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方法論記事

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

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DOI：

10.3791/57015

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2018年1月19日

 , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

この記事について

サマリー

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス イメージングの概日リズムの分子リズムを監視するために最適化を確立することです。このメソッドの薬理学的アッセイへの応用を論じた。

要約

概日時計の回路は、昼/夜サイクルなどの環境手がかりと連動したリズミカルな行動および生理学的な出力を調整します。各細胞内で分子時計は、回路の動作に必要なリズミカルな神経機能の根底にある遺伝子発現の概日リズムを生成します。ペース メーカー細胞のさまざまなサブクラスにおける個々 の分子振動子と神経信号との相互作用の性質の調査概日時計回路の理解が得られます。培養ショウジョウバエ幼虫脳の時計ニューロンの分子時計仕掛けを監視する開発タイムラプス蛍光顕微鏡のアプローチを紹介します。このメソッドは、単一セルの解像度で、遺伝子にエンコードされた蛍光概記者のリズムの複数日記録をできます。このセットアップは、さまざまな化合物を分子時計のリアルタイム応答の詳細に解析する薬理学的操作と組み合わせることができます。概日リズムを超えて強力なショウジョウバエの遺伝学的手法との組み合わせでこの多目的メソッドは生きている脳組織の多様な神経細胞や分子プロセスを勉強する可能性を提供しています。

概要

体内時計は、地球の 24 時間の自転によって生成された定期的な環境変化に適応する生物を助けます。インタロックされた転写翻訳フィード バック ループ一般種1にわたって概日時計の分子機械を根底します。概日時計回路構成の時計を含むニューロンの統合環境手がかり、明/暗 (LD) や毎日の茄多のリズムを調整するための温度サイクルなどによって伝えられる時刻の情報生理と行動プロセス2,3。分子リズム神経の入力と出力の調整は概日リズム回路ですが部分的にしか理解されて残るの操作にきわめて重要です。

ショウジョウバエの分子時計のコアでクロック (CLK/サイク) ヘテロダイマーをアクティブに期間(あたり) の転写と時代を超越した(ティム)。あたりとティムは、複合体を形成し、彼らは CLK/サイクとその結果自分の転写の転写活性を阻害する核を入力します。CLK/サイクを介した転写とあたりで抑圧の間の遅延が発生する転写と翻訳後の規制/ティムは、24 h の分子振動1,3,4年頃の世代を確保します。.これらの分子時計のフォームを含む約 150 のニューロン大人の行動の日周性制御回路は飛ぶ5です。くらい簡単で完全に機能的な概日リズム回路時計ニューロン - 5 腹側外側ニューロン (LNvs; 4 PDF 陽性 LNvs および以下を参照してください 1 つの PDF 負 LNv)、2 背側ニューロン 1 s (DN1s) と 2 の背側ニューロン 2 s (DN2s) - の 3 つのグループから成るが、幼虫の存在脳6,7。

シンプルな幼虫体内回路間神経回路と分子時計の相互作用を研究するための優れたモデルを提供しています。我々 は分子時計仕掛け幼虫体内回路で異なるクロック ニューロン群のダイナミクスを特徴付けるしようと新しく開発された蛍光レポーターあたり TDT、蛋白質および細胞内ロケーションごとのレベルを模倣を使用して8ですさらに、我々 神経レベル9,,1011で概日リズムの調節に 4 LNvs によって生成されるペプチド顔料分散係数 (PDF) の重要な役割を知ることには、直接を調べたい。分子時計の PDF の効果。このため、幼虫の脳のリズムは、複数日にわたるタイムラプス共焦点顕微鏡による外植体概日遺伝子の発現を監視する方法を開発しました。プロトコルは、TDT のあたりのレベルに及ぼす PDF または他の化合物をテストする薬理学的アッセイにも適応されました。したがって、適応は、脳培養を薬物のアプリケーションにアクセスできるように、時間的解像度は高く、短い期間のためのイメージングで構成されます。

