスを追加する前にセルを準備する必要があります。
    3. 液体ディスペンサーを使用するための準備します。トランスフェクション試薬、細胞、ウイルス、調剤に必要なボリュームを特定し、修正済み調剤 (存在する場合は、ユニットは、この機能を持っている)、するチューブ保持して、ボリュームが失われたボリューム用ボトルの残留量を考慮調剤。
      1. 設定し、トランスフェクション試薬、細胞およびウイルスの調剤に使用するプログラムをテストします。トランスフェクション試薬の損失を最小限に制限、可能であれば、数事前分配します。液体ディスペンサーを校正し、その正確さと精度をテストするためのプロトコルを確立します。
    4. トランスフェクション試薬、細胞やウイルスの一括調剤のための準備します。
      1. 最初うまく一度にトリプシンができますセルのプレート数を考慮した 1 つのバッチで処理される板の数を決定する、することができますマイクロタイター プレート数遠心一度に、1 つのバッチを処理するために必要な時間の長さ液体ディスペンサーもイメージングに必要な時間とプレート。注: 一般的に、約 30 のプレートを一度に処理することは非常に可能、プレートの 3 つのバッチの処理が一日で管理しやすい。
      2. 経験的プレートの 1 つのバッチを処理するために必要なトランスフェクション試薬の量を確認してください。このボリュームは十分な調剤 5 μ L の純水での複数回 1 つプレート 1 つのバッチを処理する必要がありますと同じ回数でテスト。
      3. 細胞の均等を確保するため、板の 1 つのバッチにわたってセルを分配するために必要な時間を見積もります。バッチに必要なセルのボリュームを含むボトルを準備し、プレートのバッチ間で分配するにかかる時間は、同じコースを定期的に、時に、プレートの複数の列にセルを分配します。細胞の均一な分布を維持するために細胞を混合する必要がありますどのくらいの頻度をテストします。
      4. ウイルスの均等を確保するため、今回は合流の井戸の上にウイルスを調剤 (1.4.4.3 参照)、上記と同じ手順を繰り返します。ウイルスが均等に分散していない場合は、調剤前に各管の円錐管とボルテックスのウイルスを準備することを検討してください。
    5. 画面に十分な細胞の成長のためのタイムラインを決定する細胞の成長を追跡します。また、画面に必要な数を推定することができるために、ログの段階で育つセルのプレートごと収穫できるセルの数の平均値を決定します。
  5. 高スループット スクリーニングのための最終的な準備の手順
    1. スクリーニングを開始する前に 1 ヶ月にすべての画面に必要な材料を決定します。(参照資料) 必須の試薬を注文します。一方でウイルスの必要量は確保する (好ましくは、最適化中に使用された同じ在庫を使用します。)。
    2. 2 週間以内に、審査を開始する前に解凍し、画面に必要な細胞に育ちます。遠心分離機と正方形遠心分離機バケットの可用性を確保します。
    3. スクリーニングの開始前に週の間に逆トランスフェクションと感染、70% エタノール、2 X トランスフェクション試薬の希釈液のストックのびんを準備 (例えば2 X Opti MEM) 場合、必要に応じて (例えばsiRNA ライブラリーはで希釈した場合RNase-free は水、一つは細胞を使って 2 X を使用する) とウイルス (板のバッチごとに 1 つ) の因数。セルの状態を確認します。
      1. ヘキスト 33342 汚れの貯蔵液の準備 (例えば5 mg/mL)。1 つは遠心分離の必要になる場合は、バランス プレートを準備します。
      2. プレート ワッシャーは、良い仕事の順序を使用する場合を確認します。正確にかつ正確に、液体ディスペンサーは、正しくキャリブレーションと調剤を確認します。また、液体ディスペンサーに対するプログラムが正しく設定を確認します。

