このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

16K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/56915

⸱

2017年12月12日

 , 
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

この記事について

サマリー

セルに CRISPR/Cas9 を提供するための車としてインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の生産戦略について述べる。迅速かつ堅牢な遺伝子がセル内編集を仲介する能力、IDLVs 現在安全と同様に効果的なベクトル遺伝子送達用に比べてベクトル インテグラーゼ主務。

要約

レンチウイルスベクターは、安定して高いレベルの遺伝子発現を仲介する細胞の広い範囲を伝達の能力による細胞に遺伝子編集コンポーネントを提供するための理想的な選択肢です。しかし、宿主細胞のゲノムに統合する能力を挿入変異原性のリスクを高めるため安全上の懸念を発生させます、臨床現場での使用を制限します。さらに、これら統合主務レンチウイルスベクター (ICLVs) 増加によって無差別遺伝子ターゲティングの確率を配信遺伝子編集コンポーネントの永続的な表現。代わりは、これらの問題の多くが解決、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の新世代が開発されています。ここ CRISPR 媒介性遺伝子編集およびリストのための新しく、改良された IDLV プラットフォームの生産のプロトコル、精製の手順し、このようなベクトルの濃度が記載されて伝達と HEK 293 t を使用して遺伝子編集効率細胞を示した。このプロトコルは、拡張が容易細胞in vitroとin vivoのことができる高価 IDLVs を生成に使用することができます。さらに、このプロトコルは、ICLVs の生産のために容易に適応することができます。

概要

正確な遺伝子編集遺伝的疾患に取り組むために新しい戦略の開発を含む生物医学的進歩の基礎を形成します。遺伝子編集技術の最前線は、 c光沢regularly -私nterspaced s「hort」 palindromic repeats (CRISPR) の使用に依存するメソッド/最初に識別された Cas9 システム(参照1,2レビュー) ウイルスの遺伝物質の侵入に対する細菌免疫のコンポーネント。亜鉛指核酸 (ZFNs) と転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) を (参照3の見直し) などの他の遺伝子編集ツール以上 CRISPR/Cas9 システムの主な利点はプラスミド設計の相対的なシンプルさとCRISPR コンポーネントの構築-の電源が大いにより広い研究コミュニティにいくつかの専門の研究所から遺伝子-編集の拡張機能。また、CRISPR/Cas9 プログラミングの簡潔さと多重ターゲット認識能力さらにコスト効果の高い、簡単に使用できる技術としてその人気を煽っています。ウイルスのベクトル、細胞にこのような遺伝子編集コンポーネントを提供する研究者に利用できるさまざまな方法の中で最も人気のある、効率的なシステムのまま抜いて。

レンチウイルスベクター (LVs) は、CRISPR/Cas9 システム生体内で多様なアプリケーション4,5,6、7のためのコンポーネントを提供する最適な手段として浮上しています。いくつかの主要な機能は、LVs 分割と非分裂細胞、低免疫原性と最小の細胞毒性 (文献8の見直し) の両方に感染する能力を含むこのプロセスの人気のある選択肢を作る。結果として、LV 媒介性遺伝子治療は人間の遺伝性疾患、嚢胞性線維症やネオ血管の加齢黄斑変性などの基礎となる欠陥の補正だけでなく、HIV 1、HBV、HSV-1 などの感染症の治療に採用されています。4,5,7,9,10,11します。 また、LVs を効果的に多重遺伝子の単一のベクトル システム12を使用して異なるゲノム遺伝子編集を実行に変更されています。

しかし、Lv がホストのゲノムに統合するための固有の特性は変異することができます、しばしばハンディキャップとして transgene の配送車、特に臨床の現場での実用。さらに、Lv が安定的に統合された持続可能な高いレベルで自分の遺伝子を表現、以来このシステムは適して CRISPR/Cas9; など遺伝子編集コンポーネントの配信のためCas9 ガイド RNA (gRNA)、および ZFNs など同じような蛋白質の過剰発現は望ましくない突然変異13,14,15,16を含むオフターゲット効果の高いレベルに関連付けられています。,17 18細胞毒性を高めることができる可能性があります。したがって、正確な達成するために最小限のオフターゲット効果と遺伝子編集だ編集コンポーネント遺伝子の一過性発現を可能にするシステムを設計することが不可欠。