発達段階別のショウジョウバエ脳の前のヴィヴォ文化はずっと以前に確立された12,13,14,15,16,17 ,18。これらのプロトコルは、さまざまな生物学的現象のイメージングのために使用されているに対し、それらのいくつかは単一セルの解像度で画像と互換性がないまたは数時間以上の文化をサポートしていません。ショウジョウバエの概日リズム神経細胞の長期のライブ イメージングを実行する代替方法など分子リズム19,20,21の生物発光イメージングの蛍光イメージング光シート顕微鏡22,23カルシウム インジケーター。生物発光イメージングは、高い時間分解能を達成できる、光シート顕微鏡は生体内イメージングのため適応することができますが、彼らは空間分解能に限られている、特殊な顕微鏡システムが必要があります。

ここで説明する方法は、複数日にわたる単一セルの解像度で全脳文化の蛍光信号を視覚化するために合わせて調整されます。この安易な汎用性の高い方法は、ショウジョウバエの神経生物学のさまざまな問題を研究する薬理学的実験、培養画像アダルト飛ぶ脳に合わせることができます。

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プロトコル

1. 文化フードの下にストック溶液の調製

  1. 400 ml (参照24,25から変更) 幼虫の脳の前のヴィヴォ文化のために最適化されたシュナイダー活動的な媒体 (SAM) x 1 の (表 1)。5 mL フラッシュして因数 (LN2) 液体窒素で凍結、- 80 ° C で保存
  2. 希釈 10 倍の原液 (参照26から変更) 解剖生理食塩 (DSS) × 1 を準備 (表 2)。
  3. 10 mg と単一の使用のための 4 ° C で保存場所に割り切れるフィブリノゲンは。
    注意: 層流、手袋、有害です下のフィブリノゲンの重量を量る。
  4. サムのトロンビン原液を準備 (1500 NIH ユニット/mg)、10 μ L を分注、フラッシュ LN2でフリーズ、-80 ° C で維持
    注意: は、有害であるトロンビンを処理するとき、手袋を着用します。
  5. 分注・原液 100 のペニシリン-ストレプトマイシン x。-20 ° C で維持します。
  6. ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜の円を削減 (材料表参照) ガラス底皿の内側に収まるサイズにします。70% にそれらを洗い流してエタノールそしてオートクレーブの dH2O. 定置滅菌と UV を伴う層流の下でドライ。滅菌シャーレにしてください。シングルユース。
    注: PTFE ガス交換ができ、媒体の長期記録中に蒸発を防止する多孔質柔軟な膜であります。

2. タイムラプス顕微鏡のセットアップ

メモ: 次のセットアップ タンデム逆スキャナー共焦点顕微鏡 (材料表参照) が装備されて共振型スキャナー (8,000 Hz)。システムには、共振型スキャナーと一緒に光毒性や退色を防止する高感度写真乗算器が含まれています。温度と湿度を制御顕微鏡環境チャンバ内顕微鏡のほとんどをカバーする (表を参照)。

