マウス骨髄前駆体 32D/G-CSF-R の増殖・分化細胞

造血幹・前駆細胞の人口の成熟細胞は、骨髄系 (好中球、好酸球、好塩基球、単球) から細胞を含む広い範囲から有機物を供給します。造血幹細胞の骨髄系細胞の生産を運転するプロセスはイエウサギと呼ばれ、十分な生産要求の変化への応答で成熟した骨髄系細胞がストレスと生物の適切な対処のための前提条件感染症や出血量などの条件。成熟した骨髄系細胞の分泌不足は、病原体、減らされた血凝固および他の生命にかかわる条件^1,の²を除去する無力をもたらすかもしれない。さらに、骨髄系開発の変化が急性骨髄性白血病 (AML)³などの造血器腫瘍に関連付けられてあります。細胞表面の受容器⁴、トランスクリプション要因⁵の変更された式の欠陥障害シグナリング経路⁶形成の突然変異のように、様々 な理由によってイエウサギの変化が発生する/遺伝子⁷、または⁸腫瘍サプレッサーの遺伝子の不活化の活性化。

様々 な方法は、骨髄性の開発を研究し、このプロセスで特定の遺伝子変異の影響評価開発されています。イエウサギを研究するために使用する一般的なアプローチは、初代培養細胞およびトランスジェニック マウスを含みます。これらのモデルは、生物学的関連性の高いデータの取得を許可する、しかし彼らは特定の制限があります。一次電池の使用細胞の限られた数および遺伝子発現とその後の生物学的または生化学的な分析を変更する可能性を絞り込む、文化の制限期間が発生します。トランスジェニック マウスは高価であり、生物学的正当性の合理的な程度を必要とします。さらに、体内モデルでの作業は、特定のプロセスの興味の遺伝子の役割を理解することの複雑さの程度を追加します。したがって、これらの制限を回避するために代替的なアプローチが必要です。細胞は疑う余地のない利点を持っている: (1) 彼らは生化学的・生物学的研究のための十分な材料を生成することができます無制限の増殖能力を持っている、(2) 彼らは (ノックダウン、ノックアウト、遺伝子操作を受けやすい過剰発現)、(3) コストは比較的低く、(4) 彼らは特定の実験的アプローチに必要な生物学的簡素化の程度を許可します。

親の IL 3 (インターロイキン-3) 依存 32D セルライン グリーンバーガーおよび同僚によって、友人マウス白血病ウイルス⁹C3h/hej マウス骨髄細胞の感染によって 1983 年に設立されました。いくつか 32D クローンは文献で記述されていた: cl 23⁹cl 3 の¹⁰、および cl 10¹¹。32D cl 3 細胞は IL 3 に増殖し、顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)¹⁰の治療に好中球に分化する示されていた。それどころか、もともとは G-CSF の治療に反応ながら IL 3 依存 32D の cl-10 セルを区別することがないです。1995 年に博士 Ivo Touw のグループは、この受容体¹¹の機能的に重要な領域を識別するために野生型と G-CSF 受容体 (G CSF R) の変異形 32D の cl-10 セルを遺伝子導入。本研究により IL 3 に同様に依存している、32D/G-CSF-R のセルの生成が、細胞が増殖、成熟好中球に分化する不可逆的停止 g-csf IL 3 の交換後 6 ~ 10 日以内。これらの特性は、32D cl 3 と 32D/G-CSF-R セル 2 つの明確に定義された成長と分化因子 - IL 3 と G-CSF によって変調することができますマウスの好中球分化の簡略化モデルを作る。最後の十年の間に複数のグループは、文化^12,13,14,15骨髄細胞の分化と増殖における特定の遺伝子の役割を研究するのに 32D/G-CSF-R セルを使用しています。^,16、G-CSF シグナル^17,18を検討します。重要なは、この細胞ラインを使用して得られた結果は、初代培養細胞およびトランスジェニック マウス^16,19,20,21で得られるデータと相関。したがって、この問題に対処する他の方法と並行して使用することができます骨髄性の微分を調査する貴重なシステムを表す 32D/G-CSF-R セル、広く使用され、確立されたモデルであると考えます。