近年、一過性細胞16,19,20,21 (参照22レビュー) に CRISPR/Cas9 を表現するさまざまな配信プラットフォームが開発されています。直接ご紹介と共に適切なガイド Rna 精製 Cas9 細胞にトランスフェクションのプラスミド性16と比較する対象となる遺伝子編集でより効果的に示されていたに依存するメソッドが含まれます。そのリボ核タンパク質 (RNP) の調査は示した錯体から成るガイド RNA/Cas9 粒子はそれらの目標は、これらのコンポーネントの短期的な表現が達成するために十分であることを示唆で DNA 切断を仲介後急速にめくって堅牢な遺伝子16を編集します。多分、非統合アデノ随伴ウイルスベクター (通気) などウイルスのベクトルのプラットフォームは細胞に遺伝子編集機械を提供する実行可能な代案を提供できます。残念ながら、AAV カプシドは Lv よりも大幅に低い包装機能を所有している (< 5 kb)、これは深刻な (文献8の見直し) 単一ベクター内多成分 CRISPR ツールキットをパッケージ化する能力を妨げます。それは、レンチ ウイルスの力価を増加する (例えばナトリウム酪酸23) にヒストン脱アセチル化酵素を阻害する、または (例えば、カフェイン24) 細胞周期阻害化合物添加が示されていることは注目に値するです。最近の進歩にもかかわらず、これまで開発した一過性発現システムはまだ生産効率が悪くなどに、減らされたウイルス抗体とウイルスを介して生成された低伝達効率につながる欠点によって妨げ25をのようなアプローチします。

インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) は、LVs の包装機能を組み合わせて細胞における AAV のような episomal 整備の利点として遺伝子デリバリー車両の開発に大きな進歩を表しています。これらの機能は、主ベクトル、潜在的遺伝毒性要素の統合による変異原性に対して-à-に対して継続的な過剰発現の統合に関連する主要な問題を回避 IDLVs を助けます。以前 episomal 遺伝子式26,27を強化する IDLVs、正常に変更できることが示された.IDLV を介した CRISPR/Cas9 配信に関して低生産価とインテグラーゼ熟練したレンチウイルスベクター システムと比較して episome 由来のゲノムの低い表現制限ゲノム編集を提供するための善意のツールとしての実用遺伝子組換えを構築します。我々 は最近、遺伝子発現および IDLV の生産に関連付けられているウイルスの抗体は、ウイルス発現カセット28内転写因子 Sp1 のためのサイトのバインドを含めることによって大幅に強化を示した。変更された IDLVs は確実 CRISPR 媒介性遺伝子 ICLV を介した対応と比較して最小限のオフのターゲット変異を誘導しながら両方体外(HEK 293 t 細胞)体内(分裂後の脳ニューロン) での編集をサポートシステム28。全体的に、小説を開発した、コンパクト、CRISPR ツールキット IDLV プラットフォームで実施し、強化された遺伝子編集のような配信手段を使用しての様々 な利点を説明しました。

ここでは、IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産プロトコルは述べたように、アセンブリ、浄化、集中、および IDLVs、だけでなく、戦略は、これらのベクトルの遺伝子編集の有効性を検証するための滴定に関連するさまざまな手順を含みます。このプロトコルは別の捜査官のニーズを満たすために拡張が容易と 1 x 10 の10単位 (TU) の伝達の範囲の値と LV ベクトルを正常に生成するように設計/mL。このプロトコルを介して生成されたベクトルを活用すると、効率的にいくつかの異なる種類の細胞、培養および変換困難な胚性幹細胞、造血細胞 (T 細胞やマクロファージ) を含むとin vivo- に感染すること注入されたニューロン。さらに、プロトコルは似たような量のインテグラーゼ有能なレンチウイルスベクターの生産のため均等に適しています。