  1. ステージ上の湿度チャンバーを配置します。
  2. 顕微鏡室 25 ° C と 80% の湿度に平衡に温度・湿度コント ローラーをオンにします。
  3. 暗黒 (DD) で実験を実行するには、(ただし、顕微鏡室は不透明な材料の作られて) 不透明な布で顕微鏡環境商工会議所をカバーします。
  4. 水浸漬の目的を使用して、目的の上に水浸マイクロ ディスペンサーを置き、タイムラプス イメージング中に一定の割合で水を分配するための Autoimmersion 目的のコント ローラー ソフトウェアとプロトコルをプログラムします。
    注: 浸漬媒体の他のタイプが乾くと、長期のライブ イメージング、水浸漬水ディスペンサーまたは乾燥対物レンズと共に目標お勧めします。
  5. 湿度チャンバー内のステージにシャーレ ホルダーを配置します。
  6. 顕微鏡のソフトウェアを起動し、最初のダイアログ ボックスから共振型スキャナー モードを選択します。初期化の段階が表示されたら [ok] を選択します。関連するレーザー ラインに切り替えるにハードウェア構成を [設定] タブに移動します。
  7. 双方向モードを選択し、設定の画像集録パラメーター XY パネルに取得] タブに移動します。
    注: 記載されているイメージング セットアップ紹介 (図 2図 3および映画 1) は概日性特定の蛍光レポーターの発現を観察に最適です。次のパラメーターは、当社の仕様に合わせて選ばれた: 40 X 水浸対物レンズ、512 × 512 イメージ解像度の 8 X 線平均。マルチカラー イメージングを連続画像の取得が必要な場合 1 つの蛍光体と別の重複 (ここでは、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) 放射とトマト励起重なる波長) の励起波長の発光波長。最速だし、Z スタックの取得中に時計ニューロンの移動はごくわずか、"スタック"の間にシーケンシャル モードを選択します。顕微鏡設定は各実験の目的に合わせて適応する必要があります。

