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方法論記事

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

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DOI:

10.3791/56921

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2018年2月15日

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1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。

要約

人間の小さい腸 enteroids 陰窩から派生するため幹細胞ニッチで栽培されたすべての上皮細胞の種類が含まれています。人間 enteroid体外培養系を確立する能力がモデル腸病態に関与する特定の細胞反応を研究することが重要。近年、マウスとヒトから enteroids が培養され、継代とバンク離れていくつかの所で将来使用するため世界中。この enteroid プラットフォームは、様々 な治療法や薬の効果と異なる種類の細胞、腸内にどのような効果を発揮テストに使用することができます。ここでは、主な幹細胞由来の小さい腸 enteroids を確立するためのプロトコルが新生児マウスから派生し、未熟児人間の腸を提供します。また、この enteroid の培養システムは、種特異的な母乳の効果をテストする利用されました。変更された人間の胸ポンプを使用して効率的に取得できますマウス母乳と発現マウスの牛乳は、さらに研究実験のため使用できます。我々 は今発現マウス、人間での効果を発揮し、新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から派生したドナーの成長および enteroids の増殖に母乳。

概要

壊死性腸炎 (NEC) は 29 週間妊娠1,2,3の前に生まれたほぼ 10 の 1 乳児に影響を与える、未熟児における消化管疾患による死亡の主要な原因です。NEC の進行状況、生存率はわずか 10 〜 304、5、最も深刻なフォームに児の半分。アメリカ合衆国で推定 20 億米ドル/年 NEC6、7児を扱う費やされているまだ生存率も療法は過去の 30 年にわたって変わった。NEC の病因と腸管によって特徴付けられる、悪化に導くシグナリングパス粘膜治癒8,9,10,11, しかし、障害のあります。炎症反応と逆に炎症メカニズムの不完全な理解ままです。

人間の母乳の管理は、未熟児の NEC に対してのみ保護の戦略であると発見されています。我々 は以前、母乳は、上皮成長因子受容体 (EGFR) 経路11をシグナル伝達を介して腸上皮における自然免疫受容体 toll 様受容体 4 (TLR4) の阻害により NEC 開発から保護することを示しています。実験の NEC 式に母乳の補充弱毒 NEC 上皮細胞のアポトーシスの抑制・表皮の成長に依存した方法で上皮細胞増殖修復するように見られる炎症性応答因子 (EGF) と EGFR11。別の研究で硝酸、母乳の別のコンポーネント、粉ミルク、硝酸態窒素が不足するいるとで NEC の頻度の増加に貢献するかもしれないと比較して腸の血流を調節することによりその保護、自然に貢献することが示されました。式供給幼児12,13。母乳オリゴ糖、L-アルギニン、グルタミン、ラクトフェリン14,15,16,などの NEC に対する保護に関与することが示されている母乳に存在その他化合物17,18,19。母乳のこれらの有利な要素、NEC の予防での使用の必要性を明らかにするが、また経路と細胞効果母乳は NEC に対して保護を仲介する方法に関与するシグナル伝達メカニズムを調査する重要性を強調.

マウスによって電気人間の胸ポンプ11,12 を使用して麻酔下ダムから母乳を抽出できます小説、使いやすい手法を開発 NEC のマウスモデルで母乳の保護特性の研究をする順番.マウス母乳を取得この戦略は有利、ない人間の胸ポンプは、容易に利用され、母乳の調達における効率的なだけでなくこの方法で種特異的な胸ミルク解析できるため。その結果、我々 と表現された人間の母乳のマウス母乳の効果を比較することができますと同様、種特異的なモデルにおけるミルク銀行から人間のドナー ミルクを低温殺菌します。この手法は、NEC 防止に向けての貢献に関連して乳房乳成分の研究のためことができます。他の研究者は胸ミルクの抽出方法を開発している、しかし、これらのテクニックはマニュアルとは通常 1 つ以上研究室メンバー20,21,22が必要があります。ここでマウスから牛乳を収集する人間の電気胸ポンプを変更することで利用できる簡単なテクニックが表示されます。この手法は、他の種にも適用できます。