2 主な高スループット画面を実施

注: RNAi スクリーニングを開始する前にマイクロタイター プレート (例: 384 ウェル プレート) の siRNA ライブラリーとスクリーニング コントロール配列する必要があります。次の手順が一人 (すなわち人 A) 調剤トランスフェクション試薬とプレートとされている 2 番目の人 (すなわち人物 B) 細胞の責任に主に責任がある人が二人で行う最適な方法トランスフェクションの直前に、セルを準備するためのプレートを遠心分離します。33 プレートの 1 つのバッチを処理するためのいくつかの詳細は、括弧内に含まれている (つまりライブラリの半分) 786 O 細胞ラインで。

  1. 逆の transfection のための準備
    1. 人 a: は、37 ° C の水浴のプレートの 1 つのバッチを処理するために必要な十分なメディア、トリプシンと PBS を配置します。オプション: Trypsinize セル、プレートとプレートのバッチごとに必要な数のリアルタイム推定値を提供するために板あたりのセル数をカウントします。
    2. 冷凍庫から板 (例えば33 板) のバッチを取得し、解凍するプレートを許可する 20 〜 30 分を待ちます。プレートは、霜取り中は、次の手順に進みます。
      1. 人 a: 50 mL の円錐形にピペット管板の 1 つのバッチを処理するために必要なトランスフェクション試薬の希釈の量 (例えば37.125 × 2 mL) し 37 ° C の水浴中に配置します。70% のエタノール (例えば250 500 mL ボトル) で 2 つのボトルを埋めます。PBS と蒸留水を 1 つ 2 つの 50 mL の円錐管を埋めます。
      2. 人 a: 70% のエタノールのボトルにチューブ液体ディスペンサーを浸します。すべてのヒントは調剤のトランスフェクション試薬 (例えばプレートのウェルが使用されていない場合) は使用されません、まず不要なチューブを切断します。以下、チューブが滅菌考慮することができますポイントをマークする管のまわりのマスキング テープの一部を配置します。約 25 mL と首相します。失われたボリュームを交換するボトルに追加エタノールを注ぐ。チューブを聞かせて 5 分以上のエタノールで座っています。
      3. B さんの準備をする細胞を trypsinize します。70% エタノールをティッシュ文化 (TC) フードをスプレーします。スプレーし、必要な pipets、ヒント、ボトルやフードのセルを準備するための microfuge の管場所 (2.2.1.1 と 2.2.1.2 参照)。常温で 2 分間 1026 x g でセットでシール プレートを遠心します。蓋が (を参照してください 1.4.1) で保たれるとき、プレートは遠心分離中に割れることがある場合、TC フード プレートから蓋を削除します。
    3. 人 a: は、プレートからシールを削除します。前に、中または後 (必要な潜伏の長さ) に応じてシールを削除されているピペットで移しなさい円錐管にトランスフェクション試薬 (例えば375 μ L/チューブの RNAiMAX/ウェルの 0.05 μ の最終的な集中) の必要量予め温めておいたトランスフェクション試薬の希釈液 (mL/チューブ 37.125など) を含みます。
    4. 上下に 10 回ピペッティングで混ぜます。トランスフェクション試薬を使用されている (例えば0-10 分) のために規定時間室温で孵化させなさい。
  2. トランスフェクション
    1. 人 B の次のタスクがあります。
      1. トリプシン セル (例えば3 786 O 細胞の板) を開始します。各板からメディアを吸い出しなさい。9 mL の PBS ですすいでください。プレートごとトリプシンの 3 mL をピペットで移しなさい。5 分約 22 mL の培地で細胞を再懸濁しますの 37 ° C で孵化させなさい。上下に 10 回ピペットで移しなさい。
      2. 各培養皿の細胞懸濁液を滅菌ボトルにまとめた。反転による細胞懸濁液を混ぜます。2 つの別々 の microfuge の管に細胞懸濁液の 1 mL 因数をピペットで移しなさい。各および microfuge の管からサンプルを削除し、セルをカウントします。必要な密度 (例えば1500 は細胞/ウェル) に必要な細胞懸濁液の体積を計算し、十分な希薄の細胞懸濁液を準備 (例えば500 mL) プレートの 1 つのバッチの間で分配します。
    2. 人 B に並行して次のタスクを完了する人 A を持っています。
      1. 液体ディスペンサーを空にエタノールのチューブします。首相の約 25 mL の PBS、チューブ、チューブを空にします。トランスフェクション試薬に浸漬され、細胞の懸濁液の後で滅菌されているマスキング テープの下の管のセクションをするチューブの処理に注意します。トランスフェクション試薬溶液の 1 つの円錐管で行うことができます安全に板を離れて設定します。
      2. トランスフェクション試薬を上下に 10 回ピペットで移しなさい。トランスフェクション試薬溶液とチューブを首相します。トランスフェクション試薬の損失を最小限に抑えるためにほとんどヒントをクリアするだけで十分なソリューションと首相します。液体ディスペンサーの適切なプログラムを選択し、5 μ l/ウェル トランスフェクション試薬の分注します。
        密接に、注意: はトランスフェクション試薬のレベルを監視して、それがなくなる前に補充します。完了、板の離れてセットよりトランスフェクション試薬溶液を追加してキューを提供する必要があります。