3. 幼虫脳培養のセットアップ

注: 脳外植体の埋め込みに郭清から全体の手順は、30 分程度かかります。

  1. 文化フードの下で試薬の準備。
    1. トロンビンの因数を解凍し、(ステップ 3.3) 埋め込み手順まで室温で維持します。シングルユース。
    2. 37 ° C でサムの因数をすばやく解凍し、単一の使用のための氷をします。
    3. 10 mg/mL にフィブリノゲンの 10 mg の因数にサムを追加, 軽くフリックし、37 ° C 少なくとも 30 分と埋め込み手順 (ステップ 3.3) 中で孵化させなさい。シングルユース。
      注: フィブリノゲン ソリューションよりも 2 h が孵化しないでそれは重合を開始。
    4. 100 x の在庫ペニシリン-ストレプトマイシンの因数分解しなさい。2.5 ml 1 を含むサムのペニシリン-ストレプトマイシン (サム/抗生物質) x。室温で維持します。
      注: ストア残り 100 x 在庫ペニシリン-ストレプトマイシン 4 ° C で 1 ヶ月。
    5. 残りのサムから 500 μ L の因数を準備します。氷の上を保ちます。
    6. 長期的なイメージングのためガラス底皿 (図 1 a) の下のプラスチックの部分にオートクレーブ真空グリースを塗布し、UV を伴う層流の下で滅菌します。
  2. 中枢神経系と腹側神経索の郭清。
    1. 鉗子、2 倍の 70 %3 よくガラス解剖料理きれい江藤。4 井戸に DSS の 400 μ L と 1 つの井戸のサムの 400 μ L を注ぐ。氷の上を保ちます。
    2. 幼虫を含むフライの中をえぐり、鉗子で非徘徊 3 齢幼虫 (L3) を選択します。引き続いて 2 DSS いっぱい井戸にそれらを洗い流してください。第三の DSS いっぱいよく幼虫に麻酔がかかる氷の上にしてください。
      注: L3 続く 25 ° C で約 2 日間生理学的に関連する期間で脳を観察するには、非徘徊 L3 幼虫を使用にしました。時計ニューロン、l LNvs、DN3s などの他のサブグループが L3 ステージを徘徊で形成する開始、彼らは必ずしもサイクリングまだ (データは示されていない) ではないです。したがって、イメージすることが可能です (データは示されていない)、この段階で時計ニューロンをサイクリングがデータ分析用のものを開発してからすでに機能的幼虫時計ニューロンを慎重に区別することが重要。非徘徊 L3 は 25 ° C で産卵後約 4 から 4.5 日を表示概日リズムを勉強するため、このプロトコルを使用する同期 (同調) 開発の幼虫で 12/12 h LD サイクルの L3 幼虫を収集する前に 3 日間の 25 ° c。
    3. インサイド アウト手法27を利用した幼虫を洗浄に使用されていない 4 の DSS いっぱいのよく、微細鉗子で幼虫の脳を解剖します。
      1. 簡単に、2 つの幼虫をカット、優しく鉗子のペアで口フックをピンチし、ロールアップ インサイド アウト脳を公開するので、鉗子の他のペアを使用して体の壁。すべての気管と体の残りの部分に接続する神経を切断して脳を解放します。
      2. (DSS では洗浄済み) 20 μ L ピペットと DSS の約 3 μ L で脳を吸引し、サムいっぱいよく分配します。最大 7 脳の手順を繰り返します。
        注: 郭清は冷たい表面麻酔幼虫と冷やして脳を維持するは実行必要があります。たとえば、氷冷水を循環させるポンプに接続されている冷却ブロックに解剖皿を配置します。脳あたり解剖手順が 〜 30 秒。脳とそのまま腹側神経索に添付の目/触角成虫ディスクを保つことが重要です。これらの部分をちぎり、脳を損傷し、文化の質を減らします。また、空気に脳を露出を避けます。最初の脳を吸引する前に上下に切り裂かれた幼虫の部分を含む DSS ピペット先端の壁に付着してから脳を防ぐため。
  3. 3 D マトリックスの脳外植体を埋め込むと取り付け (~ 20 分)。
    1. フィブリノゲン使用液 (フィブリノゲン最終濃度 ~3.3 mg/mL、脳あたり 10.5 μ L) で切り裂かれた脳をとおり水没します。
    2. (セクション 3.2.3 で使用される同じチップ) とサム/抗生物質の 3.5 μ L を吸い出しなさい。先端中 SAM/抗生物質を塗布せず同じピペット チップにも郭清から切り裂かれた脳を吸引します。
    3. 脳と滅菌シャーレの蓋の中を調剤します。脳を含むドロップにサム/抗生物質の別の 3.5 μ L と暖かいフィブリノゲン/サム 10 mg/mL の溶液の 3.5 μ L を追加します。20 μ L ピペット チップでピペッティングで優しく脳周りのソリューションをミックスします。
      注: この手順ではピペットではなく、鉗子を使用して脳を強調を回避できます。
    4. ドロップからフィブリノゲン作業ソリューションの 2 μ L、小さな円としてガラス底皿の上適用されます。トロンビンの 0.8 μ L を加え、ピペット チップを非常に迅速に混ぜます。フィブリノゲンはフィブリンに変換され、重合を開始します。
    5. フィブリノゲン作業ソリューション (ステップ 3.3.1) 鉗子のペアの間に座っている脳を取るし、フィブリンの白いマトリックス表示されるマトリックス上に配置します。ダウン (時計ニューロンをイメージング) の脳の前方側に合わせます。それをプッシュできるだけ近くにカバーのガラスに。フィブリン血栓は、フィブリンの層で構成されます。1 つのレイヤーを選択、マトリックスを外さず小さなと穏やかな動きで脳の上にそれを折る。
      1. 脳を安定させるために血栓のさまざまな部分から 2 〜 3 倍を繰り返します。
        注: 鉗子で脳を処理するときそれを乾燥もしくはそれに物理的なストレスを課すしないように注意します。
    6. トロンビンのアクションを停止する埋め込み脳の上にサム/抗生物質の 20 μ L を追加します。
    7. 残りの脳をマウントする手順を繰り返します。ガラス底皿の上 6 の脳に 5 までを埋め込むことが可能です。
    8. 長期のライブ イメージング (ガラス部分) の内部の井戸にサム/抗生物質の 600 μ L を追加します。培地の上にカット済み PTFE 膜を置き、(3.1.5) (図 1 a) の下のプラスチックの部分に適用される真空グリースに固執します。
    9. 薬理学的試金のためのサム/抗生物質 (図 1 b) 2 mL で皿を満たし。
      培地の浸透圧は細胞の生存に重要なメモ: それは、培地の蒸発を避けるために非常に重要。したがって、長期的なイメージング実験のため PTFE 膜を培養皿を封印する必要は。短期的な実験のため膜のシールはありません限り、皿の中の 2 ml し、加湿チャンバで監視が必要。

