方法論記事

鼻膜上皮電位差 (NPD) の標準化された測定

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DOI:

10.3791/57006

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2018年9月13日

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1Department of Medicine and the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pulmonology and Tuberculosis, University Medical Center Utrecht, 3Center for Experimental Medicine, Queens University, Northern Ireland, 4Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, 5Centro Fibrosi Cistica, Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata, 6Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques and Center de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose, Hôpital Necker Enfants Malades, 7INSERM U 1151, Institut Necker Enfants Malades

この記事について

サマリー

ここでは、鼻の電位差 (NPD) を測定するための標準化されたプロトコルを提案する.嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 関数に評価されます電圧の変化によって鼻上皮イオン チャネル活動を変更するソリューションのスパーフュー ジョン法を提供する、結果を測る。

要約

鼻電位差 (NPD) の標準化された測定について述べる。この手法では、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 機能によって監視される電圧の変化鼻上皮イオン チャンネルを変更するソリューションのスパーフュー ジョン法後活動。これは、下鼻甲介に接触してカテーテルを利用した鼻孔で皮下のコンパートメントと気道上皮の間の電位差の測定に有効です。

テストにより、100 μ M アミロライド、リンゲル液の+の Na 再吸収の阻害剤の灌流後安定した基準電圧・連続純電圧変化の測定ドライブ塩化分泌アミロライドやアミロライド環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を刺激するために無料の塩化物溶液中 10 μ M イソプロテレノールを含む塩化無料ソリューション-CFTR に依存して塩化コンダクタンス関連。

このテクニック呼吸上皮、ENaC、CFTR の気道表面の液体の水和を確立する 2 つの主要なコンポーネントの電気生理学的特性を発揮するという利点があります。したがって、フェーズ 2 と嚢胞性線維症 (CF) 肺疾患の治療のため「CFTR と ENaC 活動対象とするエージェントの概念試験証明のため、有用な研究ツールです。また、遺伝テストと、汗があいまいな場合に「CFTR 機能不全を確立するキーのフォロー アップのプロシージャです。汗の塩とは異なりテストは比較的より時間がかかり、高価です。また、オペレーターのトレーニングと専門知識テストを効果的に行うことが必要です。間と subject 内変動は、この手法で若者や非協力的な科目を中心に報告されています。この問題を支援するために最新の検証済みのアルゴリズムによって解釈が改善されました。

概要

このメソッドの全体的な目標は、1体内の上皮細胞のイオン輸送を調査することを目的と鼻潜在的な違い (NPD) を測定することです。この手法には、ナトリウム (Na+) と塩化 (Cl-) 輸送の測定が可能します。NPD は、1980 年代後半から研究用ツールとして使用されているし、嚢胞性線維症財団 (CFF) コンセンサス ステートメント2し、2017 年には嚢胞性線維症財団 (CFF) コンセンサス診断ガイドラインの診断手順として 1998 年に受け入れられました。3。 確かに、CF の原因である生物の「CFTR 機能不全は-の Cl 分泌の頂側膜と欠陥増加 Na+の吸収によって立証されます。この機能のテストは、遺伝学、中間中間汗テスト結果3症例での決定的なときに追加の診断ツールの利点を提供します。この情報は、現在測定腸のバイオプシー (ICM) によって得られる可能性があります、ICM は、しかし、世界的にいくつかの利用可能なセンターだけ、ニーズさらなる標準化。NPD は約 60 のグローバル センターでより利用可能で、さらに、病気の主な場所は、気道上皮を対象します。

CFTR の活性に提供する情報を与え、また親しまれて CFTR 蛋白質の機能障害を評価するための概念実証研究で変調療法4,5,6,7、 8。確かに、CFTR 遺伝子 mRNA/編集、CFTR 増強剤補正療法と研究からのデータは、Cl-の大幅な変更を強調表示し、Na+療法6,9輸送し NPD ができることを確認します。臨床試験における応答エンドポイントです。我々 は短期的に患者の臨床状態の微妙な変化を検出することが敏感な臨床的エンドポイントを欠いているとこの前臨床バイオ マーカーは非常に報知的にかもしれない。CFTR 変調療法の分野はすぐに拡大し、緊急テスト生体内で迅速に大規模なフェーズ 3 試験10に行く前に活性化合物を解読することができる必要があります。

テクニックの生理学的な理論的根拠は、鼻孔に気道上皮と皮下のコンパートメント間の電位差の測定に基づいています。イオン チャネル活動が最大ベースラインが安定の潜在的な差 (PD)、ブロック、ENaC 関連の Na+吸収後その変化の測定と異なる頂 Cl-トランスポーターを介して-の Cl 分泌を運転の検討します。CFTR を含みます。CFTR 機能不全は cAMP 依存経路を通じて Cl-分泌刺激時の電位差で最小限の変更で表示され増加 ENaC 介する Na+吸収より否定的なベースラインの電位差によって検出されました。アミロライドに強化された応答。通常の PD と CF の機構の基礎は、図 1のとおりです。