NEC に関わるシグナル伝達経路を十分に調査、モデル システムは病気プロセスに影響を受ける知られている異なった細胞のタイプをすべて評価する必要があります。ここでは、我々 は 1 つを話し合うようなモデル システム - enteroids - とマウスおよび人間の小腸からの設立。ひと腸内 enteroids (HIEs) は、消化管で行われる病態生理学的プロセスの研究を支援するための革新的な遺伝的に多様な前のヴィヴォ人体モデルを提供するので特に重要な約束を提供します。23. 幹細胞から生成される enteroids 誘導性多能性幹細胞からの文化を開発すると、人間の腸 Organoids (HIOs) とは異なり、Enteroids 長期培養されることが判明し、以降使用23、凍ることができます。分離腸陰窩の24。Enteroids 以下のメンテナンスを必要とする、することができます感染しているすぐに25日、腸陰窩より HIOs23より区別されるので簡単に設立することができます。したがって、HIEs ひと消化管上皮23の地域固有の組成と機能特性に開発できるので既存の手法に比べて多くの利点を提供しています。Enteroids の使用は地域固有の制限事項と使いやすさの遵守、腸の人体モデルが必要なとき非常に効果的な選択です。ここで主な幹細胞由来小さい腸 enteroids マウスおよび人間の未熟児からの分離との手法を示す.

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プロトコル

本研究のすべての動物のプロシージャは、ワシントン大学セントルイス機関動物ケアし使用委員会 (20160187 プロトコル) またはピッツバーグ大学機関動物のケアおよび使用委員会 (プロトコル 14103918) どちらかによって承認されました。24 週間以内の妊娠で胎児小腸ピッツバーグ大学解剖学的組織の調達ガイドラインに従って治験審査委員会承認 (プロトコル PRO14100537) の大学から得られました。ピッツバーグ健康科学組織バンクを正直なブローカー システム。デ識別母乳または低温殺菌ドナー母乳ピッツバーグ制度検討委員会の大学からの同意の放棄が得られました。