      3. 室温で 1 分 1026 x g でプレートを遠心します。今回は蓋になります、(例えば2 バケットあたりの板) の割れを防ぐために時間の少ないプレートを遠心分離機が必要になる場合がありますので。トランスフェクション試薬の所定期間の室温でプレートを孵化させなさい (例えば10 ~ 20 分)。
      4. 、インキュベーション中にトランスフェクション試薬溶液のチューブを空にして PBS を含む完全 50 mL の円錐管に入れます。プライミングによる PBS の約 25 mL のチューブおよび空にすすいでください。
        1. トランスフェクション試薬を調剤のために使用されたよりもセルを調剤するためのヒントの場合は、未使用の管を取り付けると再滅菌 PBS でチューブを洗浄する前に 70% のエタノールですべてのチューブ (2.1.2.2 参照)。
      5. 準備されている一度に細胞懸濁液を含んでいる瓶をミックスします。細胞懸濁液、チューブを置き、各チップが正しく調剤されて参照してくださいに十分な首相。すべての板に 30 μ L/ウェルの細胞懸濁液を調剤します。必要な場合は、セトリング避けるために定期的に細胞懸濁液をミックスします。
        注意: 時々 メディアを含む懸濁液の液滴は、ヒントの側面に固執があります。これを観測すると、できるだけ早く吸引または 70% エタノールで水を掛けて糸くずティッシュで拭いてください。
      6. 細胞懸濁液のチューブを空にします。約 25 mL の PBS、約 50 mL の蒸留水が続くとチューブをすすいでください。
    3. インキュベーターにプレートを返す前に室温で播種細胞の時間から 45-60 分間座っている板を許可します。遺伝子サイレンシング (例えば48 h) の希望の長さに邪魔されずインキュベーターでプレートを孵化させなさい (1.1.4.5 を参照)。
  3. 感染症
    1. 日細胞に感染する前に、時間を節約するために滅菌ピペット瓶感染していない井戸のためのメディアを含む板の各バッチに感染に必要なメディアの正確な量 (例えば2 × 350 mL と 33 板の 2 x 50 mL)。さらに、精度と確度、液体ディスペンサーをテストし、必要に応じて再調整します。
    2. 37 ° C でメディアをウォーム アップします。70% エタノール、PBS で 2 つの 50 mL の円錐管と蒸留水を 1 つ 2 つのボトルを記入します。遠心分離機は、部屋の温度を確認します。
    3. 70% エタノールでチューブを滅菌して説明した (参照 2.1.2.2、2.2.2.1) として PBS で洗い。チューブは、エタノールで座っている間、ピペットで移しなさい以前メディアを含むボトルに必要なウイルス量を正確かつ準備感染症 (2.3.1 参照)。25 mL のプライミングして、空に PBS でチューブをすすいでください。
    4. インキュベーターからプレートを外し、TC フードにそれらを置きます。メディアでチューブを首相します。感染していないコントロール井戸にメディアの 40 μ L を調剤します。空のメディアのチューブと 25 mL の PBS ですすいでください。(注意 2.2.2.5 を参照)
    5. ウイルスを混合した後、ウイルスが含まれているボトルにチューブを配置します。プレート間でウイルスの 40 μ l を調剤します。室温で 400 x g で 30 分間プレートを遠心します。プレートをインキュベーターに戻ります。時間 (たとえば24 時間) の以前に決定された長さの板を孵化させなさい (1.2.4 を参照してください)。
  4. 固定および汚損細胞
    1. 日を修正する前に、時間を節約に固定、プレートの各バッチに対してホルムアルデヒドと PBS (例えば270 mL の PBS 最終濃度 4% のホルムアルデヒドの 37% ホルムアルデヒドの 179 mL) を含む溶液を染色のボトルを準備が省略、ヘキスト染色。可燃性の光からキャビネットに格納します。
    2. 前述 (参照 2.1.2.2、2.2.2.1) として 70% のエタノールおよび PBS でチューブをすすいでください。ヘキストの必要量を追加 (e.g。 7.5 μ g/mL の井戸の最終的な集中のヘキストの 5 mg/mL の 2.5 mL) 固定と染色ソリューションとミックスします。
    3. 修正のすべての版の間で染色液 30 μ L を分注します。30 分のためのインキュベーターにプレートを配置します。次の孵化は、プレートにシールを適用し、4 ° c の光から保護板を格納します。必要に応じてプレートを洗う (1.1.6 を参照)。
  5. イメージング ・画像解析
    1. 自動、高コンテンツ顕微鏡とプレートのイメージです。以前に決定された設定を使用、最初に調整を可能にする必要はありませんできるように、設定をテストします。
    2. GFP (または他の蛍光レポーター) を定量化するエリアとも開発済みのスクリプトを使用してヘキスト面積 (1.3.2 参照)。バッチは、プレートのすべての分析の前に行われる任意のわずかな変更が必要なかどうかは、最初のプレートの一握りでスクリプトをテストします。
    3. ヒットを識別します。注: 堅牢な Z-スコア/マッドフォース (中央絶対偏差) メソッドが、この終わりに向かって頻繁に使用されるメソッドです。通常、スコアの > 2 または <-2 は、カットオフとして設定されます。このメソッドは、siRNA のサンプルをプレートにランダムに分布し、は、たとえば、グループ化関数によってサンプルが事実上のネガティブ コントロールとして使用されて使用します。これらはウイルス (細胞傷害性のヒットをフィルタ リングの詳細についての議論を参照してください) を減少させる非具体的に期待される細胞傷害性 Sirna をフィルターします。

