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マウスの部分胆管結紮: ローカライズされた閉塞性胆汁うっ滞の制御モデル

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DOI：

10.3791/56930

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2018年3月28日

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1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

この記事について

サマリー

肝臓の傷害および齧歯動物の再生の手術モデルとして部分胆管結紮を紹介します。

要約

総胆管の完全な胆管結紮 (cBDL) は、齧歯動物、閉塞性胆汁うっ滞、肝内胆管の増殖を研究するための確立された手術方法です。ただし、長期的な実験は増加罹患率と死亡率につながることができます。選択マウス系統基礎疾患、単一動物の損失および費用を減らすことができます肝葉の結紮とも有意義な比較を可能です。ここで、説明部分胆管結紮 (pBDL) にのみ左肝内胆管を結紮は、マウスの左葉ですがない、残りの葉の胆管閉塞の原因します。同じ動物で同じ条件に服従するときに unligated の葉は、結紮葉に内部統制として役割を果たすため注意して顕微鏡手術と pBDL 実験が費用対効果をすることができます。CBDL とは異なり、別の偽手術群は必要ではありません。pBDL、胆汁うっ滞及び他の保有胆汁成分の全身影響とローカライズされた直接の比較に非常に役立ちます。pBDL は薬や細胞遊走に関連するメカニズムを調査する手法として用途に使用することができます。

概要

急性肝障害・肝部分切除や胆管結紮 (cBDL) などの修復手術のモデルは、肝再生と病理学1,2を研究する齧歯動物で何十年も使用されています。CBDL で (これは肝臓で生成されるすべての胆汁を排出) 胆管結紮は、肝硬変3に最終的な進行すると術後最初の 2 〜 3 週間で閉塞性胆汁うっ滞、炎症および線維化の結果します。胆管の増殖、分化転換、および居住者の肝前駆細胞の誘導 cBDL4、5の機能があります。CBDL は、再現可能な成果野生型マウスと正常な肝臓6,7,8でこれらの系統の特徴である閉塞性 cholangiopathy の特定のメカニズムを解明し、プロシージャは、肝疾患、高い罹患率と死亡率は時間の経過とともに胆道閉塞のため予想よりもより多くの動物を必要とするいくつかの遺伝子導入マウスモデルで技術的に厳しいことができます。この手法も長時間コース実験 cBDL のストレスをそれ以外の場合は許せないかもしれないトランスジェニック マウスの基になると肝疾患の勉強のために有益です。

pBDL は、いくつかのこれらの課題を克服するために合理的な選択肢を提供できます。野生型マウスの初期 pBDL 研究は、炎症9の演技のローカルおよび全身の仲介人を区別するために目指しています。PBDL、総胆管の上左右の肝胆汁管の主な胆道合流は慎重に、門で可視化し、ローカライズされた閉塞性胆汁うっ滞を生成するのみ、左肝内胆管を結紮します。pBDL では、cBDL にいくつかの利点を提供しています。PBDL、unligated の右葉は栄養状態や要因を循環など、同じ全身作用を受ける結紮の左葉の同じ牌内部統制として機能します。全身性炎症性メディエーターを調べたところ、大沢ら以下の線維化および unligated の葉の壊死が観察が、炎症細胞と変形の成長因子 β 式結紮葉9に増加します。

最近では、pBDL が保持されて胆汁10の肝実質の効果を研究する再定義されました。(Unligated「シャム」) 内部統制群と実験群の同じ動物を使用して、pBDL は効果的により費用対効果は実験ごとに必要な動物の数を半減します。マウスは、コース実験理想的な時間 (≥2 週) 結紮葉で達成することができますので、はるかに良い、pBDL の影響を容認します。最も重要なは、pBDL は閉塞性胆汁うっ滞の直接的な肝内効果を区別することができます、unligated コントロール葉に比べて、結紮葉の胆汁構成成分を保持します。全体的に、pBDL は肝臓でローカライズされた胆汁うっ滞の葉固有の効果を研究する魅力的な方法です。

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プロトコル

動物介護制度とピッツバーグ大学の利用委員会の倫理的なガイドラインに従ってすべてのプロシージャを行った。

1. 基本的なテクニックと一般的な手順

  1. オートクレーブ使用する前にすべての顕微鏡装置。
  2. 麻酔によりマウスを殺すことを避けるため、慎重にその呼吸パターンを確認します。
  3. 臓器や器官を損傷し、出血を引き起こしているを避けるために可能な限り少し腸をタップします。湿式の綿棒やガーゼで出血点を押してください。
  4. 臓器の穏やかな操作にウェット綿棒を使用します。2 つのサイズでウェット、非織ガーゼを使用、3.5 × 3.5 cm と 6.0 × 6.0 cm。 は全肝を撤回する小さいものを使用します。大きい 1 つを使用して、小規模および大規模な腸をラップします。