1. 地下室の分離と新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から Enteroids の確立

  1. メディアの準備
    メモ: メディアに準備するフード地下室分離前に、の日。
    1. 1.11 L 文化メディアを準備します。4.5 G/L グルコースと L-グルタミン ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1 L で始まるし、110 mL ウシ胎児血清 (FBS) (最終濃度 10%) 11 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) と 1.1 mL 滅菌インスリン (ファイナルを追加濃度 0.1%)。
    2. 500 mL の PBS 抗生物質の混合物を準備します。10 %500 mL 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) x で始まる FBS ゲンタマイシン (最終濃度 1%) 1 mL アムホテリシン B (最終濃度 0.2%) 5 mL を追加し、5 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%)。
    3. 30 mL のセル中断メディア #1 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。600 μ L 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を追加 (最終濃度 10 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。
    4. 30 mL のセル中断メディア #2 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。300 μ L 0.5 M の EDTA を追加 (最終濃度 5 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。
    5. 成長因子なし 50 mL 地下文化メディアを準備します。測定 33.4 mL 1 x 高度な DMEM/F-12 10 mL FBS (最終濃度 20%) を追加。
      1. 500 μ l 添加ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) 500 μ L-グルタミン (最終濃度 1%) 500 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%)、100 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)、2.5 μ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaneスルホン酸 (HEPES) (最終濃度 0.05 mM)、500 μ L 100 mM N-アセチルシステイン (最終濃度 1 mM) 500、N-2 のサプリメント、ビタミン A は、マイナス無血清サプリメント (例えばB-27) x 1 mL 50 と 500 μ L 1 mM 100 × 100 μ L Y-27632 x。
    6. 成長因子と 1 mL 地下文化メディアを準備します。まず 1 mL 成長因子なし地下文化メディアを準備します。2.5 μ L 40 μ g/mL Wnt3a を追加 (最終濃度 100 ng/mL)、1 μ L 100 μ g/mL 頭 (最終濃度 100 ng/mL)、2 μ L 250 μ g/ミリリットル R Spondin (最終濃度 500 ng/mL) と 0.5 μ L 100 μ g/mL EGF (最終濃度 50 ng/mL)。
  2. 地下室の分離
    1. 場所は基底膜抽出物を可溶化 (材料の表を参照してください) に開始する前に解凍の氷の上。
      注: 氷に保つ基底膜を重合します。
    2. 2 番目の「安楽死」の 2 つの方法で安楽死させるマウスをマウスの年齢の 14 日を超える機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに準拠して死を確保するため物理的なプロシージャをされています。
      注: マウスの年齢の下で 14 日斬首ははさみを使用して標準的な手順です。
    3. はさみやピンセットを使用して、皮膚や腹膜、腹部の全体の長さを介して、腹部の正中線を縦切開を作る。ハサミで盲腸を胃から小腸を切除し、鉗子で腸間膜を削除します。
      注: 2 週古い男性と女性 c57bl/6 j マウスの子犬、各計量 5.5 7 g、クリプト分離に使用されました。地下室の分離のため、任意の年齢やサイズのマウスを使用できます。
    4. 地下室の分離の新鮮な収穫の小腸を準備をするには、ストレート、腸の位置し、はさみを使用して全体の長さに沿って縦腸をカットします。
      注: マウスおよびヒトの腸、同様に準備することができます。
    5. 優しく鉗子を使用して PBS 抗生物質の混合物で満たされたシャーレで来たり、腸を揺することによって腸からきれいなスツール。
    6. セル中断メディア #1 の 30 mL を 50 mL の円錐管に追加します。管に直接 0.5 cm 長さの部分に腸をカットします。氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。
    7. 組織は、シェーカーにされますが、RNA、DNA または蛋白質の隔離に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 24 または 48 ウェル プレートを取得します。全体に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 8 よくチャンバー スライドを使用は、共焦点レーザー顕微鏡をマウントします。
    8. フードは、24 または 48 ウェル プレートの各ウェルの底に基底膜の 15 μ L を追加します。商工会議所のスライドを使用すると、各商工会議所の下に基底膜の 9 μ L を追加します。
      注: 必要な場合はプレートの大きさによると基底膜のボリュームを調整します。
    9. すぐにピペットの先端と基底膜を広げ基底膜は井戸の底に薄い層を形成します。重合する基底膜を許可する 30 分のためのインキュベーターで 37 ° C でプレートを配置します。
      注意: 基底膜が薄い層ではない場合、または基底膜に空気の泡が含まれている場合、陰窩は添付しません。
    10. シェーカーで 15 分後にティッシュを 100 μ m ストレーナー フィルターします。流れを破棄します。
    11. 新しい 50 mL の円錐管に 30 mL のセル中断メディア #2 を追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。
    12. 氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。
    13. シェーカーで 15 分は、100 μ m ストレーナー フィルター組織。収量は後の手順で低い場合に、このステップで流れを保ちます。
      注: チューブを介してすべてのフローは、氷の上に保たれなければなりません。
    14. 4.5 G/L グルコースと L-グルタミン 15 mL DMEM を新しい 50 mL の円錐管に追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。積極的に 100 μ m ストレーナー 10 s. フィルターのチューブを手で振るし、流れを収集します。この操作を繰り返して、流れに微粒子が含まれていません。
    15. フードは、マウス組織や人間の組織のための 100 μ m ストレーナー 70 μ m ストレーナーを使用して新しい 50 mL の円錐管に前の手順から流れをフィルターします。
      注: スタンバイでは、余分なストレーナーを持って、ストレーナーが破片で詰まらせるとゆっくりと注ぐ。
    16. ボンネットの氷バケットに直接設置し 4 ° C で 8 分の 200 x g でチューブを遠心します。ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを削除します。希望総額成長因子地下文化メディアなしでペレットを再懸濁します。
      注: 豊かな陰窩は、ペレットの '砂' 層です。250 μ L 成長因子なし地下文化メディアも必要です。
  3. Enteroids の確立
    1. 基底膜の上に直接クリプト メディア混合物をプレートします。
    2. 陰窩を分離処理が成功したことを確認するには顕微鏡で確認します。
      注: セルとセルのボールが望まれます。ウェルあたり約 100 の個々 の陰窩をめっき。
    3. 基底膜に付着する陰窩を許可する 3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
      注: この培養、培地下成長因子なしと。
    4. メディアと P-200 ピペットを使用してアタッチに失敗した余分な陰窩をゆっくり取り外します。
      注: は、添付の陰窩が外れとなって、基底膜に不可します。
    5. ゆっくりと各ウェルにクリプト文化メディアと成長因子の 250 μ L を追加します。
      注: 24-48 ウェル プレート、またはチャンバー スライド、地下文化メディアと成長因子の 250 μ L で十分です。
    6. メディアを交換、2 日ごとと新鮮な地下墓地文化メディアと成長因子治療を可能にする最適な添付ファイルと成長前 5 日間。

