マウスは、感染症や消化管微生物によって引き起こされる病気を研究する非常に貴重な生体内でモデルを表します。ここで、細菌の植民地化およびピロリ菌のマウス ・ モデルにおける病理組織学的変化を研究するために使用するメソッドを説明-関連の病気。
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この記事について
サマリー
要約
ピロリ菌は、世界の人口の半分に存在し人間の死亡率と罹患率の重要な原因は、胃の病原体です。胃ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のいくつかのマウス モデルというピロリ菌の人間のホストの胃を植民地化し、病を引き起こす分子・細胞メカニズムの研究開発されています。ここに、プロトコルについて述べる: 1) 胃内強制経口投与; を介してマウスの生体内感染の細菌懸濁液を準備2) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、生菌数計測; マウス胃組織で細菌の植民地化のレベルを決定します。3) 組織学による病理学的変化を評価します。Helicobact小胞体に感染するのにマウス、特定病原体フリー (SPF) 動物は最初に懸濁液 (≥105コロニー形成単位、CFUs を含む) のいずれかのピロリ菌の系統のマウス-植民地化と再接種または動物から他胃のヘリコバクター属などピロリ felis 。適切な時点後感染症で胃は切除、幽門部と体の領域を構成する各 2 等しい組織片に大の解剖。他は組織学的処理に服従する中、これらのフラグメントの 1 つ、生菌数計測または DNA の抽出のいずれかの使用されます。細菌の植民地化および胃の病理組織学的変化は、胃組織切片を腺リンパ星空、ギムザまたはヘマトキシリンとエオシン (H & E) 汚れに応じて染色で日常的に評価が。免疫組織化学またはマウス胃組織切片を蛍光抗体法によって追加の免疫学的解析を実施もことがあります。下記プロトコルを人間関連のh. ピロリ菌に似た胃の病態のマウスの評価を有効にする設計疾患、炎症、腺萎縮とリンパ濾胞形成を含みます。接種材料の準備および胃内強制経口投与プロトコルもサルモネラ菌やシトロバクター属齧歯類などのマウスを植民地化他の腸溶性ひと病原体の病因を研究に適応させること。
概要
ピロリ菌、螺旋状で、グラム陰性菌、人間胃病原体すべての人口で現在 801順と推定される開発途上国の感染率で、世界中。ほとんどピロリの感染した人はいくつかのより重篤な疾患、胃癌2消化性潰瘍に至る開発、無症候性であります。H. ピロリ菌の上皮細胞 (GECs) の悪性変化またはリンパ節外胃、胃腺癌の結果または粘膜関連リンパ組織の形成によって関連付けられている癌の特徴広くティッシュ (モルト) リンパ腫、それぞれ。H. ピロリ菌は様々 な病原性因子とその付着、成長、このニッチ市場で代謝を促進する機構が存在するため胃の過酷な生態学的ニッチ市場で生き残るために適応高。特に、ピロリ菌の病原性菌株所有 40 kb cag病原性アイランド (cagパイ) タイプ 4 分泌システム (T4SS)3,4 の生産のために必要な約 30 遺伝子をエンコードします。.cagPAI 陽性ピロリ菌は胃癌の5の重要な前駆体として関与しているホストの慢性的な炎症のより高いレベルの誘導に関連付けられています。
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プロトコル
1 成長および細菌の接種の準備
- H. ピロリ菌またはH. felis15 -80 ° C とから成る馬血液寒天培地 (HBA) プレートのサブカルチャーからのグリセロールを解凍: 血液寒天培地ベース 2 号 (材料の表を参照)。変更された「スキロー抗生物質選択サプリメント」(バンコマイシン 10 G/ml; から成るポリミキシン B、25 ng/mL; トリメトプリム、5 μ G/ml; 2.5 μ g/mL アムホテリシン B);5-10% (v/v) 馬血15,16。細菌成長 2.5 または 3.5 L で 524 微好気条件下でよく適切なガス パック (材料の表を参照してください)、37 ° C でを含む嫌気性の瓶
注: H. felisインキュベーションの少なくとも 2 日間は一般に必要なに対し、これらの条件下で栽培したピロリ菌は培養の 1 – 1.5 日後継する必要があります。適切なカルチャおよびストレージ メディアに記載されている詳細以前15。 - 初期から半ば対数段階文化によるマウス感染の細菌により接種を準備し....
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結果
このプロトコルでは、胃内感染ピロリまたはH. felisマウス マウス モデル (図 1) を達成するために経口技術について説明します。次の安楽死、胃が削除の重量を量った、前庭、体と胃組織 (図 2) の非腺領域で構成される 2 値の半分に分かれています。非腺領域は、すべての解析を実行する前に削除されます。
H. ピロリ菌の生菌数計測を行って動物の成功植民地化を確認して通常-胃のホモジネートを感染し、その後 HBA プレート (図 3) の個々 のコロニーを列挙します。また、 H. felis H. felisのh. ピロリ菌の ureB遺伝子 (図 4) 325 bp の領域を特定、検証されたプライマーを使用すると感染症の確認に PCR .......