ここでは、32D/G-CSF-R セル行の処理を説明する詳細なプロトコル、どのカバー拡大、分化およびこれらの細胞の分化・増殖の評価が表示されます。32D/-r-CSF G 細胞の遺伝の変更の詳細については、ウイルスの滴定のためのプロトコルと同様に、レトロ ウイルスやレンチ ウイルスの伝達によっていずれかが提供されます。また、32D/-r-CSF G 細胞の潜在的なアプリケーションを示すいくつかの代表的な結果が提供されます。

メモ: 手順は、拡張を記述する、分化および 32D/-r-CSF G 細胞の伝達以下に示します。

1. 準備

1. メディアの準備
   1. 250 mL の培養液の準備: FBS (ウシ胎児血清) とマウス IL 3 に 10% 熱 (ロズウェル パーク記念研究所) RPMI 1640 培が不活化 (10 ng/mL)。
      1. また、自家製の IL 3 を使用します。自家製 IL 3 を生成するには、IL 3 表現するベクトルを HEK293 細胞を変換し、IL-3 清²²を含むを収集します。
         注: 抗生物質、ペニシリン G など (100 IU/mL)、(100 μ g/mL)、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン (40 μ g/mL) は、特に明記しない限り、プロトコルのすべてのステップで, 培養細胞の使用できます。
   2. 分化培地 50 mL を準備: RPMI 1640 中 10% 添加した引受とヒト G-CSF (100 ng/mL)。
      注: しないすべての血清バッチ サポート 32D/-r-CSF G 細胞の分化 (重要)。実験開始前に、血清中の別のバッチをテストします。少なくとも 4 つの異なるバッチをテストし、最適な区別する 32D/G-CSF-R セルの能力に基づいて選択することをお勧めします。32D/G-CSF-R 分化プロトコルの以下を参照してください。
   3. 凍結培地 10 mL を準備: RPMI 1640 中 40% 添加した引受と 10 %dmso (ジメチルスルホキシド)。
2. レトロ ウイルスの生産
   1. Bosc23 細胞 (6 × 10⁶) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM (ダルベッコ変更イーグル培地) の 18 mL で育んでいます。
      注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。細胞数は、異なるメソッド (ここに示すプロトコルの残りの部分に有効) を使用して実行できます。サンプル数が少ない、場合 Bürker チャンバーを用いた顕微鏡下で手動カウントを推奨します。この場合、死んだ細胞の排除のためトリパン ブルー色素を使用します。セル 1:1 を混ぜて 0.4% トリパン ブルー PBS で。多くのサンプル数のカウントを実行するには、セルの自動カウンターを用いることができます。
   2. レトロ ウイルスの構造 (たとえば、MSCV) の 40 μ g、pCL エコ (包装ベクトル)²³の 20 μ g、PEI (ポリエチレンイミン) の 80 μ l と減少血清媒体 (例えばオプティ-MEM) 媒体 (抗生物質) なしの 2 mL を組み合わせます。部屋の温度 (RT) で 20 分のこの混合物を孵化させなさい。
   3. 16 ml の 2% を DMEM Bosc23 細胞中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。
      注: トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使わない。
   4. 1.2.2 で混合物を追加します。注意深く、Bosc23 滴文化と 37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性により 6 h 未満までのインキュベーションを制限します。
   5. インキュベーション後、Bosc23 媒体を 18 mL に変更 10% を含む DMEM を予め加温 FBS、37 ° C で 48 時間のための細胞を養うとバイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。
   6. 50 mL の円錐管に 25 mL の血清ピペットを使用して Bosc23 媒体 (含まれているマウス白血病ウイルスエンベ レトロ ウイルス粒子) を収集し、4 ° C で保存
      注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。
   7. 18 mL 加温 DMEM の 10% を追加 Bosc23 に FBS 細胞し、24 h の育成します。
   8. 1.2.6 のステップを繰り返します。
      注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば 1.2.6 1.2.8 からレトロ ウイルス上清をプールできます。
   9. ウイルス上清中に Bosc23 の汚染を避けるためには、4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピンします。分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、その作りたてのウイルスは凍結する在庫より感染効率の面で高品質。
      注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。
3. レンチ ウイルスの生産
   1. HEK293T (人間の萌芽期の腎臓の 293 t) 細胞 (6 × 10⁶) 16 cm シャーレで単一細胞懸濁液をプレート、FBS 文化の confluency まで 80% (24 h) に達すると 10% を含む DMEM の 18 mL で育んでいます。