2. 術前準備

  1. 男性の c57/b6 マウス部分胆管結紮用 (体重が約 20 35 g) 時代の 8 〜 12 週間を使用します。
  2. 麻酔導入までマウス水や食料への無料アクセスを許可します。

3. 部分胆管結紮操作

  1. 1.5 から 2.0 パーセントのイソフルランと 1 L/分の酸素を混ぜた誘導の商工会議所に動物を置くことによってマウスを麻酔します。呼吸を観察することによって動物を注意深く監視します。動物の呼吸速度は 1 秒あたり 1 つの息をマウスがよく麻酔です。以来、前肢逃避反射はより急速に消え、逃避反射の完全な不在を確認する同様に後肢の足をピンチします。目は、角膜潰瘍を防ぐために眼科用潤滑剤と潤滑する必要があります。メモその鎮痛剤の投与は痛みの受容体の刺激を防ぐために手術前に与えることができます。
  2. シェイブ バリカン、腹壁、手術用顕微鏡下で手術のテーブルの上にマウスを置きます。テーブルにすべての手足をテープで固定します。イソフルラン吸入を全身麻酔下でマウスを維持するために使用します。
    1. イソフルラン気化器を調整し、誘導 2.0 3.0% イソフルランを使用します。
  3. 腹部壁の消毒滅菌綿棒を使用して、最初 0.3 0.5 mL ポビドン ヨードの局所的に適用は 70% のエタノールが続きます。動物は、滅菌ドレープで覆われるべきであります。
  4. はさみとアドソン鑷子を使用して恥骨に、剣から正中腹部切開を確認します。0.8 1.0 にイソフルランを減らす腹部切開をしたら、メンテナンスのため %。
  5. マイクロ リトラクターを使用して腹腔内を公開します。モスキート鉗子で、剣を押し、マウスの頭に向かって撤回します。ソフト粘土を使用して場所のモスキート鉗子を修正します。
  6. 温めた (37 ° C) の 1-2 の mL を植え付ける滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 腹部臓器が負傷を避けるために腹腔内に。濡れた綿棒で小腸を押し軽くマウスの頭に向かってそれらを撤回します。小腸、小腸 (図 1 a) を負傷を避けるために後腹膜間靭帯をカットします。
  7. ウェット、不織布-ガーゼ スポンジでの小規模および大規模な腸をラップします。腹腔内の尾側に配置します。滅菌ガーゼに包まれた腸は、汚染を避けるため無菌ドレープ フィールドを配置できます。
  8. 優しく肝門部、肝十二指腸靭帯 (図 1 b) を公開する小型湿式不織布-ガーゼ スポンジを使用して、剣に向かって全体の肝臓を撤回します。
  9. 肝門部の解剖を確認を確認します。総胆管は門脈の腹側にあります。肝門部の主な胆道合流地点に流出する右および左の肝の胆管の位置を確認します。
  10. 左葉を排水左胆管を識別し、縫合針 (図 2 a) の鈍側を使用して 10-0 ナイロン縫合糸とそれを取り囲みます。避けるために門脈、肝動脈、肝表面を負傷します。
  11. 10-0 ナイロン左胆管を結紮します。(図 2 b)。
  12. 湿式の綿棒を使用して、操作の前と同じ位置で小腸・大腸を配置します。
  13. 腸管の捻転と腹腔内出血がないことを確認し、筋肉と 4-0 vicryl の二層で皮膚を閉じます。皮膚縫合用編組縫合 (Vicryl) が使用されたが、感染の可能性を減らすためにモノフィラメントを優先します。
    注: は、恥骨に剣から継続的な縫合糸で筋膜を閉じて剣に恥骨から継続的な縫合で皮膚を閉じます。
  14. 切開部を閉じる後麻酔を停止します。

4. 術後の治療とフォロー アップ

  1. ちょうど手術後がマウスの背側の皮をつまむし、注入 Buprenex (0.1 mg/kg) とセファゾリン (100 mg/kg 皮下、それぞれ Buprenex 注入による 12 時間間隔 3 日、セファゾリンのすべての 24 h 3 日間続いた11,12 ,13。メモその鎮痛剤の投与は痛みの受容体の刺激を防ぐために手術前に与えることができます。セファゾリンと他の周術期の抗生物質だけ移植実験で使われたもののような免疫抑制動物に必要なです。
    注: 場合手術を正常に実行すると、マウス通常回復 30 分以内、マウスの活動は術前の状態とほぼ同じになります。
  2. 毎日苦痛の兆候のマウスを確認してください。
    1. PBDL 後肝臓と (すなわち7、14、21 日) 定義された時点で他の組織サンプルを調達する全身麻酔下頚部転位によってマウスを犠牲に。