電気化学勾配図、CFTR/ENaC活性、上皮輸送、CF病理解析
図 1: イオン チャネルの利用状況の概要の図。呼吸上皮のデモンストレーションの活動バランス ENaC と健常者における CFTR の活性と CFTR の活動の結果としての損失を (B) (A) イオン介する上皮型ナトリウム輸送が増加し、CFTR 依存して塩化物を減少トランスポート。ENaC: 上皮性ナトリウム チャネル Na+: ナトリウム、CFTR: 嚢胞性線維症膜貫通レギュレータ、CL-: 塩化物、mV: PD (ミリボルト): 潜在的な違い、分: 分/sこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ただし、このテストは両方繰り返し測定同じ遺伝子型を持つ患者と同一患者内での変動の程度を示します。これは、変調器治療後変更の解釈を容易にするために非常に重要です。さらに、我々 はまだ CF と健常者を区別検証済みしきい値を欠いています。これは臨床施設の可用性と、技法の違いにより部分的にあるかもしれない。したがって、テストの標準化に向けた国際努力は進行中です。米国の CFF TDN (嚢胞性線維症財団治療開発ネットワーク) および ECF CTN (欧州嚢胞性線維症学会臨床試験ネットワーク) には、多施設共同研究臨床試験 NPD 標準操作手順 (SOP) の使用のため。CTN、TDN でこの最近の共同作業をもたらした結合された、国際 SOP、CTN と TDN の専門知識を結集 (2014)11。CF 診断または概念実証試験の調査官主導の NPD を採用するプロトコルおよび試験技術について述べる。技術を実装する各センターはその機関の人間研究の倫理委員会承認のためにアプリケーションの責任です。

神経科学図;シリンジポンプ、電極、コンピューターインターフェース。神経電位測定。
図 2: 全体の模式図は、NPD のセットアップをお勧めします。シーケンシャル灌流ポンプおよび 4 ストップ コック シリーズ設定を含む推奨されるセットアップが表示されることに注意してください。SOP には特定の接続とコンポーネントの例を示します。(図ソロモン、G.M.胸、 201013から許可を得て変更)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

一般的な実験の流れは図 2NPD は両方電極と高インピー ダンスに接続して皮下の空間内に配置上皮表面およびリファレンス橋に配置されている探索ブリッジ間を計測という「します。電圧計。

これは 2 種類のシステムによって保証: 2 許容参照電極のセットアップがある: (i) バランス銀/塩化銀電極、心電図 (ECG) クリームいっぱい橋わずかな摩耗によって皮下組織に接続または (ii) 塩化第一水銀の飽和半電池と、寒天はいっぱい皮下導入 22-24 ゲージ針です。鼻粘膜への接触は、ダブル ルーメン カテーテルで有効です。1 ルーメンは寒天培地または ECG クリームで満たされた、測定電極に接続されている、その他により、さまざまなソリューションの鼻粘膜に灌流。

探索のチューブの先端は、呼吸器粘膜下鼻甲介 (図 3) の下に配置されます。

カテーテル留置プロセス;下鼻甲介と中鼻甲介のセットアップを示す鼻内視鏡図。
図 3: 呼吸器粘膜にチューブを探索の配置。(A) 外部ビュー表示配置。(B) Rhinoscopic ビューの配置を示します。(C) 図は、カテーテル留置の解剖学的位置を示します。PD: 潜在的な違い

PD のいくつかの薬への応答を研究、2 番目、カテーテル内腔を介して superfusion ソリューションが適用されます。準備と NPD 測定プロトコルでは、データ分析を通じて初期準備から下記のとおり実施に関するいくつか重要なステップがあります。

ソリューションおよび電極の準備の後電極やカテーテルの適切な品質テスト テストの基本的な行動のことができます。基底の測定は測定に最適な場所の選択ができる、下鼻甲介、に沿って行われる通常最も負の値とします。シーケンシャル perfusions+ (ENaC) の Na および Cl-鼻上皮間電圧の変化を介して (CFTR に依存) イオン流束を決定します。

プロトコル

ヒトを対象プロトコルは、すべての参加機関の研究委員会で承認されました。技術を実装する各センターはその機関の人間研究の倫理委員会承認のためにアプリケーションの責任です。