2. マウス胸ミルク コレクション

  1. その子犬搾乳前に 6 時間から産後 7 〜 12 日で c57bl/6 j 授乳中ダムを区切ります。
  2. 鼻の円錐形を介してイソフルランと授乳中のダムを麻酔し、0.15 IU を/kg 体重でオキシトシンの皮下注射を管理します。搾乳のための手順を実行する前に、3 分を待ちます。
  3. プロシージャを搾乳前に 70% のエタノールで乳頭をきれいにし乾燥させ。
  4. シリコン チューブ 5 mL 採取管にマウスの乳首に合うようにサイズ電気人間の胸ポンプを使用して、一度に 1 つの乳首からミルクを抽出します。
    メモ: 最適な乳房ポンプ速度と吸引用の 2 つの設定があります。それぞれの最小設定で起動し、ミルクが抽出されるまで、ゆっくりと両方を増加させることをお勧めします。理想的には、総収量になります 〜 500 μ L - マウス母乳授乳中ダムあたりの 1 mL。
  5. すぐに割り切れる母乳と-80 ° C でストア
    注: フリーズ/フリーズ解除を避けるためサイクル。
  6. ML 成長因子と地下墓地文化メディアあたりマウス母乳の 50 μ L/mL の 37 ° C で 24 時間、5 日目に enteroids を扱う

3. 全体 Enteroids の染色をマウントします。

  1. 試薬の調製
    1. 8 井戸あたり 16 mL の 1x PBS を準備します。
    2. 8 井戸あたり 1x PBS で 2 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。
    3. 準備 2 mL 0.1 %8 井戸あたり 1x PBS でトリトン X-100。
    4. 24 ml PBS トゥイーン (PBST は 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 井戸あたり。
    5. 準備 2 mL 10% 通常ロバ血清 (NDS) 0.1% の pbst; (10 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。
    6. 準備 4 mL 1% 0.1% の NDS pbst; (1 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。
  2. 1 日目の染色
    1. 治療を離れて吸い出しなさい、PBS の enteroids を洗ってください。追加の 250 μ L 4 %pfa ウェルあたり。4 ° C で 1-2 h を回転子に配置します。4% 除去ピペットと PFA。
    2. 250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。部屋の温度 (RT) で 10 分間の回転子に配置します。
      注: 必要な場合は 4 ° C で 1-2 日のプレートを保管することが可能です。
    3. 250 μ L/ウェル 0.1% トリトン X-100。ルート削除で 1 時間インキュベート 0.1% トリトン X-100 ピペットと。
    4. 250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。室温 15 分の回転子に配置します。
    5. 250 μ L/ウェルの 10% を追加 NDS/pbst;。ルート削除で 45 分間インキュベート 10 %nds/PBST ピペットと。
    6. 希薄化後 1 で 1/250 %nds/PBST 250 μ L/ウェル一次抗体を追加し、4 ° C で一晩インキュベート
      注: 最適な抗体の希釈は、製造元によって異なります。
  3. 2 日目の染色
    1. 少なくとも 5 倍の 250 μ L/ウェル pbst; 4-5 h を洗います。各洗浄の 4 ° C で回転子に配置します。
    2. 250 μ L/ウェル二次抗体、希薄化後の 1/1,000 の 1 %nds/pbst; を追加します。箔でプレートをラップし、4 ° C で一晩インキュベート
  4. 3 日目の染色
    1. 250 μ L/ウェル核染色 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) のための 15 分を追加します。
      注: は、暗闇の中のプレートを保持します。
    2. 6 回を 250 μ L/ウェル PBST に洗います。各洗浄の 4 ° C で 10 分間の回転子に配置します。
    3. メディアのマウントとマウント coverslip チャンバーをスライドさせます。
    4. 客観的共焦点顕微鏡 X 40 で画像を撮影し、ラスター グラフィックス エディターで同じようにレンダリング (材料の表を参照してください)。

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結果

我々 は人間の母乳を表現するかどうかを調べるしようと最初または低温殺菌ドナー母乳は小さい腸 enteroids に影響を与えた。確かに、人間の母乳ともらい母乳は新生児マウス (図 1 a) と未熟児人間派生 enteroids (図 1 b) の成長を増加しました。

以来、ヒトの母乳は、小さい腸 enteroids の成長を増加し、次に調べた母乳が未熟児人間 enteroids の増殖に影響を与えた場合。我々 は人間の母乳がコントロール (キ67、B 赤染色図 2 a-) と比較して未熟児人間 enteroids の増殖を増加を示します。重要なは、人間のドナー母乳に比べてコントロールに、低温殺菌された母乳 (...