3 TRC (、RNAi コンソーシアム) shRNA ライブラリとヒットのセカンダリ画面検証

注: は、二次検証および可能なスクリーニング技術のヒット数の選択の詳細についての議論を参照してください。主な画面のために使用された同じ試金の開発と妥当性のプロトコルを使用できます二次検証用 siRNA 技術を選択している場合 (1 を参照)。

  1. グリセロールとして興味のある候補者遺伝子をターゲット カスタム TRC shRNA ライブラリを取得します。
  2. トランスフェクション品質プラスミド DNA、グリセロールからの準備します。注: 詳細なプロトコル (すなわち「shRNA/sgRNA/ORF グリセロールとプラスミド DNA の準備」) ここで見つけることができます: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
  3. DNA プラスミドを興味のある遺伝子をターゲット shRNA 発現するレンチを生成します。注: 96 ウェルのプレートにレンチ ウイルスの生産のための詳しいプロトコル [すなわち「shRNA/sgRNA/ORF 高スループット ウイルス生産 (よく 96)"] ここで見つけることができます: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
  4. レンチで細胞に感染します。注: 96 ウェル プレート (すなわち「レンチ ウイルス感染」) にレンチ ウイルス感染症のための詳しいプロトコルは、オンラインで http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral%20infection%20200909.pdf。
  5. 感染腫瘍溶解性ウイルスと細胞いずれか次ピューロマイシンを選択 (選択プロトコル 3.4 参照) 正常に導入された細胞または (ピューロマイシンを選択) することがなくすぐに次の伝達の。ウイルスの最適な量とウイルスの潜伏の長さを決定するには、メイン画面と同じ方法を使用します。