1. ソリューションの準備

  1. ソリューション #1, #2 とプロシージャとストアド敷地内 (表 1) の前に 1 L 単位の基本ソリューションである #3 を準備します。
    注: アミロライド光に敏感、暗闇の中で保存する必要があります (溶液組成の表 1を参照) (SOP の詳細なソリューション準備11を参照)。
    1. バッファーの pH 7.4 で 0.22 μ m ボトル上部フィルターとフィルターのすべてのソリューション。
    2. #3 ソリューションは、最初にリン酸塩を含む塩を追加、(溶液組成の表 2を参照してください) の結晶化を防ぐためにイオン化できるように。
      注: 混合のシーケンスは、#3 のソリューションにとって重要です。
    3. これらのソリューションは、4 ° c (3 カ月間安定した) または-20 ° c (6 ヶ月間安定した) を格納します。
    4. NPD のテストの日にエージェントを追加することによってソリューション #4, 5 を準備します。イソプロテレノールは光と酸化に敏感なそれは室温 (4% 減衰 4 ~ 8 ° C で 4 h 以上を示す) 活性を失い。4 ° C でのストア
      注: ATP は光と酸化敏感 (表 3参照)。
化合物分子の重量濃度 (mM)組成 (g/L)
塩化ナトリウム581488.58
CaCl2 2 H2O1472.250.33
KCl754.050.3
K2HPO4 1742.40.42
KH2 PO4 1360.40.05
MgCl2 6 H2O2031.20.24

表 1: 溶液組成。

化合物分子の重量濃度 (mM)組成 (g/L)
グルコン酸 Na21814833.26
グルコン酸 Ca4302.250.97
グルコン酸 K2344.050.95
K2 HPO4 1742.40.42
KH2 PO4 1360.40.05
MgSO4 7 H2O2461.20.24

表 2: 溶液組成。

ソリューションソリューション数内容EDC マーク
リンガーズ注入#1/A のソリューション注射用バッファー内の着信音リンガーズ
着信音 + アミロライド#2/B のソリューションバッファーに格納された着信音 + 100 μ M アミロライドアミル
ゼロの Cl- + アミロライド#3/C のソリューションゼロの Cl- + 100 μ M アミロライドをバッファリングOCL
ゼロの Cl- + アミロライド イソプロテレノール#4/D のソリューションゼロの Cl- + 100 μ M アミロライド + 10 μ M イソプロテレノールをバッファリングISO
ゼロの ATP + イソプロテレノール アミロライド Cl-#5/E のソリューション100 μ M の ATP + 10 μ M イソプロテレノール 100 μ M アミロライド ゼロの Cl-バッファーATP

表 3: ソリューションのリストです。

2. カテーテル

  1. 塩ビ、滅菌、単一の使用、2 ルーメン (0.7 mm インナー Ø) カテーテルを使用、ラウンドと滑らかな下肢 (2.5 mm 外側 Ø)、NPD のとりわけ設計されています。
    1. 側の穴は、灌流の先端の穴の先端に遠い 2 mm で粘膜との接触をする (ステップ 10.1 参照)。
    2. カテーテルの 2 つのルアーロック接続の 1 つを測定電極と灌流ポンプに他の 1 つに接続します。測定ルーメンとしてブルーに染色チャネルを使用します。10 cm 用各 0.5 cm 間隔でカテーテルをタグ付け。
      注: デッド スペースは 0.3 mL です。カテーテルの準備これが可能でない場合は、次の 2 つの手順をに従って、上記の手順を使用することをお勧めします。
    3. PE50 と PE90 のカテーテル チューブの等しい (〜 76 cm) 長さをカットします。
    4. シリコン ゴム製管の 1 cm の部分で一緒にこれらを貼ります。25 G 鈍い先端針ぴったり 90 PE チューブの反対側の端に挿入します。25 G 蝶針 snuggly を作るなり、チューブを穿刺しないように PE50 チューブの反対側の端に挿入します。

ダブルルーメンカテーテル図;ラベル付けされた寸法。医療用輸液投与に使用されます。
図 4: NPD 測定用カテーテル。インセット ボックス測定穴にカテーテル先端を示しています。

3. 寒天皮膚ブリッジ (蝶針) とカテーテルの準備

注: 溶けた寒天の操作がやけどを引き起こす可能性があります、これは慎重に行ってください。

  1. 100 mL の広口ボトルに #1 の溶液を寒天の 3 g を混合することによって 3% 寒天培地を準備します。溶けるまで電子レンジで寒天を溶かす (透明)。
    1. 暖かい寒天で 10 mL の注射器を満たしなさい。
    2. 蝶針 (23 G) とマークされたカテーテル内腔後シリンジを接続します。先端に表示されるまでは、寒天を注入します。
    3. 少なくとも 10 分のためのクールなことができます。
    4. 皮膚橋とカテーテルが完全に満たされた、気泡の自由であるために視覚化を確認します。
    5. 4 ° C で解決方法 #1 一括皮膚橋を格納し、1 週間後に使用しないでください。

4. if 使用心電図クリーム

  1. 解決方法 1 (1:1、v/v リンガー) 心電図クリームを薄くしなさい。空気の泡がなくなるまで休ませてください。
    1. 希薄化後の心電図クリーム 10 mL 注射器を入力します。
    2. マーク ルーメンのカテーテルに注射器を接続し、低い側の穴に表示されるまでゆっくりと心電図クリームを注入します。
    3. カテーテルが完全につぶしと気泡の自由であることを確認します。