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ディスカッション
このプロトコルでは、ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のため生体内でマウス モデルの使用について説明します。プロシージャの重要なステップは、: 1) 実行可能なおよび運動性細菌を含むヘリコバクター ・ ピロリ接種の準備2) 胃内強制経口投与; 経由のマウスへの細菌の適切な数の配信3) コロニー カウントおよび/または pcr 法による細菌感染症の検出・ 4) の病理組織学的評価を有効にするために胃組織の処理感染の胃。トラブルシューティングおよび技術的な考慮事項変更のためのそれ以上の提案を以下に示します。
馬血液を添加した血液寒天培地ベース第 2 を使用してピロリ菌を成長させる方法は、当研究室でよく確立されています。ただし、代替寒天拠点などブルセラ寒天とコロンビア血液寒天培地に使用される22にすることができます。洗剤は無料ですだけ滅菌ガラスを使用して成長培地を準備することを確認することが重要です。さらに、最適な成長を得るためには、ピロリ菌は、残留水分.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
著者は、さん A. ・ デ ・ パオリとさんジョージー Wray マッキャンにテクニカル サポートに感謝したいと思います。著者は、モナッシュ組織プラットフォーム、解剖学と発生生物学、モナッシュ大学の技術支援施設の利用を認めます。研究室は、RLF (APP1079930、APP1107930) に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの資金によってサポートされます。RLF は NHMRC (APP1079904) から上級研究員によってサポートされます。モナッシュ大学院奨学金、KD と MC を両方ともサポートします。KD もサポートされてセンター自然免疫とハドソン研究所医学研究の感染性疾患の MC に医学部、看護、保健、モナシュ大学からの国際大学院奨学金があるとき。医学研究のハドソン研究所での研究は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムによってサポートされます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Bacteriological Reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | 滅菌前に脱イオン水に溶解 |
| プレミアム除細動馬の血液 | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | 滅菌前に脱イオン水に溶解 |
| CampyGen ガスパック | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| ホルマリン、中性緩衝液、10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| 無水アルコール、100% 変性 | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| イソプロパノール(2-プロパノール) | メルク | 100995 | |
| キシレン(硫黄フリー) | ChemSupply | XT003-20L | |
| メイヤーズヘマトキシリン | 琥珀色科学 | MH-1L | フィルター使用前 |
| エオシン、水性ステイン | 琥珀色科学 | EOCA-1L | フィルター使用前 |
| ギムサステイン、修正 | シグマアルドリッチ | WG80-2.5L | 使用前に希釈してください(20%Giemsa、80%脱イオン水) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX封入剤 | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | この研究で使用した ureBプライマーのアニーリング温度は61°Cです。C | |
| GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ | Promega | M8291 | キットには、10x PCRバッファーと塩化マグネシウム |
| dNTPが含まれています | バイオライン | BIO-39028 | 使用前に滅菌ヌクレアーゼフリー水で10 mMに希釈 |
| 分子グレードアガロース | バイオライン | BIO-41025 | |
| 炭酸水素 | ユニバール(Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| マグネシウム硫酸塩七水和物 | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| バンコマイシン | Sigma Aldrich | V2002-1G | 脱イオン水に溶解 |
| ポリミキシン B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | 脱イオン水に溶解 |
| トリメトプリム (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | 100%(絶対)エタノールに溶解 |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | 脱イオン水に溶解 |
| バシトラシン Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | 脱イオン水に溶解 |
| ナラジクス酸 | Sigma Aldrich | N8878 | 脱イオン水に溶解 |
| <ストロング>その他の試薬 | |||
| メトキシフルラン(ペントロングス) | メディカル・デベロップメント・インターナショナル | 該当なし | |
| パラフィンワックス | パラプラスプラス、ライカバイオシステムズ | 39601006 | |
| <ストロング>機器およびプラスチック製品 | |||
| オキソイド 嫌気性ジャー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | HP0011/HP0031 | |
| COPAN パスツールピペット | インターパスサービス | 200CS01 | |
| エッペンドルフ 5810R 遠心分離 | 2,200rpmで10分間、4°Cで遠心分離し、細菌ペレットを回収します。C | ||
| 23 g 精密グライドニードル | BD バイオサイエンス | 301805 | |
| パラフィルム M | ベミス、VWR | PM996 | |
| ポルテックス ファインボア ポリエチレンチューブ | スミスメディカル | 800/100/200 | |
| プラスチック栄養カテーテル | インステック 研究所 | FTP20-30 | |
| 1 mL ツベルクリン ルアー スリップ 使い捨て注射器 | BD Bioscience | 302100 | |
| エッペンドルフ 1.2 - 2 mL チューブ用 | シグマ アルドリッチ | Z317314 | 胃の均質化に使用されるオートクレーブ可能なポリプロピレン乳棒 |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | マウス胃組織用のプリセット gentleMACS プログラムを使用します |
| M チューブ (オレンジキャップ) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| 滅菌プラスチックループ | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | 該当 | |
| Tissue-Tek ベースモールドシステム, ベースモールド 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
参考文献
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori su....
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再版と許可