figure-introduction-1
図 1: IDLV 包装します。変更されたプラスミドは、psPAX2 から派生した野生型インテグラーゼ蛋白質(b)の(a)の回路図 (詳細についてはプラスミド構築メソッドを参照してください)。クローン変異インテグラーゼ クローンのスクリーニングの代表 agarose ゲル画像。標準プラスミド DNA 分離ミニ キットを使用して作製した DNA サンプルは、EcoRV と SphI 消化によって分析されました。正しく消化クローン (番号 5、赤い点線) は直通 (サンガー) intD64E 置換シーケンスによってさらに検証されました。インテグラーゼ欠損包装カセット pBK43 に選ばれました。(c)トランスフェクション プロトコルの概略図は VSV G、パッケージング、および遺伝子カセット (Sp1-CRISPR/Cas9 オール イン ワン プラスミッド) をトランスフェクトした 293 t 細胞を示す IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルを生成する採用。細胞膜から芽をウイルス粒子には (遺伝子カセットから表される) ベクトルのフルレングスの RNA が含まれます。Tat の規制のタンパク質が含まれています、IDLV 包装システムの第二世代が使用され、牧師回転式はさらに別のカセット (RSV REV プラスミド) から補われます。略語: LTR 長いターミナル繰り返し、VSV-g の水疱性口内炎ウイルス pCMV サイトメガロ ウイルス プロモーター; G タンパク質ラウス肉腫ウイルス (RSV) プロモーター。RRE - (回転応答要素)。式カセットの他の規制要素があります Sp1 結合部位、Rev 応答要素 (RRE)、ウッド チャック肝炎ウイルス転写規制要素 (WPRE)、コア伸長因子 1 α プロモーター (EFS ノースカロライナ州)、ベクトル包装要素 ψ (psi)、人間のサイトメガロ ウイルス (hCMV) プロモーターおよび人間の U6 プロモーター。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1. HEK 293 t 細胞を培養とトランスフェクションの細胞を播種

注: 人間の萌芽期の腎臓 293 t (HEK 293 t) セルは高グルコース培地 10% 牛子牛血清鉄と成長プロモーターと抗生物質抗真菌薬ソリューション x 1 添加 DMEM で育つ (100 x ソリューションが含まれています 10,000 単位のペニシリンには、10 mg ストレプトマイシンと 1 mL あたり 25 μ g アムホテリシン B)。メディアもピルビン酸ナトリウム x 1、1 x 非必須アミノ酸ミックス 2 mM L グルタミンと補われる (0.85% でストック 200 mM L-アラニル-L-グルタミン ジペプチド NaCl)。セル (おおよそ成長表面面積は 55 cm の ²) 100 mm 組織培養皿で培養されます。1:10 のサブの栽培比率がサブで 2-3 日毎の培養による使用されます。トリプシン-EDTA の通路間のセルの解離の 0.05% を使用します。実験の間の一貫性を維持するために我々 は、細胞の成長、トランスフェクション効率の変更を監視してベクトル生産異なる多く/バッチへの切り替え時に子牛血清のテストをお勧めします。

  1. 10 cm 組織培養プレートに播種低通過細胞 (通路 15 以降成長が減速したかどうかセルを使用しないように推奨) を使用して新しい文化を開始します。細胞の成長のための 10% 血清と DMEM を使用します。標準的な組織文化のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° C で細胞を成長します。標準検定を使用して、すべての後続のステップのセルをカウントします。
  2. セルは (以下、手順 1.3 - 1.5) 組織培養プレート 90-95% コンフルエント成長、15 cm にシードを達する。
  3. シード、合流のプレートからメディアを吸引し、優しく滅菌 1x PBS で洗いします。追加 8 mL の解離試薬を不活性化し、単一のセルを作成する 10 mL の血清ピペットで 10 〜 15 回をカップ刻んだ血清を含む培地 3 ~ 5 分の 37 ° C で 2 ml の解離試薬 (例えばトリプシン-EDTA) の細胞を孵化させなさい懸濁液。約 4 x 106細胞/ml の細胞密度を得るため培地で細胞を再懸濁します。
  4. 基板への付着を高めるためには、事前の 0.2% のゼラチン、ゼラチン板あたりの 8 mL を追加で 15 cm プレートをコートします。プレートの表面に均等に広がる、10 分間室温でインキュベート、液体を吸い上げます。
  5. 各プレートの総容積をもたらす 25 mL のぬるま湯 (37 ° C) HEK 293 T メディア (手順 1 でメモを参照してください) でセル (合計 〜 1 107セル/プレート x) の 2.5 mL を追加することでプレートをシードします。一晩または 70-80% の confluency に達するまで 5% CO2と 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
    注: 生産の 6 の 15 cm プレートまでを使用できます。以上 4 つのプレート (理論的根拠のためのプロトコルの手順 5 を参照) を使用する場合は、20 〜 22 mL にプレートごとメディアの音量を調整します。