5. データ集録システム

注: データ集録システムの一般的なセットアップは、図 5に示すです。

神経信号解析のための生体増幅器、電極、データ収集による電気生理学的セットアップ
図 5: データ集録システムのセットアップ。Bioamplifier とコンピューターのインタ フェースにパッチアンプ用アダプターの接続、およびパッチアンプ用アダプター11電極接続を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

  1. 接続
    1. USB ケーブルでデータ集録システム (材料表) にコンピューターを接続します。
    2. データ集録システムを bioamplifier に接続するには、データ集録システム (フロント) bioamplifier (奥) の出力に入力チャンネル 1 から BNC ケーブルを接続します。
    3. カスタム ケーブル事前入力部分、bioamplifier の前にパッチアンプ用アダプターのネジに接続すると、bioamplifier をパッチアンプ用アダプターに接続します。
    4. 電極と接地電極、パッチアンプ用アダプターに接続します。パッチアンプ用アダプターの前面を電極に接続するのに標準的な 2 mm メス-メス コネクタを使用します。
      注: ポートが凹んでいると 2 mm ケーブルの一方向にのみ適合: 赤測定電極 (鼻カテーテル); を介して患者の鼻を患者皮膚ブリッジ; ブラック参照電極白心電図用電極から接地被写体の肌。
    5. 説明されているように、bioamplifier を設定: オフセット: 調整、調整後引っ張られた位置に残すには、アクティブ化をプル電圧: DC;1 mV cal: 中立的な立場。電源: バッテリーを充電するための沖データを収集するにゲイン: 設定 10;帯域通過: LoFreq (外側ノブ): DC;帯域通過: HighFreq (内側ノブ): 1 kHz。ボリューム: オフ。

6 頭段オフセットの調整

  1. SOP11で示されるように、ラップトップとシーケンスのアンプを接続します。データ集録システムをクリックし、(順序がデータ取得のために使用される装置を認識するソフトウェアの重要) ラップトップを切り替えます。
    1. SOP シーケンスに従って頭段オフセットを調整します。

7. オフセット

注: 電気測定システムの安定性を確保するためにテストするいくつかのオフセットがあります。(図 6を参照)

  1. 電極のオフセットに参照 (負) 電極と測定 (正極) 一緒に希薄化後の心電図クリームまたは 3 M KCl。 確認、パッチアンプ用アダプター上でゼロ近くにある電位差電極の間に読書。
    1. カテーテルおよび/または皮膚のブリッジのオフセットを設定するには、測定 (正極) と一緒にお風呂にルアーロック鼻カテーテル末または皮膚橋末ルアーロックを配置します。心電図クリーム風呂または 3 M KCL、パッチアンプ用アダプターにゼロに近い潜在的な違いがあることを確認参照 (否定的な) 電極を含むカテーテルのもう一方の端を置きます。
    2. 閉ループ オフセットを設定するのには、電極の風呂に鼻腔カテーテルを交換するときに、回路が閉じていることを確認します。閉じたループのオフセット 0 に近い読み取りをチェック mV ('オフセット'; = ± 2.5 mV)。0 オフセットをさせるパッチアンプ用アダプター オフセット ノブを調整する mV。
      注: これは回路内のすべての接続されていないことを確認します。鼻カテーテルがそのままできない場合があります、そうでない場合 (寒天または ECG クリームの気泡)。寒天橋を変更またはセットアップで心電図クリームをプッシュします。閉鎖に続いて電極オフセットする必要があります最初に、実行するシステム (閉ループ オフセット) 電極とブリッジ (図 6)。

KClまたはECG浴の電極セットアップ図。参照電極と測定電極;鼻カテーテル。
図 6:(A) 電極オフセット、(B) カテーテル (または橋) のセットアップのオフセット (C) 閉ループ オフセット。

8. 注射器セットアップ

注: 以下は、推奨される設定です。

  1. #1, #2 と #3 ソリューションを融解測定の前に約 1 時間。
    1. カテーテルに最も近い活栓に延長線を接続します。
    2. すべてのポンプに切り替えるし、活栓が泡のクリアまでカテーテルを完全にフラッシュする解決方法 1 でカテーテルをフラッシュします。