      注: 細胞培養単分子膜やフォームではなく塊で成長してください。
   2. 15 μ g のプラスミド pCMVdR8.74 (ギャグ/ポル、12 μ g のエンコーディング) をパッケージ化 (pGhU6) などレンチ ウイルスの構造を組み合わせると pMD2.VSVG (VSV G、1.4 μ g のエンコーディング)、85.2 μ L PEI、(抗生物質) なし減少血清培地 2 mL。室温に 20 分間のこの混合物を孵化させなさい
   3. 2 %dmem の 16 ml HEK293T の中に慎重に取り付けます FBS。事前使用前に 37 ° C の中を温めます。トランスフェクション効率を減らすことができるので、トランスフェクション、時に抗生物質を使用しないでください。
   4. 慎重に 1.3.2 HEK293T 細胞培養への準備混合物をドロップし、37 ° C で 4 時間インキュベートプリンスエド ワード島の毒性を防ぐために 6 時間以内に潜伏期間を制限します。
   5. 18 mL に変更培地加温 DMEM の 10 %fbs と 37 ° C で 48 時間のための細胞を育成バイオ セーフティ レベル 2 の実験室で料理を配置、ここで、このステップから維持、標準的な安全手順に従ってください。
   6. HEK293T 媒体 (含む・ ロープ ・ レンチ ウイルス粒子) 50 mL コニカル チューブに 25 mL の血清ピペットを使用してを収集し、4 ° C で保存
      注: (重要) トランスフェクション効率は、高力価ウイルスを生成する 90% に達する必要があります。
   7. 慎重に予め温めておいた DMEM の 18 mL を追加し 10% FBS HEK293T 細胞へ。37 ° C で 24 時間を育成します。
   8. 1.3.6 のステップを繰り返します。
      注: ウイルスの整合性を維持するために同じ温度 (4 ° C) に達すれば、1.3.6 1.3.8 からレンチ ウイルス上清をプールできます。
   9. 4 ° C で 10 分間 1500 × g で収集されたウイルスをスピン HEK293T 細胞とウイルス上清の汚染を避けるためには、分注ウイルスは、ドライアイスや液体窒素を用いて凍結をスナップし、-80 ° C で保存ただし、凍結する在庫よりも感染効率の面で高い品質の作りたてのウイルスそれは注意してください。
      注: (重要) 避けるため繰り返し凍結/融解ウイルス、ウイルスの劣化につながるので。
4. GFP レポーターを含むウイルスの滴定
   1. シード DMEM の 300 μ L で 1 × 10 5/NIH 3T3 細胞 10 %24 ウェル プレートによくあたり FBS。7 つの井戸が 1 つのウイルスの力価が適用されます。
   2. 37 ° C でウイルスを解凍し、1、5、10、50、100、500 μ L のウイルスを NIH 3T3/文化に追加します。すべてのウイルスをネガティブ コントロールにも追加しません。37 ° C で 48 時間のウイルスの存在下で細胞を養う
   3. トリプシン/EDTA (エチレンジアミン四酢酸) の 30 μ L を使用して/NIH 3T3 細胞を収穫 (0.25% トリプシン、PBS で 0.01 %edta) 細胞の FACS (蛍光活性化細胞選別) 管で 250 μ L の PBS の場所と。
   4. 各サンプル²⁴フローサイトメトリーによる GFP⁺細胞の頻度を決定します。ヘキスト 33258 などの生存性色素の添加により死んだ細胞を除外します。
   5. (GFP⁺細胞のめっきされたセルの数と割合に基づく) GFP⁺のセルの合計数を計算してウイルス感染症用のボリュームに対してそれらをプロットします。
      注: (重要) 性感染症はウイルス大量が適用されるときに高原に達する。したがって、どの感染効率が線形の範囲 (例を表 1に示すように) 発生ウイルス濃度に基づいて価を推定することが重要です。GFP⁺細胞の数は、特定のウイルス量の機能性ウイルス粒子 (TU - 変換ユニット) の数を示します。TU の mL 数を再計算します。
5. ピューロマイシン レポーターを含むウイルスの滴定
   1. シード 3 mL DMEM に 5 × 10 4/NIH 3T3 細胞 10 %6 ウェル プレートのウェルあたり FBS6 井戸 1 つのウイルスの力価を採用してください。37 ° C で一晩文化
   2. 次の日は、表 2に示されているようにウイルスを希釈します。ウイルスを希釈に使用して予め温めておいた DMEM 10 %fbs。ボルテックスにかけないでください。
   3. NIH/3T3 細胞から培養液を外し、希薄ウイルスの 1 つの mL を追加します。
   4. 37 ° C で一晩インキュベートします。
   5. 優しくウイルス含有培地 2 ml に予め温めておいた DMEM の 10% を取り替える政府短期証券、37 ° C で一晩インキュベートし、
   6. 優しく NIH 3T3/媒体を 2 mL に予め温めておいた DMEM 10 %fbs 含むピューロマイシン (2 μ G/ml) に置き換えます。
   7. 37 ° C ・ ピューロマイシン 3 日おきに更新中慎重に、中が黄色の文化。
   8. 感染後 10-12 日、各ウェルから培地を吸引、PBS でやさしく洗浄します。
   9. クリスタル バイオレット溶液 (0.5% 20% エタノールと dH₂O でクリスタル バイオレット)、1 mL で常温では、2 分を汚し、慎重に PBS で 2 回洗います。
   10. 顕微鏡 (倍率 X4) 各ウェルに存在の青いコロニーをカウントします。コロニーを守らなければなりませんない負の制御にも。
   11. TU/ml の希釈倍率を考慮した数字の合計を計算します。