4 コマ画像の取得

  1. ステージ上の湿度チャンバー内シャーレ ホルダーにガラスの下皿を配置します。
  2. Z スタック パネル [取得] タブに移動し、顕微鏡ソフトウェア (2 μ m × ~ 40図 2 図 3、およびムービー 1に示す実験) から z セクション手順を設定します。Coverslip と脳外植の体、coverslip の近くに、表面の終わりから最も遠い面 z スタックの先頭を設定します。脳の動きがごくわずか、先頭と z スタックの末尾に余分な z セクションを追加します。
  3. マーク ・ パネルとセットアップのマルチ ポジション イメージ取得を見つけるに移動します。40 × 対物をビューのフィールド内で 1 の脳半球に取り込むことができます。
  4. 取得モード] パネルと [xyzt (z スタック時間経過) に移動します。時間獲得パネルに移動し、希望の時間間隔と周波数パラメーターを設定します。
    注: は、所望の周波数でコマ撮り画像を取得します。注意してください結果を少ないサイクリング ニューロン長期ライブ イメージング (24 72 h) 経過時間 2 h より短い傾向があることおそらく神経細胞の生存率を少なくため。データ ボリュームは、もっと挑戦的なデータ分析とストレージは、画像取得増加率として展開します。

5 短期ライブ イメージングと脳外植体薬理学的治療

注: 次の手順は、本質的と同じ長期的なイメージングが PTFE 膜を必要としません。青色光文化に化学物質を追加するときに脳を公開しないようにするには、顕微鏡を赤い光で暗い部屋で配置する必要があります。

  1. 時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔と新薬承認申請前にベースライン データを取得するためにスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。
  2. スキャンの完了後、ベースライン、顕微鏡システムのスキャン ヘッドを持ち上げます。ステージ上の湿度コント ローラーの蓋を取り外し、非常に慎重にそれを移動することがなくガラス底皿のふたを外します。
  3. 必要に応じて、適切な培地量を削除します。培地で実験的なソリューションを追加し、脳外植体に触れることがなく滅菌パスツール ピペットで非常にゆっくりと慎重にミックスします。
    注: バス PDF のアプリケーション (10 %dmso) で 2 μ M PDF 原液を使用します。
  4. ガラス底皿および湿気のある室内には、スキャン ヘッドの蓋を取り付けます。使用している場合、顕微鏡室の周り黒い不透明な布を再配置します。
  5. かどうか、脳は、ライブ スキャン ・ モードの元の位置を確認します。必要に応じて調整します。
  6. 時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔とスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。
    注: ここでコマ撮り画像で 10 h までのすべての時間をテストしました。

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結果

ここでは、幼虫の脳文化前のヴィヴォの記者式の PDF バス アプリケーションのライブ イメージング結果概蛍光レポーターの長期記録の代表的な結果を示す.

分子時計記者あたり TDT と UA mCD8::YFP Clk 856 gal4 (図 1) されたレーザ脳の同調時計ニューロン ドライバーによって駆動を表現する非徘徊 L3 幼虫が解剖し、最後の間に長期培養のセットアップ光直前の LD サイクルの位相暗期 (図 1 aおよび2 b)。DD のタイムラプス イメージングを行い脳植は、64 時間すべての 2 h をイメージしました。ニューロンに対応する領域の平均蛍光強度を測定したバック グラウンド減算8と関心のニューロン...