9 参照および測定電極の配置

皮下ブリッジを備えた被験者の測定電極のセットアップ。神経生理学実験。
図 7: 電極と皮下ブリッジ測定の準備測定と件名です。

  1. NPD のオペレーターに直面して座位を取る研究主題を持ちます。快適、オプションの帯電防止マットと視能矯正顎残りの頭に足を配置します。
    1. 被験者の腕 (図 7) に置かれた心電図のパッドに接地リード電極を接続します。
    2. (寒天システム) の背側の前腕の皮下針の挿入または前腕に以前最小限すりむいた部分にクリーム心電図に参照電極を適用 (ポイントを 10 以下に 7 を参照)。
    3. 皮膚 (指 PD) との電位差を測定し、彼/彼女の親指と人差し指の先端間カテーテルをつまんで「測定穴」を閉じるに件名求めて皮下組織への接続を確認します。
    4. 指 PD が-30 場合 mV 以上負、蝶針の挿入を確認してください。(心電図クリーム セットアップ) の耐摩耗性を繰り返して、橋をチェックします。
    5. 右の鼻孔で 80 mL/h スタートで解決方法 1 シリンジ ポンプを開始します。
    6. 安定した負電圧として指 PD を測定 (典型的な範囲-80-40 mV)。
    7. 心電図クリーム システムを使用している場合: 心電図クリーム 1:1 の希釈し、寒天の以前に見たプローブ穴からオフの完全なフラッシュ後カテーテルを埋めます。
    8. 電極は、電極のオフセット、インセット橋のチェックを許可するを入浴する心電図クリームで半分いっぱい 50 mL シリンジにカテーテルを接続します。
    9. 皮膚のわずかな前最小摩耗によって皮下組織に参照 Ag/Cl 電極を接続して、皮膚が表示されます 'ピンクで光沢のある「真皮のレベルに達する。
    10. 位置を測定電極、心電図クリーム、すりむいた皮膚で覆われています。指 PD 寒天培地システムの前に示されているを確認します。

10. 基底 PD の測定

  1. 下鼻甲介を視覚化する照明か (または同等) を使用して右の鼻に鼻カテーテルを挿入します。ランドマークとして前方の先端を使用して、事前に下の呼吸器粘膜上鼻甲介の下のサイトを対象とするカテーテル。また、配置が困難な場合、鼻孔の床との接触プローブ穴を配置できます。
    注: カテーテルはオペレーターによって鼻孔に導かれるには十分に堅いです。配置を容易にするには、カテーテルの 1 つのチャンネルはブルーの色で、下鼻甲介と接触プローブ側の穴が含まれています。これはカテーテルの回転を防ぎます。10 cm に 1 からカテーテルに示されているマークは、簡単に参照ポイントを提供します。
    1. 下鼻甲介の PD を測定します。この目的のためには、下鼻甲介 (右基底でマーク) の粘膜に対しての配置によってカテーテルの測定穴が閉じていることを確認します。
    2. 0.5 cm (内下鼻甲介から下鼻道の距離)、1.0、1.5 2.0 3.0 で PD を測定: 右基底 PDs をマークします。
    3. 約 5 の指定距離で各測定を維持 s はそれぞれが着実な読書 (± 1 mV) を確保するため、基底の PD 値の正確な解釈を容易にします。
    4. 左基底 PDs (3 cm、2 cm、等) と、左基底でマークするファンクション キーを使用して、左の鼻孔で上記の手順を繰り返します。
    5. 最も否定的な信号のサイトに鼻腔カテーテルのプローブを挿入基底 PD 対策をガイドとして使用して、(下鼻甲介の前方の先端から 3 cm まで)、鼻 (または同等) の先端にテープの小さい部分で固定。

11. NPD シーケンシャル Perfusions トレース

  1. 右の鼻の
    1. ソリューションは患者さんの鼻から滴り落ちることを確認します。(しばしば主題自分の手で自分の頭を休ませるか、あごや他の固定デバイスを使用することで助けた) を自分の頭を快適な位置を想定して件名を持ちます。動きを最小限に抑え、鼻や、チューブに触れないように話を避けるために、件名を思い出させます。
    2. 解決方法 1 をオン (5 mL/分、または 300 mL/h) (着信音) ポンプ。安定した値が得られるまでの記録 (< 1 mV 変更/30 秒)。
      注: これは、安定性を達成するために約 3 分かかります。
    3. 解決方法 1 による血液灌流をオフにします。
    4. 解決策 #2 (アミロライド) で灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 (プラトー電圧が疑わしい場合は最大 5 分の合計の記録を継続)。
    5. #3 (ゼロ塩化) ソリューションで灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 (プラトー電圧が安定していない場合は最大 5 分の合計の記録を継続)。
    6. #4 (イソプロテレノール) ソリューションで灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 [プラトー電圧が安定していない場合 (少なくとも 30 の定常電圧トレース < 1 mV ドリフトの s)、合計 5 分までの録画を続ける]。
    7. ソリューション #5 (ATP) を灌流を開始します。1 分、ピーク過分極応答が得られるまでの最低記録 NPD は。
    8. 解決方法 1 (着信音) による血液灌流を有効にでき、30 s、カテーテルをフラッシュします。
    9. 解決方法 1 血流をオフに。
    10. 左の鼻孔の手順を繰り返します。