2. 拡張と 32D/-r-CSF G 細胞の維持

1. 32D/G-CSF-R セルが固定されている場合、因数を取ると雪解けの 1 分の 37 ° C の水浴のセルと直接に 10% に予め温めておいた RPMI 1640 培の 10 mL バイアルから細胞を注ぐ 15 mL チューブに FBS。反転チューブ 3 回し、400 × g にセルをスピンダウンは、上清を除去し、IL 3 0.3 × 10⁶セル/mL の濃度で含まれている培地の細胞を再懸濁します。
2. 最適な細胞成長濃度は 0.25 0.5 × 10⁶セル/mL。セルを分割する濃度 0.1 0.2 × 10 にそれらをもたらす 2 日ごと⁶セル/mL。
   注: (重要) 32D/G-CSF-R セルは部分的に 1 × 10⁶セル/mL 以上の濃度に成長した場合を区別するために彼らの能力を失う可能性があります。したがって、時間に 32D/G-CSF-R セルを分割するのに非常に重要です。
3. 必要に応じて、凍結し、-80 ° c または液体窒素中での時間の長い期間のセル因数を格納します。スピン ・ ダウン 3 × 10⁶細胞培養上清を削除し、凍結培地 1 mL で再懸濁します。-80 ° C で凍結容器にチューブを入れる長期保管のため液体窒素のセルの位置を変更します。