4. 第三の検証

注: 第三紀の検証の目的は、主とことを確認ヒット腫瘍特定のターゲットでは、有効性を高めるです体内。1 つはまた腫瘍のセルラインのスペクトルにわたって広がりを調節するかどうかをテストできます。

  1. 候補遺伝子のノックダウンその確認がターゲットに
    1. 最初の表現型と遺伝子サイレンシングの相関があることを確認します。スクリーンに開発された同じアッセイを使用または強化または大規模な形式のスプレッドの抑制を評価する 6 ウェル フォーマットのためにそれを変更します。金利プラスとマイナス ウイルス遺伝子をターゲットとする siRNA 発現細胞と時間コースを実施します。
    2. ウイルスに感染した細胞を含む井戸をイメージし、定期的な間隔で感染していない井戸からセル lysates を収集します。遺伝子サイレンシングの強化や普及の阻害の相関があるかどうかを決定します。量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) および/または西部にしみが付くことによる遺伝子サイレンシングを評価します。
    3. ターゲットにヒットを確認する遺伝的レスキュー実験を実行します。注: 典型的なレスキュー実験の候補遺伝子をノックダウン RNAi とセルと RNAi 耐性 cdna (例えば遺伝子のオーソログ) 一過性トランスフェクション同時に中を決定する遺伝子の候補を表現するかどうか、遺伝子の表現型を復元したり、「救出」。興味の候補遺伝子の RNAi 耐性 cDNA を過剰発現する安定したセルラインを使用もできます。
    4. また、遺伝的レスキュー実験代わりにヒットが対象であることを確認する複数の直交アッセイを使用 [例えば判断のノックダウン時に複数の Sirna のターゲット遺伝子のノックダウン時に同じ表現型を取得するかどうかターゲット遺伝子に対する、CRISPR (クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し) でノックアウト shRNA 発現する複数の安定したセルラインでの標的遺伝子-複数の細胞株における Cas9 技術。]。
  2. ヒットは腫瘍固有であり、腫瘍のセルラインの範囲にわたって広がりを調節することの確認
    1. 4.1.1 のように、正常細胞や他の腫瘍の細胞のようなアッセイを行ってください。
  3. 生体内で効果候補遺伝子の操作を強化することの確認
    注: 以下は遺伝子を操作するための 3 つの可能な方法は生体内ターゲットです。
    1. 遺伝子ターゲットを操作する薬を見つけます。同じ遺伝子を対象とする小分子阻害薬などの薬剤がある場合は、腫瘍溶解性ウイルスの体内で管理します。薬を管理するための最適なタイミングを決定することが重要です。
    2. エンジニアを抑制するかどうか 1 つによって遺伝子ターゲットをノザン ウイルスの抑制あるいは遺伝子ターゲットを増強する欲望します。遺伝子を阻害する、エンジニアの支配的否定的な遺伝子またはエクスプレス shRNA 遺伝子をターゲットを表現する腫瘍溶解性ウイルスを実行します。ターゲット遺伝子の表現を高めるためには、腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子を過剰発現遺伝子クローンします。
    3. エンジニア細胞遺伝子をノックダウンまたはノックアウトそれぞれ shRNA や CRISPR Cas9 技術を使用しています。インプラントの設計細胞と野生型細胞の生体内で線とその後腫瘍溶解性ウイルスに感染します。注: このメソッドは、証明の原理として、遺伝子、生体内で、たとえば、操作する薬剤を開発するためのリソースの追加の時間と投資が価値があるかどうかを判断するのに役立ちます。