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ディスカッション

腸上皮、腸の障壁を維持、病原体に対する防御を提供するために責任がある、いくつかの疾患の病因に破られることができる多くの細胞亜型で構成されます。動物モデルは、病気のいくつかのファセットを要約することができます中、マウスとヒトの小腸から派生した enteroids の前のヴィヴォモデルは様々 な治療法の効果をテストするためのプラットフォームを提供します。Enteroid モデルの意義は、文化し、素朴なまたは病気にかかった動物と既存の方法では利用できない人間から上皮細胞のサブタイプのすべてに小腸幹細胞を区別するために研究者をことができます。このモデル系は、エンテロ ウイルス25またはノロウイルス26他の中などのマウスに容易に変換可能でない可能性があります人間の病原体による感染症に使用できます。Enteroid モデルは、いくつかの利点と使用;ただし、メディアと enteroids の生存のために必要な特定の外因性成長因子に使われる試薬の整合性を確保する注意が必要があります。

...

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開示事項

著者が何を開示して利害をあります。

謝辞

MG は K08DK101608 と R03DK111473 の健康の国民の協会、3 月のダイム財団助成金第 5-FY17-79、子供の発見研究所のワシントン大学、セントルイス子供病院部からの補助金によってサポートされて医学、セントルイスのワシントン大学で小児科。当行は R01DK104946 でサポートされている (PI: シルバーマン)、子供の発見研究所、ワシントン大学、セントルイス子供の病院。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4.5 g/L グルコースと L-グルタミンロンザ12-604F
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco26140-079
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15140-122
Humulin N (Insulin)Eli Lilly And Company0002-8315
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
GentamicinGibco15750-060
Amphotericin BGibco15290-026
0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), pH 8.0Invitrogen15575-020
1x Advanced DMEM/F-12Invitrogen12634-028
200 mM L-GlutamineGibco25030-081
1 M N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸 (HEPES)Sigma-AldrichH3537
N-アセチルシステインSigma-AldrichA9165
100x N-2 SupplementGibco17502-048
50x B-27 Supplement Minus Vitamin AGibco08-0085SA
100x ROCK Inhibitor Y-27632, DihydrochlorideSigma-AldrichY0503
組換えマウス Wnt3a タンパク質R&D Systems1324-WN
Murine NogginPeproTech250-38
組換えマウス R-Spondin 1R&D Systems3474-RS
組換えマウス上皮成長因子 (EGF)PeproTech315-09
マトリゲル成長因子 還元型基底膜マトリックスコーニング356231
35 x 10 mm 細胞培養 ペトリ皿ッペンドルフ0030700112
24ウェル 細胞培養プレートエッペンドルフ0030722116
48ウェル細胞培養プレートEppendorf0030723112
8-Well Nunc Lab-Tek II チャンバースライドシステムThermo Scientific154534
50 mL コニカルチューブCorning352070
100 μM 滅菌セルストレーナーフィッシャーサイエンティフィック22-363-549
70 μM 滅菌セルストレーナーFisher Scientific22-363-548
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2Invitrogen20012-027
16% パラホルムアルデヒド (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Normal Donkey血清 (NDS)Sigma-AldrichD9663
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩 (DAPI)InvitrogenD1306
顕微鏡カバー ガラスフィッシャーサイエンティフィック12-544-D
共焦点顕微鏡 ライカ TCS SP8 XライカマイクロシステムズN/A
Photoshop CS6Adobe SystemsN/A
18 G1.5インチニードルベクトンディキンソン305196
イソフルランシグマアルドリッチ792632
オキシトシンシグマアルドリッチO3251
人間ダブル電動搾乳器ランシノー 044677530163
5mL丸底試験管コーニング352058
ラバーストッパーフレイサイエンティフィック560761
Ki67アブカムAB15580
ヒトMki67プライマーF:5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R:5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A
エ抗体

参考文献

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