3. 32D/-r-CSF G 細胞の情報伝達

1. 0.3 × 10⁶セル/mL の濃度で 6 ウェル プレートにプレート 32D/G-CSF-R セルです。
2. 10 と 40 の間の MOI (感染症の多様性) に到達するウイルスの適切な量を追加します。
   注: 高い MOI は興味の遺伝子の発現の高いレベルと同様に、GFP⁺細胞の増加の割合になります。10; の MOI で 0.3 × 10⁶に感染するには、細胞の例。3 × 10⁶ TU 32D/G-CSF-R セルに追加する必要があります。
3. 最終濃度 8 μ g/mL に polybrene を追加し、37 ° C で 6 時間インキュベートまたは、スピン接種手順を実行: スイング バケツ ローターを用いた培養プレートに 30 ° C で 90 分 1200 × g で遠心し、37 ° C で 3 時間インキュベート
4. 収集細胞は 15 mL チューブに移し、5 分 (4 ° C) 450 × g でスピンします。
5. 上澄みを廃棄、6 ml の培地の小球形にされた細胞を再懸濁します、37 ° C でコート t25 フラスコ細胞培養用フラスコ、文化が、
6. 48 時間後に、細胞を収穫し、450 の × g で 5 分 (4 ° C) で、それらをスピンします。上清を捨てます。
7. GFP レポーターの場合: 流れの cytometry の選別機を使用して PBS と並べ替えの GFP⁺セルを 500 μ l 添加にセルを配置します。ベクターを含むピューロマイシン レポーターの場合: 2 μ g/mL ピューロマイシンを含む培養液中の細胞を配置。
8. さらなる分析と実験に必要なセルを展開します。
   注: (オプション) Transduced セルできます-80 ° C の凍結容器でメディアを凍結で冷凍、さらに液体窒素で保存します。

4. 32D/G-CSF-R セル拡散の試金

1. 増殖率場所 0.2 × 10⁶細胞培養培地 1 mL を評価し、37 ° C で一晩インキュベート
2. 次の日はセルの数をカウントし、0.2 × 10 の⁶セル/mL の培養液を使用しての濃度に戻るそれらを希釈します。37 ° C で一晩インキュベートします。細胞濃度および表 3を使用して毎日文化に適用される希薄の記録を保持します。
3. 増殖を評価する必要がある日数の 4.2 の手順を繰り返します。
   注: 増殖アッセイの長さは、興味の遺伝子の影響に依存します。強い表現型の場合 8-9 日は (参照してください図 3 a) 有意な効果を観察するための十分な可能性があります。ただし、軽度の表現型の場合、時間の長い期間は必要あります。
4. 表 3に示すように増殖曲線を作る、細胞増殖を評価します。

5. 32D/G-CSF-R 細胞分化アッセイ

1. 0.2 × 10⁶ 32D/G-CSF-R 細胞サイトカインなし RPMI 培地で 2 回洗います。
   注: 残留 IL 3 の存在が分化を阻害するので文化への G-CSF の添加前に洗浄のステップは重要です。
2. 細胞濃度 0.2 × 10⁶セル/mL (0 日目) の結果、24 ウェル/プレートで 1 mL 分化培地 (100 ng/mL、G-CSF を含む) にセルを配置します。37 ° C で一晩文化
3. 細胞/ml (ステップ 1.2.1) 上記の数をカウントします。
4. Cytospin 2 5 × 10⁴セル (76 mm × 26 mm) スライド ガラスに遠心分離機を用いた 20 × g で必要なアダプターです。
5. 24 ウェル/プレート (1 日) に 0.2 × 10⁵セル/mL の濃度で分化培地とプレート細胞を更新します。古い板を廃棄して続行するステップ 5.6 新しいプレートとの次の日。
6. 2 に 7 日 5.5 5.3 の手順を繰り返します。手順 4 で説明した G-CSF の存在下で細胞増殖を評価します。
   注: (重要) 分化、細胞増殖が遅く、したがって G-CSF の存在下で 3 〜 4 日後より高い濃度で培養細胞に十分です。
7. 細胞の形態に基づく 32D/-r-CSF G 細胞の分化状態を評価します。
   1. 常温 5 分のメタノールのステップ 5.4 からセルを修正し、風乾するスライドを残します。
      注: 0 に 7 日目からスライドすることができます RT に格納されているし、同時に固定します。同様に、彼らも保存できます RT で固定後より長い一定期間のため。
   2. 次の製造元のプロトコルを汚す 5 月グリューンヴァルト ギムザを使用してセルを汚します。
   3. 顕微鏡と X40 の倍率を使用して染色の細胞を可視化します。
   4. 爆発、中間分化した細胞は、および図 1と表 4で説明のイラストを使用して成熟した顆粒球の数を定量化します。