2 株の HEK 293 t 細胞カルシウム リン酸ベースのプロトコルを使用して

  1. トランスフェクション試薬
    1. BES 緩衝液掲示板 (50 mM、BES 280 mM の NaCl、1.5 mM Na2HPO4) x 2 を準備するには、BES の 10.65 g, 塩化ナトリウム 16.36 g を組み合わせる (N, N-ビス (2-ヒドロキシエチル)-2-アミノ-ethanesulfonic 酸)、および Na2HPO40.21 g。ダブル蒸留 H2O (dd H2O) 追加 900 mL。溶かし、ph 6.95 1 M NaOH で滴定しなさい、0.22 μ M フィルター ユニットを介して 1 の l. フィルターにボリュームをもたらします。-20 ° C にてストア
    2. 1 M CaCl2を準備します。0.22 μ M のフィルターを経由してソリューションをフィルター処理します。4 ° C でのストア
  2. 日前日を播種板を観察します。セルは、70-80% の confluency に達すれば transfection のため準備ができています。
  3. プレートから古いメディアを吸引し、優しく血清なし出来立てのメディアを追加します。
    注: 選択したプラスミドと彼らの準備の詳細については補足ファイル 1 プラスミドを参照してください。
  4. 15 mL の円錐管に早かった 4 つのプラスミド プラスミド ミックスを準備します。単一の 15 cm 皿の準備のため、CRISPR/Cas9-転送ベクトル (pBK198 または pBK189)、25 μ g pBK43 の 37.5 μ g を使用 (psPAX2 D64E)、12.5 μ g pMD2.G と前のページ (図 1 c) の 6.25 μ g。
  5. 312.5 μ L 1 M CaCl2をプラスミッドのミックスに追加します。これに、滅菌 dd H20 の最大 1.25 mL を追加します。
  6. ゆっくりと (drop-wise) ボルテックス ミックス中 2 の x BBS ソリューションの 1.25 mL を追加。室温で 30 分間インキュベートします。
  7. 各 15 cm プレート (プレートあたり 2.5 mL) に滴下トランスフェクション混合物を追加します。プレートを軽く旋回し、5% CO2 2-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。その後、プレートあたり 2.5 mL (10%) の血清を追加し、培養を続ける一晩 (12-18 h)。
    注: いくつかのラボは、メディアの pH を安定させるために 3% CO2インキュベーターを使用します。しかし、我々 は 3% と 5% CO2のトランスフェクション効率の違いを観察しません。また、カポ4の沈殿物のサイズはトランスフェクション効率のために重要トランスフェクション ミックスは、細胞に添加する前に明確にすること。ミックスは、インキュベーション中に曇りになると、新鮮な 2 x BBS を準備 (pH = 6.95)。

figure-protocol-1
図 2: ダブル ショ糖勾配のプロトコルを使用してウイルスの粒子の濃度が。上清 (SN) から収集したウイルス粒子は、グラデーション ショ糖密度勾配上に読み込まれます。70%、60%、30%、20% のショ糖液を使用して、グラデーションを作成します。遠心分離後 30 〜 60% ショ糖分数から収集された粒子は 20% ショ糖クッション上に読み込まれ、沈殿さらに。精製ウイルス粒子を含む最終的なペレットはそれ以上の使用のための 1x PBS で再停止される (詳細は本文を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

3 トランスフェクション後日

  1. 細胞は細胞死には少しこの時点で 100% の confluency を近づいていることを確認するを確認します。25 ミリリットル新鮮な DMEM + 10% 血清を各プレートに追加することによってメディアを交換してください。さらに 48 時間 5% CO2と 37 ° C で培養を続けます。
    注: は、六つ以上 15 cm プレート (注: ステップ 5.2 を参照) を使用している場合、3.1 の手順でメディアの音量を調整します。