12. テストの終了

  1. 再確認し、5 の安定した指 PD (「ポスト指」) を記録 s。
    1. 皮膚挿入部位から被験者の皮膚橋と包帯を削除します。塩化銀/心電図クリーム システム アームから電極を削除します。
    2. 前述の初期の閉ループ オフセットを測定するために「最終的な閉じたループ オフセット」電圧を記録 (ステップ 7.1.3 を参照)。
    3. ファンクション キーと最終的なオフセットをマークします。
    4. データ集録を停止 (プレス""を開始)。
      注: 現在の SOP テスト用ポジティブ コントロールとして、プリン カルシウム依存-の Cl 分泌をアクティブに 100 μ M ATP の使用をお勧めしますただし、これは省略可能なテストです。

結果

正常気道上皮細胞の Na+の吸収は一次イオン輸送活動です。これは間に関し否定的な気道表面電位差の結果します。ENaC チャネル ブロッカー アミロライドの灌流より少なく否定的な潜在的な違いをもたらします。その後、Cl-のスパーフュー ジョン法-無料のソリューションより否定的な潜在的な違いを作成し、CFTR を含むすべての Cl-のトランスポーターをアクティブに cl-、化学のグラデーションが作成されます。イソプロテレノール、細胞内 cAMP を増加、さらに具体的に CFTR のアクティブ化-の Cl 分泌を増加、潜在的な違いを増加です。

対照的に、存在しないか機能不全 CF の科目で、増加 ENaC CFTR 結果が Na+吸収12を介した。その結果、ベースラインの電位差はもっと否定的です。最小限であるに対し、アミロライドのアプリケーションによる脱分極が大きい、または CFTR 依存経路を介して Cl-分泌刺激時に発生した電位差に変化はないです。これは、図 8、'健康' 対 'CF' トレースを示す代表的なトレースで見ることができます。

電気生理学チャート、健康な PD の変化、F508del;アミロリド、Cl/Iso期、研究分析。
図 8: 代表的な痕跡は、'健康' の件名と cf. とPD: 潜在的な違いは、ΔAmiloride: デルタ アミロライド、/Iso 0 Cl--: 低塩化: 解決策 #2 の完了とソリューション #4 灌流、S1 S4 の PD の変化: 段階 1-4、緑の線グラフの A と B を示す NPD トレースと黒矢印を示す潜在的な面での違い

ディスカッション

生体内でNPD は縦に繰り返し実行することができます独自の計測を提供し、繰り返し測定と同様の縦結果がグループまたは個人を単位14、観察されるを示します 15。NPD が CF を区別する非 CF の優れた弁別妥当性を持っていること強力な証拠があります。25 研究は一貫して Cl-で統計的に有意な差と CF 患者と健常者10の Na+の電気伝導を示した。一方、開発済みのいくつかの指標は、この容量を示すため、方法論7,8の最近の標準化を与え、新しい更新プログラムが必要なことを期待しています。

変更とトラブルシューティング

このテストでは、正確な測定を保証するためにいくつかのキーの手順が必要です。推奨基準をシステムが実行されていることを確認する電極やカテーテルの閉ループ オフセットが含まれます。患者はまだ残っているし、話してこれはアーティファクトとカテーテルの脱落を最小限に控える必要があります。これは、ため、テストは非協力的患者の困難や手法は、年齢7の 6 歳以下のお子様の 1 つの研究で報告されています。

鼻上皮の事前検査は、痂皮や測定値に影響することができます上皮の粘液がないことを確認する必要です。

非常に重要なは、カテーテルの配置場所が議論の対象であることが指摘される必要があります。ここで紹介する SOP は、(IT) 下鼻甲介の下で測定を利用しています。そして IT の下でカテーテルの位置を標準化されており多施設共同試験においては、したがって、これは推奨される方法です。IT の下で計測を行い側穴カテーテルは、ソリューションと接触しながら鼻粘膜としっかりした接触を維持することは困難かもしれない。他のグループは、技術的に簡単鼻のフロアで PD を測定します。重要なは、バーミューレン (2011) 匹敵する16である 2 つの方法を示した。

ソリューションの温暖化欧州と米国センター17,18の間で議論の問題は残る。それによって提唱されており 22 ° C ではなく 37 ° C でソリューションを使用して塩化物の全観測応答が増加するおよそ 25% およびイソプロテレノール依存性クロライド応答で約 9518。ただし、塩化物の全応答17の大きい標準偏差により評価した変動が増加地球温暖化します。したがって、ソリューションを温暖化の変動その他の要因は、研究的に必要でない限り、ソリューションをウォームことを勧めします。

以前電極技術の両方を比較して塩化銀と塩化第一水銀の電極システム運営同様に健常者13における基底・誘導電流のことを発見しました。

技術の限界

このテストは、被験者内変動の重要な対象です。得点の変動は不確定なトレース患者で特に普及している、この診断アプリケーション19で考慮する必要があります。変動の要因には、急性上気道感染症、広範な鼻ポリープ、前副鼻腔手術、CF に関連する炎症、その特異性と感度20,10減少が含まれます。また、トレースの解釈が専門家読者示す定量的得点と CF と非 CF の心音の解釈可能性の優秀な契約とは対照的に大きな変動が読者の間で異なっている、トレース19の自信。