32D/-r-CSF G 細胞の増殖と分化

32D/G-CSF-R pro 増殖とプロの分化条件下で細胞の増殖を評価するために IL 3、G-CSF をそれぞれ含んでいる媒体で 32D/-r-CSF G 細胞を培養されました。IL 3 含む媒体 (10 ng/mL) で培養された細胞分割 (図 2 a) すべて 24 h 約であることが観察されました。徐々 に減速し、4 日 (図 2 a) 後停止の G-CSF (100 ng/mL) 増殖と IL 3 の交換に。さらに、5 月グリューンヴァルト ギムザ染色サイトスピン細胞を用いた G-CSF の存在下で培養された細胞の分化状態を評価しました。前日に 0 (G-CSF の治療の開始)、細胞提示未熟な骨髄芽球のような形状、大きな核と暗い細胞質 (図 2 b) によって特徴づけられることが示されました。治療の過程で、核の大きさが減少と月形に核変更やドーナツ形のシェイプ。さらに、細胞質は拡大され、ダーク バイオレット色が失われます。G-CSF 投与の 6 日後細胞は葉状の核と光紫の細胞質 (図 2 b) によって特徴付けられる、完全好中球の分化の兆候を提示します。32D/-r-CSF G 細胞の分化はないすべてのセルが正確に同じ速度で成熟した好中球に向かって進化、漸進的なプロセスです。(すなわち爆発、中間の分化細胞、好中球) の分化の過程でさまざまな段階で細胞の定量は図 2 bに示すように。

マウスのEvi2bノックダウン ブロック 32D/G-CSF-R 細胞における好中球の分化

EVI2B のダウンレギュレーションの (マウス白血病ウイルスエンベ ウイルス統合サイト 2 b) 32D/G-CSF-R セル、3 Evi2bで-(国道 2 号線、Sh3、Sh4) をターゲットと 1 を対象とした非サイレンシング コントロール (NSC1) Shrna を設計されていた;これらは GFP レポーター16を運ぶレンチウイルスベクターに複製されました。32D/G-CSF-R セル コントロールとEvi2b導入された-10 の MOI を使用して Shrna を黙らせます。導入後、2 日間 GFP+ (導入) 細胞の並べ替え, さらに実験のために拡張.しかし Sh2 効率的にレセプター EVI2B 蛋白質のレベルにことができなかった、従って付加的な制御として使用されたがここで参照される、Sh3 と Sh4 の 80% に達した EVI2B の枯渇に備えて非サイレンシング コントロール 2 (NSC2) として。導入後、4 日間は、G-CSF の存在下で分化と増殖アッセイを行ったし、 Evi2bダウンレギュレーションでこれらのプロセスの影響を検討しました。観察されたそのEvi2b-コントロール細胞 (NSC1 と NSC2) が低下して一日中 4 (図 3 a) 増殖に対し劣化細胞 (国道 2 号線、Sh3) が GCSF の存在下で細胞増殖を持続します。さらに、 Evi2b-沈黙 32D/G-CSF-R セル生産制御の細胞 (図 3 b) と比較して少ないの中間と成熟した好中球。著しく、貧しいEvi2bのノックダウン効率を示した、NSC2 で導入した細胞はまた成熟好中球 (図 3 b) の数のわずかな減少を示した。これらのデータは、最近公開された16だった。