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結果

この典型的な実験のため pBDL は、α 1 アンチトリプシン (A1AT) 欠乏は、人間の肝臓病を要約する帳票のピッツ ・ トランスジェニック マウスで行われました。PiZ マウス染色遺伝子の DNA の突然変異人間 A1AT 遺伝子、プロモーター、イントロンと上流と下流地域14の側面の ~ 2 kilobases のコーディング領域を含む複数のゲノム断片から成る 15。通常 A1AT 肝臓で生成分泌血清蛋白質であります。A1AT の変異形は、肝臓毒性ストレスを原因に自発的に蓄積される不溶性タンパク質凝集体を生成します。実験利用 3 ヶ雄 PiZ マウス蛋白質の集合のピーク16時、この病気の最も深刻な表現型を表現します。

肝の生化学は、pBDL と cBDL のピッツ ・ マウス (

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ディスカッション

CBDL は閉塞性胆汁うっ滞のため最も一般的な実験的手法が、齧歯動物の複数の課題が発生することができます。術後日のエンドポイントを達成するために必要な数、に応じて、動物は重要な罹患率と時間が進むにつれて死亡率を体験できます。肝臓病の異常肝実質とベースラインで関数を示すいくつかのトランスジェニック マウス モデルを操作するとき、組織の損傷および胆管壊死の程度がさらに悪化します。CBDL と比較して、pBDL のレポートが限られているが、否定的な結果や動物の損失を軽減する選択実験の代替としてこの技術を適用することができます。

PBDL 法の変化も報告されています。ハインリッヒらのメソッド、外部湾曲した針を胆管、総胆管周辺針17合字の順に隣接して配置します。針が腹壁閉鎖、17胆管の狭窄ルーメン (すなわち、小計閉塞) を通じて限られた胆汁の流れの結果の前に削除されます。この中に、胆嚢は胆嚢炎17を防ぐためにも削...

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開示事項

著者の開示があります。

謝辞

カーン博士は、NIH/NICHD K12HD052892、アルファ 1 の基礎、ヒルマン財団およびピッツバーグ肝臓研究センターから助成を認めています。博士 Michalopoulos は、NIH/NIDDK P01DK096990 から助成を認めています。アン ・ オアの優秀で、寛大な技術的な支援お願い申し上げます。マイクロサージャリー移植または齧歯動物ラボへのアクセスを提供するためも博士デビッド A. ゲラーに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
顕微鏡-ライカワイルドM650、6–40倍;倍率ライカ マイクロシステムズn/a
Tec 3 イソフルラン 漏斗充填気化器一般麻酔サービスn/a
スティーブンス 腱切開はさみ正確な 外科 &サイエンティフィック・インスツルメンツ・コーポレーションASSI.9193
アドソン鉗子ファインサイエンスツール11006-12
モスキート クラシック デリケート止血鉗子コッドマン30-4472
マイクロリトラクターマードック;Roboz手術器具RS-6550
不織布ガーゼスポンジフィッシャーバンド870-PC-DBL
ピューリタン6 "小さな綿棒、木製ハンドル付きピューリタン メディカル プロダクツカンパニー 868-WCS
デュモン SS 鉗子 - 標準チップ/ストレート/イノックス/13.5cmファイン サイエンス ツール11203-23
デュモン SS 鉗子 - 標準チップ/角度付き 45>/イノックス/13.5cmファイン サイエンス ツール11203-25
バンナス スプリング ハサミ - 3mm カッティングエッジファイン サイエンス ツール15000-00
マイクロニードルホルダーAesculap Surgical InstrumentsFD231R
Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 & micro;メートル、TAPポイントAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5 mlシリンジBD309646 Falcon
培養皿、60 × 15 mmCorning353002
Isoflurane、米国薬局方(USP)吸入用液体、250 mlPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
ブプレネックス注射剤(塩酸ブプレノルフィン)レキットベンキーザーファーマシューティカルズNDC 12496-0757-1
注射用セファゾリン、USPAPPファーマシューティカルズNDC 63323-238-61
PVPスクラブ溶液(ポビドン–ヨウ素 7.5%)MedlineNDC 12496-0757-1
70% エタノールDecon Labs2716
カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水LONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
HematolxylinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
ホルマリンフィッシャーSF100-20
組織

参考文献

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