4. ウイルスの収穫

  1. 慎重に上清を収集し、10 mL の滅菌培養ピペット 50 mL 遠沈管にプールして transfected セルを含むすべての組織培養プレートから。
  2. 卓上型遠心分離機を使用して 10 分の 400-450 × g で遠心分離によって懸濁液をクリアします。0.45 μ m の真空フィルター ユニットを介して上清をフィルター処理します。
    注: フィルター処理された上澄みはまたは検体および-80 ° C で保存されますの 4 日前に濃度、4 ° C で保存をすることができます。IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (非濃縮) ウイルス製剤の期待される抗体は、〜 10 x 2 をする必要があります7 TU/mL (力価を決定するための手順 6 を参照)。ただし、各ラウンドの凍結及び融解機能価の 10-20% の損失の結果として、複数の凍結融解サイクルにウイルス製剤を服従させることを避けます。

5. 超遠心法によるウイルス粒子の濃度

注: 駆使し浄化の 2 つの手順のダブル ショ糖法: ショ糖勾配ステップとショ糖クッション ステップ (図 2)。

  1. ショ糖密度勾配を作成するのには、次の順序で円錐形遠心チューブをロード: 0.5 mL 70% ショ糖 (1 x PBS を解散) (DMEM で解散) 0.5 mL 60% ショ糖, 1 mL 30% ショ糖 (DMEM で解散)、および 2 mL 20% スクロース (1 × PBS で解散)。
  2. グラデーションにウイルスを含む上清を慎重に追加します。4 つの 15 cm プレート上澄みの総量は 100 mL、ウイルスの培養上清中のフル ・ ボリュームを処理するのにスピンあたりの六つの遠心管を使用します。
    1. このステップで使用される各遠心チューブ (ショ糖の量を含む) に 30 mL の容積容量は少なくとも 10% を残して、チューブの間で均等にウイルス上清を配布流出を防ぐためヘッド スペース。
    2. 音量を調整する文化板あたり 20 ~ 22 ml 各実験のためよりも 4 つの 15 cm プレートを用いたときのでプールのウイルス上清の最終巻は 6 遠心チューブ内で簡単に対応できます。
    3. 塗りつぶし遠心チューブ、少なくとも 4 分の 3 の合計ボリューム容量、遠心分離、サンプルおよび/または機器の損傷の消失の結果中にチューブの破損が発生するそれ以外の場合。
  3. 17 ° C で 2 時間 70,000 x g で PBS および遠心分離機のサンプル × 1 と管のバランス (詳細についてはローター材料の表を参照)。
    注: 加速中にショ糖層の破壊を防ぐためには、ゆっくりとスピンの最初の 3 分間を 200 rpm ローターを加速する超遠心機を設定します。同様に、0 rpm の回転の終わりに 3 分間以上 200 rpm からローターをゆっくりと減速する超遠心機を設定します。
  4. 慎重にきれいな管 (図 2) に 30 〜 60% ショ糖分数を収集します。冷 1 の追加プールの分数に PBS x そして 100 mL にボリュームを持ってくる上下に数回ピペッティングで混ぜます。
  5. ショ糖クッションにウイルスの準備を慎重にレイヤリングによってスクロースのクッション ステップに進みます。このため、チューブ、チューブごとウイルス ソリューションの 20 ~ 25 mL に続いてに 4 mL (1 × PBS) で 20% ショ糖を追加します。チューブは 4 分の 3 未満である場合、完全な滅菌 1x PBS でトップ。
  6. 慎重にバランスし、遠心分離機の 17 ° C で 2 時間 70,000 x g でサンプルとして前に。上清を離れて注ぎ、残りを許可するペーパー タオルの管の反転によって流出させる液体。
  7. ペレットからすべての液体を除去するために残りの水滴を吸引します。この手順では、ウイルスを含んでいるペレットは、半透明の小さな白い斑点としてかろうじて見えるはず。
  8. 初の管徹底的に懸濁液を分注、その後次の管に懸濁液を転送すると、続行する前に、すべての餌を再停止されるまで混合 1 × PBS の 70 μ L を追加することでペレットを再懸濁します。
  9. 前に冷たい 1 × PBS とミックスの追加の 50 μ L でチューブをすすいでください。最終的な懸濁液の合計量 ~ 120 μ L し若干乳白色; が表示されます確実に30 10,000 × g で遠心分離によってクリア s 卓上遠心機です。
  10. 新鮮なおよび microfuge の管に上清を転送、10 μ 因数を作る、-80 ° C で保存
    注: は、レンチ ウイルス サンプルの凍結融解の繰り返しを実行しないでください。遠心分離が必要な場合を除く努力するティッシュ文化フードの残りの手順を行ってか適切なバイオ セーフティ対策 (ディスカッションを参照) を使用して組織培養室を指定します。