BCR-ABL 融合タンパク質を損なう 32D/G-CSF-R 細胞における好中球の分化

それは、BCR-ABL 融合タンパク質が造血障害で急性期慢性骨髄性白血病25,26の結果骨髄前駆細胞の広範な展開を引き起こして、骨髄性の分化を損なうことを示されています。以前の研究は示した 32D cl 3 細胞に BCR-ABL の強制発現により好中球分化27,28のブロックされました。したがって、同様の結果を 32D/G-CSF-R セルラインでできたかどうかを調べた。32D/G-CSF-R セルが BCR-ABL またはコントロール MSCV レトロウイルスベクター GFP レポーターを運ぶ増殖型 (MOI = 20)。2 日後の伝達、GFP+細胞ソート, IL 3 含む培地で 2 週間の展開.次に、G-CSF の存在下で分化アッセイを行った。見ました (G-CSF 含む媒体にセルを転送する) 前に、日 0、MSCV 制御 BCR-ABL 32D/G-CSF-R セルを表現する提示と同様の形態、主に未熟な骨髄系細胞 (図 4) を表します。しかし、我々 は空のベクター中導入された制御の細胞を受けたと G-CSF の治療 (成熟好中球の 11.5%、中間の分化細胞の 56.4% を生産) の 6 日後の好中球分化ない実証成熟好中球BCR ABL 導入 32D/-r-CSF G 細胞 (図 4) から生成されました。一貫して、G-CSF の BCR-ABL 発現細胞の未熟なブラストの割合残った IL 3 条件で爆発の割合のようです。

図 1。異なる 32D/G-CSF-R の代表的なイメージの細胞形態。32D/G-CSF-R 細胞形態学的爆発として分類することができます、中間分化細胞と成熟好中球。説明は、表 4を参照してください。

図 2。32D/-r-CSF G 細胞の増殖・分化します。(A)媒体を含んでいる 10 ng/mL IL 3 (黒線) や 100 ng/mL G-CSF (青線) の 32D/GCSFR 細胞の増殖。X 軸は、治療の日を表します。Y 軸は対数 (ログ2) に示すように、セル × 105の数を示します。結果は、3 の独立した実験の平均を表します。エラーバーは標準偏差を示します。32D/G-CSF-R 細胞 G CSF 含有培地 (100 ng/mL) の(B)分化。上部のパネルにパイ プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間の差別化細胞 (ピンク)、好中球 (赤) 0、2、4 後の文化と G-CSF の治療の 6 日。下部のパネルにはからそれぞれサイトスピン細胞の代表的なイメージが含まれています時間ポイント 5 月グリューンヴァルト ギムザ染色します。100 セルの最小値は、各時点の評価されました。

図 3。Evi2bのサイレンシング 32D G CSF R 細胞における好中球の分化をブロックします。(A) Evi2bの増殖-沈黙 (オレンジ色の線) とコントロール (黒線) 32D/G-CSF-R セル 100 ng/mL G-CSF 含む中。X 軸は、治療の日を表します。Y 軸は対数 (ログ2) に示すように、セル × 105の数を示します。結果は、3 の独立実験の代表的な結果を示しています。Evi2b増殖型 32D/-r-CSF G 細胞の分化(B)評価-5 月グリューンヴァルト ギムザ染色サイトスピン セルを使用して G CSF を含む培地 (100 ng/mL) で黙らせるとコントロールの Shrna。上部のパネルにパイ プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間の差別化 (ピンク) 細胞と好中球 (赤) 文化。下のパネルには、サイトスピン細胞の代表的な写真が含まれています。分化は、分化 7 日目に評価しました。少なくとも 100 セルは、条件ごとに評価しました。

図 4。BCR-ABL 融合蛋白の過剰発現を損なう 32D/-r-CSF G 細胞の分化します。32D/-r-CSF G 細胞の分化の評価は、コントロール MSCV または G CSF 含有培地 (100 ng/mL) に BCR-ABL 融合遺伝子を導入しました。上部円プロット (黒) の芽球の割合を示す、中間分化の日 6 (ピンク)、細胞および好中球 (赤) は区別されます。下のパネルは、サイトスピン セル 5 月グリューンヴァルト ギムザ染色の代表的な画像を表示します。少なくとも 100 セルは、各時点の評価しました。

テーブル 1。ベクトルを含む GFP レポーターのウイルス価決定。MSCV レトロ ウイルスと計算で得られるデータの例は、ウイルスの力価を推定する実行します。ウイルス力価はウイルスの特定の量が適用されたときに取得した GFP+セルの数に基づいて計算されます。ウイルス感染のために採用の量は線形相関測定 GFP+細胞の割合でなければなりません。TU: は変換ユニットです。

表 2。ベクトルが含まれるピューロマイシン記者のウイルス価決定。

著者が明らかに何もありません。