重要なしきい値と本質的な可変性

異なった調査10、塩化合計の輸送の変化にかなりの可変性を示した CFTR 遺伝子治療の臨床試験などで示されているように非常に重要なことは、測定の生理学的変動はかなり大きいとアミロライド21,22の範囲です。横断的評価は示唆-7-5 のしきい値を超えるイソプロテレノール応答プラス Cl-をゼロ mV は CF と非 CF 科目10カットオフ。

我々 はそれにもかかわらず、疾患修飾療法の第 II 相試験で効果的な「CFTR 補正を表すこのパラメーター変化の大きさについて明確な知識を欠いています。個々 の応答を評価するために介在への応答の監視テストを繰り返しては本質的な変動からの重要な変更を区別する必要があります。非常に重要なことは、疾患修飾薬と今後の長期的な研究は「CFTR 機能改善が CF の臨床的に関連性の高い結果またはサロゲート結果 (fev 社1改善) などの改善と相関を示す必要があります。病気。確かに、II Ivacaftor 研究示された最近の段階は、塩化分泌23の小さな改善にもかかわらず臨床的利益をマークしました。

このような研究は、上皮細胞の Cl-コンダクタンスの改善のカットオフ値かもしれない臨床利益のため代理パラメーターを確立するのに役立ちます。これは CFTR の治療法を変更することの開発を導くための重要なパラメーターであります。

既存のメソッドの意義: 汗テストと腸現在測定 (ICM)

'疑わしい' 嚢胞性線維症患者におけるとして評価中間汗と 30 と 60 mM、NPD 複合スコア 'CF-可能性が高い' 患者の診断に非常に重要なツールを提供 'CF まずない'10 Cl-濃度.腸内の電流測定 (ICM) ネット Cl-直腸上皮間フラックスの前のヴィヴォ測定を提供することができます残留「CFTR 機能の定量感度の高い CFTR 高で表現されますのでこの上皮。

CFTR の変調器によって「CFTR 機能これらの異なる CFTR バイオ マーカーの変化と関係変更を考慮したが現時点では不明。最近の仕事に基づいてが Ivacaftor 決定、NPD と汗テストは相関4、それがまだ確立されていない場合上気道での測定よりも、例えば呼吸の結果のよりよい予測因子、汗テスト24,25または ICM に変更。さらに、修飾子の薬は、その臓器の特定の効能にも異なります。NPD、に関して 0 Cl-とイソプロテレノール応答の変化エクスプレス Cl-輸送しながら基底 PD とアミロライド応答の変化表現 Na+の輸送であることに注意してくださいすることが重要です。病気の改善にとって重要でこれらの確立です。

この技術応用の将来展望

この手法の使用は、CF フィールド外予定です。この手法は、+の Na および Cl-イオン チャネルを示す一意に適しているので喘息26、27慢性気管支炎気管支拡張症非 CF28 を含む気道疾患における機能不全を示すに使えます再発性膵炎29。さらに、この手法の変更は、慢性気管支炎30慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 患者の下気道に焦点を当てた「CFTR 機能不全を示す下気道 (LAPD) で使用されていますいます。

NPD は、両方診断に使用することができますし、また、CFTR と ENaC 修正を目指す概念実証研究の橋渡し研究の活動、チャネル「CFTR 機能の敏感な体内バイオ マーカーを提供します。これは上皮細胞の機能の縦断的評価をにより、CF と各患者のための最も効率的な補正を調整する個別化医療の戦略としての約束を保持しています。