6. ウイルス抗体価の推定

  1. p24 -酵素-結合抗体法 (ELISA) 法をリンク
    注: アッセイを用いて高バインド 96 ウェル プレートとして HIV 1 p24 NIH エイズ ワクチン プログラムの指示に従って抗原捕獲の試金 (材料の表を参照) とキットの変更29。
    1. 次の日は 200 μ 0.05% で 3 回洗浄冷 PBS (PBS T ソリューション) でトゥイーン 20。コートの 1:1500 1x PBS で希釈抗体モノクローナル抗 p24の 100 μ L をプレートと 4 ° C で一晩インキュベート
    2. 非特異的結合を避けるためには、PBS; で 200 μ L 1 %bsa を用いたプレートをブロックします。0.05% を 200 μ L で 3 回洗い冷 PBS (PBS T ソリューション) 室温で少なくとも 1 時間でトゥイーン 20。
    3. サンプルの準備:集中のベクトル準備のため 1 μ L のサンプルを 100 倍希釈トリトン X-100 (最終濃度 10%) の dd H20 と 10 μ l 89 μ L を追加することによって。非濃縮製剤 (トリトン X-100 (最終濃度 10%) の dd H20、10 μ L の 80 μ L を 10 μ L のサンプルに追加) 10 倍希釈試料を準備します。
      注: サンプルはこの手順で-20 ° C での後で使用のための時間の長時間保存できます。
    4. (開始濃度 5 ng/mL) と 2 倍連続希釈を適用することによって HIV-1 標準を準備します。
    5. 1:10, 000 を確立する 0.2% Tween 20 と 1 %bsa 添加 RPMI 1640 年 (1: 100 希釈株式) から集中してサンプルを希釈 1:50, 000、および 1:250,000 希薄。非濃縮試料を希釈 (1:10 から株式を希釈済み) 1: 500、デジタルラ スター、および 1:12,500 の希釈を確立する 0.2% Tween 20 と 1 %bsa 添加 RPMI 1640 年に。
    6. トリプリケートでプレートのサンプルを適用し、4 ° C で一晩インキュベート
    7. 次の日は 6 回洗浄し、100 μ L ポリクローナルウサギ抗 p24 、RPMI 1640、10 %fbs、0.25 %bsa、2% に正常マウス血清 (NMS) の希釈 1: 1000 で 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    8. 6 回として上記洗浄し、, ヤギ抗うさぎペルオキシダーゼを 1 h の 37 ° C で 5% ヤギ血清、2 %nms、0.25 %bsa、0.01% 添加 RPMI 1640 年に igg 抗体希釈 1: 10,000 トゥイーン 20。
    9. 上記のように、プレートを洗浄し、TMB ペルオキシダーゼ基板 15 分間室温でインキュベートします。
    10. 1 N の HCL の 100 μ L の追加によって反作用を停止します。450 でサンプルの吸光度を測定 nm の吸光度を使用してプレート リーダー。
  2. 蛍光レポーター強度の測定
    1. FACS 法
      注: の細胞における GFP 信号減少の程度は、フローサイトメトリーを介して導入された細胞の平均蛍光強度を測定することによって正確に推定できます。FACS データ分析、プレゼンテーション、および解釈の最近のペーパー 28を参照してください。プロトコルは次のとおりです。
      1. 1x PBS で (10-1 10-5) からウイルスの準備の準備の 10 倍連続希釈を行います。