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ディスカッション

ここで長期培養の幼虫の脳の蛍光タイムラプス顕微鏡法について述べる。このタイプの実験の成功によって異なります文化、健康などの複数の要因脳植、蛍光強度、記者、時間と空間分解能の信号対雑音比の固定方法と外植体へのアクセシビリティ。これらの要因は相互に排他的にすることができます。たとえば、文化の健康に影響するタイムラプス周波数の増加、脳外植体の固定化は、ガス交換を妨げる可能性が。したがって、調査の下で現象の幸せな媒体 (しゃれは意図) を見つけることは成功したプロトコルにキーです。ここで説明する方法は、数時間数日からのスケールで蛍光概記者の式を監視に最適です。また、重要なプロセスが変更されず、注意を払って実行限りショウジョウバエ神経生物学の他の科目を研究に適用されます。

このプロトコルでは 3 D マトリックスを作成し、フィブリン血栓脳外植片が固定化します。ポリ リジンやラミニン カバー ガラスのコーティングなどの固定化のための他の方法が存在するがこれらの幼虫の開発を遅く29の頭脳し、彼らの生理学的な堅牢性、妥協の可能性があ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は彼の指導のマイケル Rosbash に感謝し、このメソッドの開発の初期段階をサポートします。科学技術振興機構さきがけプログラムによって、スイスの全米科学財団 (31003A_149893 と 31003A_169548)、欧州研究評議会 (ERC-ポンド-311194)、ノバルティス財団法人医療医学研究 (13A39)、ジュネーブの大学資金が供給されたこの作品.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
KH2PO4Sigma-AldrichP5655にあるものと全く同じかどうかはわかりません。CaCl
2Sigma-AldrichC7902
MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
D-(+) グルコースSigma-AldrichG7021
酵母抽出物Sigma-AldrichY1000
インスリンSigma-AldrichI0516-5ML
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma-AldrichP4333
BIS-TRISSigma-AldrichB4429
L-(−)-リンゴ酸Sigma-AldrichM7397
D-(+)-トレハロース二水和物Sigma-AldrichT0167
コハク酸Sigma-AldrichS9512
フマル酸Sigma-AldrichF8509
&-ケトグルタル酸Sigma-AldrichK1128
非熱不活化、子牛胎児血清(FCS)マイコプラズマとウイルススクリーニングBioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4E&K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
スクローSigma-AldrichS7903
フィブリノーゲン 牛血漿Calbiochem (Merck)341573-1GM注意:吸入、皮膚との接触、飲み込むと有害です。
ウシ血漿からのSigma-AldrichT9549注意:健康被害、手袋を使用
PDF、NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificカスタムメイド
の真空グリースSigma-Aldrich18405
35 mm皿、No.1.5 カバーガラス、ガラス径20 mm、コーティングなしMatTekP35G-1.5-20-C
コーニング ファルコン イージーグリップ ティッシュ カルチャー ディッシュフィッシャーサイエンティフィック08-772A
滅菌 500 mL ステリトップ-GP 33 mm ネジ付きボトル トップ フィルター、0.22 μmミリポアSCGPS05RE
ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルムデュポン200AテフロンFEPフィルム
Millex-HVシリンジフィルターユニット、0.45 &マイクロ;メートル、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌ミリポアSLHV033RS
Millex-GVシリンジフィルターユニット、0.22 &マイクロ;メートル、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌ミリポアSLGV033RS
3ウェルガラス解剖皿任意の会社
ファイン鉗子、サイズ5、デュモンファインサイエンスツール11254-20
タンデムスキャナー 逆TCS SP5共焦点顕微鏡、共振スキャナーとHyD光電子増倍管検出器付きライカマイクロシステム CMS GmbH
温度制御チャンバーライフイメージングサービスザ・キューブ &BOX温度制御システム、カスタム設計
のステージトップ湿度コントローラーライフイメージングサービス カスタムメイド
の水浸マイクロディスペンサー:ディスペンサー、拡張マイクロポンプMP6シリーズ、自動浸漬対物レンズコントローラーソフトウェアライカマイクロシステム CMS GmbH
SUMスタック作成および3D補正ドリフトプラグインImageJソフトウェア
10x 反復デコンボリューションAutoQuant および Imaris ソフトウェア
研究室ス 層流下での操作

参考文献

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