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この研究は、「CFTR 機能標準化委員会 (臨床試験ネットワーク、嚢胞性線維症ヨーロッパの社会) の国立資源センターの作業グループ (治療開発ネットワーク、嚢胞性線維症のワーキング グループによって支えられました。財団)。追加のサポートは、CF 財団によって提供された (クランシー GMS に 09 年度) と NIH (SMR と GMS に DK072482)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
KD Scientific輸液ポンプ(または同等の–機関/病院が提供するプログラム可能な輸液ポンプなど)Fisher Scientific
Powerlab 4/30AD Instruments
BMA-200 AC / DCポータブルバイオアンプADインスツルメン
IS0-Z BMA-200ADインスツルメン
ツ用アイソレーションヘッドステージWindows互換PC - Windows XP以上の最小要件さまざまな
AD機器ソフトウェア:GLPクライアントV6(Windows)以降AD機器
ECG電極(研究対象者のグランド)病院標準
2ミニカロメル参照電極フィッシャーサイエンティフィック13-620-79
塩化カリウムKCl、粒状–USP、式重量76、数量:500 gmKCl
滅菌容器(検体収集容器など)で、電極を所定の位置に保持するために蓋に穴が開けられています。(電極メーカーから提供されていない場合)病院標準
2電極:Ag/AgCl 8 mm TP電極BIOPACシステムUNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl電極、B0194、プラグ 4 mmSLE Instruments
Signacreme®導電性電極クリームフィッシャーサイエンティフィパーカーラボ ref #17-05
皮膚摩耗装置PROMED フィーリングRef 374901
Hi Di 541 M、ダイヤモンド先端歯科用バリアッシュインスツルメンツ
ベクトンディキンソンPE 50フィッシャーサイエンティフィ427411
ベクトンディキンソンPE 90チューブフィッシャーサイエンティフィック427421
シラスティックチューブ、0.062インチ内径、0.095インチODフィッシャーサイエンティフィック508-007
マイクロポア外科用テープ 紙 (25 mm x 9.1 m)3M1530-1
マルコート ダブルルーメンカテーテル 長さ: 80 cm;外径:2.5 mm;チャネルの内径:0.8 mm;サイドホールから先端までの距離:2 mm. NPDのEUラベル契約:I0202USMarquatI0202US
1" X 10ヤードシルクテープ3M Durapore1538-1
IV延長チューブ(30インチ、50 /箱)国際限定IMN30
三方活栓(50 /箱)MedexMX5311L
滅菌シリンジフィルター (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm以下のフィルター。または同等)Fisher Scientific09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer スタブアダプター (20 G、研究施設で製造された鼻カテーテルを使用する場合は PE90 への接続用)Fisher Scientific427564
Becton Dickinson 23 G、0.75"バキュテナー ("バタフライ」)針 (0.6 mm x 19 mm; 50 U/箱) (PE50 への接続用) (研究施設で製造された鼻カテーテルを使用する場合)Fisher Scientific367283
Becton Dickinson シリンジ 60 mL 針なし Luer-Lok チップ (40/箱)FisherScientific309653
Becton Dickinson シリンジ 10 mL 針なし Luer-Lok チップ (100/箱)Fisher Scientific309604
使い捨て滅菌ワイプ(施設の可用性ごと)病院標準
70%EtOH(1パイント)、Aaper Alcohol and Chemical Co.カタログ番号NC9274019(または同等品)Fisher Scientific
Corning使い捨て滅菌ボトルトップフィルター、0.22 μm 細孔径 (0.15 – 1.0 L 容量許容)Fisher Scientific430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – pH メーター校正用Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – pH メーター校正用Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – pH メーター校正用Fisher Scientific
使い捨てアンダーパッド(ブルーパッド、23インチ x 36インチ 150個/箱、または病院規格による同等品)SureCare
23 G、0.75インチバキュテナー」バタフライ」針 (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box)Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; または同等品)Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (または同等品)Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with batteryFisher Scientific
ヘッド&チンレスト(または同等品、オプション)Richmond Products, Inc629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (または同等品)Fisher ScientificNo. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular –USP NaClフォーミュラ重量:58;サイズ:500 gm
カルシウムCaCl2< / sub>•2H2O –USPスペクトラムフォーミュラ重量:147;サイズ:500 gm
塩化マグネシウム六水和物結晶、MgCl2•6H2O –USPスペクトラムフォーミュラ重量:203;サイズ:500 gm
リン酸カリウム二塩基性、無水、顆粒、KH2PO4–USPスペクトラムフォーミュラ重量:174;サイズ:500 gm
リン酸カリウム一塩基性結晶–NF(KH2PO4)スペクトラム式 重量:136;サイズ:500 gm
コン酸ナトリウム-USP(モノナトリウム塩)スペクトル式重量:218;サイズ:500 gm
コン酸カルシウム–USP(無水粉末)スペクトルフォーミュラ重量:430;サイズ:500 gm
グルコン酸カリウム-USP(無水)スペクトラムフォーミュラ重量:234;サイズ:500 gm
硫酸マグネシウム七水和物–USP MgSO4•7H2Oスペクトル式重量:246;サイズ:500 gm
Amiloride HCl –USPスペクトラムフォーミュラ重量:302;サイズ:5gm
アデノシン5'-三リン酸(ATP)(二ナトリウム塩)スペクトル式重量:551;サイズ:5 gm
塩化マグネシウム、六水和物、クリスタル–USP MgCl<サブ>2&ブル;6H2Oスペクトル式重量:203;サイズ:500グラム
二蒸留水(ddH2O)病院薬局フォーミュラ重量:NA;サイズ:1 L
イソプロテレノールHCL注射 - USP 1 mg / 5 mLアンプル病院薬局処方重量:248;サイズ:使い捨て
リンガーズインジェクション、USPまたはリンガーズ灌漑病院薬局フォーミュラ重量:NA;サイズ:5L
ツカロメルバスに使用するスペクトラムックチューブ ック サイエンティフィック スペクトル塩化グルグル

参考文献

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