      2. ウェルあたり 2 mL の最終巻で 6 ウェル プレートの各ウェルに約 5 × 105 293 t 細胞を播きます。セルに各ウイルスの希釈の 10 μ L を追加し、48 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
      3. FACS 解析のためのセルを次のように収穫: 0.05% トリプシン-EDTA 溶液 200 μ L を追加し、5 分追加 2 mL 完全な DMEM メディアの 37 ° C でセルを孵化させなさいし、15 mL の円錐管にサンプルを収集します。
      4. 4 ° c、400 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、500 μ L の冷 1x PBS でペレットを再懸濁します。
      5. 固定、この懸濁液 4% ホルムアルデヒド溶液の等量を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。
      6. 固定セルをペレットし、1 mL の 1x PBS に再懸濁します。Ortinskiらで説明されているように FACS 装置を用いて GFP 発現を分析します。28は簡単に言えば、ウイルスの機能価を決定する次の数式を使用します。
        figure-protocol-2
        注: ここで Tg = カウント; GFP 陽性細胞数Tn = カウントされますセルの合計数。N = 導入; セルの合計数V = ボリューム (μ L) の伝達に使用されます。たとえば: 1 x 10 の6セルは、ウイルスの 10 μ L で導入された、2 x 10 の4セルならカウントと 5 x 10 の3機能価になる上記の方程式に基づく、GFP 陽性であった。
        figure-protocol-3
    2. GFP 陽性細胞を数える
      1. 感染症 (MOI) 伝達の使用の多様性を計算します。モアでより高い伝達効率を増やすことで、広い範囲のモア (1-10) をテストします。
      2. トランスフェクション効率を促進する前に約 3 - 4 ウェルあたり 10 の5セル × 6 ウェル プレートをシードします。セルに達すれば > 90% の confluency (24 時間) 以内に通常前もって決定されたモアで純化ウイルスを変換します。
      3. GFP 信号の変化、1-7 日の標準的な組織培養における 5% CO2と 37 ° C でプレートと定期的にモニター細胞を孵化させなさい。
      4. 蛍光顕微鏡を用いた GFP 陽性細胞数をカウント (計画 4 × 対物、0.1 N.A 40 倍) GFP フィルター セット (励起波長 470 nm、発光波長 525 nm)、装備ナイーブ (非導入された) 細胞を使用して人口を設定するにはGFP 否定と肯定的な細胞。
      5. 希釈倍率と次の数式を使用して、ボリュームの調整、最終価を推定します。
        figure-protocol-4
        注: ここでは、N = D GFP 陽性細胞数希釈係数、M = = 倍率 (通常 20 X) V = ウイルス伝達の使用のボリューム。たとえば、20 GFP 陽性細胞 (N) 10-4 (1:10, 000)、20 X の 10 μ L のサンプル (V) の希釈でカウントの倍率 (M) (D) になる (10) x (20) x (20 x 10 の4) の機能価 (100 *) = 4 × 108 TU/mL。
        (* 1 mL あたりを調整する)