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結果

腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するホスト ターゲットを識別するためのワークフローの概要については、図 1にされます。

図 1に示すように、ハイスループット RNAi スクリーニングを実施する重要な第一歩は分析法の開発です。図 2 aは、トランスフェクションの最適化分析のサンプル プレート レイアウトを提供します。図 2 bは期待される結果の代表的なイメージで構成され、図 2は期待する結果の代表的なプロット。0-30 の間にある細胞の生存 PLK-1、細胞死を誘導して siRNA のノックダウン効率を監視する肯定的な制御として使用できる遺伝子の siRNA ノッ...

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ディスカッション

ハイスループット RNAi スクリーニング腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために採用するためのプロトコルをご紹介します。これは、腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルス、正常にテストされていますが、前述のように、適応できる他の腫瘍溶解性ウイルスや他のウイルスを使用一般にウイルスの複製を調節する宿主遺伝子を識別するために。スクリーニングのプロトコルの目的はまた増加または減少の普及に伴い、遺伝子を識別するが、他の読み出し用に容易に変更できます。Maraba ウイルス、例えば、私たちの画面調節細胞生存率をスコアに単純なレサズリン ベースの重要な染料のアッセイを利用した腫瘍の遺伝子を識別するために設計されていた (図 4参照)15。これらの画面は、次のウイルスの孵化で、ホルムアルデヒドとヘキスト染色細胞を固定ではなく我々 調剤 (最終濃度 20 μ g/mL) を各ウェルにレサズリン染料と、吸光度を測定した 6 時間培養後 (573 nm) と、プレート リー...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、イノベーション ・ オタワ地域がん財団・ テリー Fox 研究所がん研究、カナダの財団のオンタリオの研究所からの助成金によって支えられました。K.J.A. は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金、健康研究マスター賞のためのカナダの研究所によって支えられたとオンタリオ州大学院奨学金。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
消耗品
siRNAライブラリーGE DharmaconG-005005-02
Corning 384ウェルプレートCorning3985
Falcon 384ウェルプレートBecton Dickinson353962
WaterSigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars Negative Control siRNAQiagenSI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM/HIGH GlucoseGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
ウシ胎児血清ΣF15051-500ML
HEPES 溶液 (1M)SigmaH3535-100ML
ペニシリン-ストレプトマイシン 100X 溶液GE ヘルスケア ライフサイエンスSV30010
トリプシン-EDTA (0.25%)サーモフィッシャー サイエンティフィック2500056
DPBS/ModifiedGE ヘルスケア ライフサイエンスSH30028.02
リポフェクタミン RNAiMAXサーモフィッシャー サイエンティフィ13778100
オリゴフェクタミンサーモフィッシャーサイエンティフィ1225011
Opti-MEMサーモフィッシャーサイエンティフィック22600-050
レサズリンナトリウム塩ΣR7017-5G
ヘキスト 33342サーモフィッシャーサイエンティフィックH21492
ホルムアルデヒド(重量%37%)フィッシャーサイエンティフィックF79-4
500 ml ボトルコーニング
マイクロプレート用430282接着シールフィルムエクセルサイエンティフィック361006007
剥離可能なヒートシールホイルサーモフィッシャーサイエンティフィックAB-3720
BioTek MicroFloセレクトディスペンサーカセットフィッシャーサイエンティフィック11-120-625
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
MicroFlo Select (液体ディスペンサー)フィッシャーサイエンティフィック11120621
BioTek Synergy HTプレートリーダーBiotekN/A
オペライメージングおよび分析機器PerkinElmerHH10000115
KiNEDx Robotic ArmPeak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated IncubatorThermo Fisher Scientific50080227
JANUS Automated WorkstationPerkinElmerAJI4M01
Plate CarouselPeak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)N/A
Alps 3000 プレートシーラーサーモフィッシャーサイエンティフィックAB-3000
ック ック

参考文献

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