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルのノックアウト効率の検証
CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトの効率を検証するのにモデルとして gfp 発現する 293 t 細胞を使用します。GFP 陽性細胞は、pLenti GFP (vBK201a) を 0.5 (図 3 b、「いいえウイルス」パネル) の MOI で HEK 293 t 細胞の伝達によって生成されました。SgRNA-GFP/Cas9 オール イン ワン ベクトル カセットは IDLV や ICLV の粒子にパッケージ化され、生産効率は p24 (上記を参照してくださいおよび図 3 a) elisa 法によって評価されました。Sp1 結合部位 (以下濃度) を含むベクトルの抗体価が 10 の範囲内に判明した10 TU/mL。我々 は、蛍光顕微鏡 (図 3...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

IDLVs は生体内遺伝子編集、配信プラットフォーム22の統合と比較してこれらのベクトルに関連する突然変異誘発のリスクの低いが主因となって、遺伝性疾患のコンテキストで特にのための最適な手段として浮上し始めています。,28.28私たちの研究室で開発された最近改良されたオール ・ イン ・ ワン IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産に関連付けられているプロトコルの詳細を現在原稿を目指しました。

既存のプラットフォームへの変更
この方法では、1 x 1010 TU/mL (図 3 a) の範囲で IDLV-CRISPR/Cas9 と ICLV-CRISPR/Cas9 価でベクトルを生成することができました。生産効率のこの拡張は、オール イン ワン CRISPR/Cas9 ベクトル カセットに Sp1 ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

USC-499-P を特許 (1175) がこの原稿で説明する作業に関連してサウスカロライナ大学によって提出されました。

謝辞

デューク大学医学部、基礎科学, デューク大学の学部長のオフィス、神経生物学部に感謝したいと思います。私たちも原稿のコメントのデューク ウイルス ベクター コアのメンバーに感謝します。プラスミド pLenti CRISPRv2 は、張鋒 (ブロード研究所) からの贈り物だった。プラスミド psPAX2 を含む LV 包装システム、VSV G、pMD2.G、pRSV Rev はだったディディエ ・ Trono (スイス連邦工科大学、スイス連邦共和国) からの優しい贈り物です。この仕事のための財政支援は、大学のサウスカロライナの医学によって提供された RDF18080 E202 (B.K) を付与します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
Optima XPN-80超遠心分離機ベックマン・コールターA99839
アレグラ 25R 卓上遠心分離機ベックマン・コールター369434
xMark マイクロプレート 吸光度プレートリーダーバイオ・ラッド1681150
BD FACSベクトン・ディキンソン338960
倒立蛍光顕微鏡ライカDM IRB2
0.45-μm フィルターユニット、500mLコーニング430773
円錐底部超遠心チューブシートンサイエンティフィック5067
コニカルチューブアダプターシートンサイエンティフィックPN 4230
SW32Ti スイングバケットローターベックマンコールター369650
15mL コニカル遠心チューブコーニング430791
50mL コニカル遠心分離管Corning430291
高結合性96ウェルプレートCorning3366
150 mm TC処理細胞培養ディッシュ、20 mmグリッド付きCorning353025
100mm TC処理培養ディッシュCorning430167
0.22 μM フィルターユニット、1LCorning430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
組織培養ピペット、5 mLCorning4487
組織培養ピペット、10 mLCorning4488
組織培養ピペット、25 mLCorning4489
血球計算計、カバースリップ付きCole-ParmerUX-79001-00
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養試薬
ヒト胚性腎臓293T(HEK 293T)細胞ATCCCRL-3216
293FT細胞サーモフィッシャーサイエンティフィックR70007
DMEM、高グルコース培地Gibco11965
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
抗生物質-抗真菌溶液、100XSigma AldrichA5955-100ML
ピルビン酸ナトリウムSigma AldrichS8636-100ML
非必須アミノ酸 (NEAA)HycloneSH30087.04
RPMI 1640 培地サーモフィッシャーサイエンティフィック11875-085
GlutaMAXサーモフィッシャーサイエンティフィック35050061
トリプシン-EDTA 0.05%Gibco25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)Sigma AldrichB9879 - BES
ゼラチンSigma AldrichG1800-100G
名称企業名カタログ番号コメント
p24ELISA試薬
モノクローナル抗p24抗体NIH AIDS研究および参照試薬プログラム3537
HIV-1規格NIH エイズ研究および参照試薬プログラムSP968F
ポリクローナルウサギ 抗p24抗体NIHエイズ研究および参照試薬プログラムSP451T
ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ IgGシグマ アルドリッチ12-348作業濃度 1:1500
正常なマウス血清、滅菌済み、500mLEquitech-BioSM30-0500
ヤギ血清、滅菌、10mLSigmaG9023使用濃度 1:1000
TMB ペルオキシダーゼ基質KPL5120-0076使用濃度 1:10,000
名前会社カタログ番号コメント
Plasmids
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
pRSV-RevAddgene12253
lentiCRISPR v2Addgene52961
NameCompanyカタログ番号コメント
Restriction酵素
BsrGIニューイングランドバイオラボR0575S
BsmBIニューイングランドバイオラボR0580S
EcoRVニューイングランドバイオラボR0195S
KpnIニューイングランドBiolabsR0142S
PacIニューイングランドバイオラボR0547S
SphIニューイングランドバイオラボR0182S

参考文献

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146(2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987(2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968(2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27(2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CRISPR Cas9 p24 ELISA HEK 293T
細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。