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方法論記事

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

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DOI:

10.3791/57038

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2018年2月26日

 ,  ,  , 
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

この記事について

サマリー

血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。

要約

血液脳関門 (BBB) は、毒素や病原体循環から脳微小環境を保護し、脳の恒常性を維持する特殊なバリアです。バリアの主な場所はタイトジャンクショ細胞間と細胞膜に発現排出トランスポーター起因するバリア機能が脳の毛細血管の内皮細胞です。この関数は、ペリサイトおよび単位 (NVU) を形成しているアストロ サイトによって規制されています。脳卒中、アルツハイマー病 (AD) などいくつかの神経疾患脳腫瘍は BBB 機能障害に関連付けられます。BBB 透過性の評価は神経疾患の重症度と治療戦略を採用の成功の評価に重要なため。

いくつかのマウスに正常に適用されている堅牢な透磁率測定モデル遺伝的および実験両方まだここで単純なを提示します。メソッドは、定量性は一般的に適用される顕微鏡によるトレーサー蛍光分析と比較して客観的にです。このメソッドは、マウスはマウスを麻酔続いて水性の不活性蛍光トレーサーのミックスと腹腔内注入されます。動物の心臓の血流は、脳、腎臓や他の臓器を収穫する前に実行されます。臓器の均質化し、遠心上清からの蛍光測定が続きます。直前に灌流心臓穿刺から採血血管コンパートメントに正規化の目的提供しています。組織蛍光が量的に入手するぬれた重量および血清蛍光に正規化されたトレーサー透磁率インデックス。追加の確認のため蛍光可視化用トレーサー対側の半脳免疫組織化学のために保存を利用できます。

概要

血液脳関門 (BBB) は、基底膜の鞘は、密接に関連するペリサイト (Pc)、および自分の終わり足の1 で基底膜を包むアストロ サイト (ACs) でサポートされている微小血管内皮細胞 (Ec) で構成されています ,2。ECs は、いくつかの細胞の種類をサポートし、主に ACs と Pc、バリア機能を調節すると対話も神経細胞とミクログリア、すべての一緒にユニットを形成、神経血管 (NVU)。NVU は、血液媒介性毒素や脳を入力してから病原体の輸送を制限する BBB の機能にとって重要です。この関数は、ECs ともトランスポーター p 糖タンパク質 (P ・ gp) その流出内皮を入力分子に戻すなどの操作のために存在するクローディン 5, オクルーディン, 精巣毛細血管-1, などタイト結合分子の結果1,ルーメン32,船。ただし、BBB は EC 膜1,2,3で表現される特定のトランスポーターで栄養 (ブドウ糖、鉄、アミノ酸) など重要な分子の輸送のためできます。EC 層は内腔 (血側) と特定とベクトル輸送機能報4,5 ように abluminal (脳向け膜) の間様々 なトランスポーターの分布に関して高偏極します。.BBB は中枢神経系の環境をしっかりと規制に関して保護、機能 BBB とパーキンソン病などの疾患に CNS ドラッグデリバリーのための大きな課題です。BBB 機能障害神経疾患でもバリア機能障害はアルツハイマー病 (AD) のように、例えば特定のトランスポーター ターゲットへの損傷を含めることができます、特に脳薬物送達が増加することを想定できません。広告で LRP1、怒り、P gp などいくつかのアミロイド β のトランスポーターが調節不全として知られている、無駄な6,7、8をかもしれないそれ故にこれらの運送者を対象とします。BBB は、ストローク、広告、髄膜炎、多発性硬化症と脳腫瘍9,10,11などのいくつかの神経疾患の障害です。治療戦略の重要な部分は、バリア機能を回復させる、従ってその評価は重要です。

この仕事については客観的かつ我々 正しく適用されているマウスのいくつかの行に両方実験的な遺伝子疾患モデル10,12,13 齧歯動物で透水性の試金のための量的なプロトコル ,14。メソッドは、血管コンパートメントからトレーサーを削除するマウスの灌流が続く蛍光トレーサーの単純な腹腔内注射に基づいています。脳や他の臓器が収集した記事の灌流および透水性の客観的評価と蛍光プレート リーダーで組織ホモジネートの測定に基づく絶対透磁率インデックス。組織ホモジネートまたは任意のトレースを受け取りません偽動物からの血清を使用して背景のすべての未加工の蛍光値が修正されます。十分な正規化は、血清量、血清蛍光組織、従って絶対と同等の実験と組織型との間にある透過性インデックスを降伏の重量に含まれます。グループ間の比較を容易にするため絶対浸透率のインデックス値容易に変換できる比率と我々 は以前に12を実行していた。同時に、ストアド ヘミ脳や腎臓に利用できる可視化トレーサー蛍光顕微鏡10。古典的な蛍光顕微鏡とはいえ面倒な切片と半定量分析のためのイメージの主観的な選択のために透磁率の地域差を取得する価値があります。プロトコルの詳細な手順が表示されます、適切な場所にノートが追加されます。これは、他の小動物にスケーリングすることができますマウスの体内透過性アッセイを正常に実行するために必要な情報を提供します。アッセイは、トレーサーの多くの種類に適用できる特異的な蛍光スペクトルとトレーサーの組み合わせによって透過性評価に基づいた料金とサイズを可能にします。

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プロトコル

すべての動物は、処理中に痛みや不快感を最小限に抑え最大限大切に取り扱われました。この手順では、当院の動物医療のガイドラインに従って、(承認番号 FK/1044 Regierungspraesidium ダルムシュタット) のローカル委員会によって承認されています。

マウスにおける透過試金の生体内でのための作業手順の概略を図 1に示します。各手順の詳細は次のとおりです。

1. 動物取扱

  1. 準備およびトレーサーと麻酔薬の投与
    1. 透磁率測定前日の埋め込み、少なくとも組織のラベルの付いたチューブと金型を準備します。きれいな発煙のフードの下で働いて、80% エタノールで洗浄ツールを使用して、プロトコルの中で無菌状態を維持します。現在のプロトコルのための 3-6 ヶ月の成熟した大人の年齢層の男性または女性の野生型 (WT) またはアンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) の CD1 マウスを使用します。10を前述のようにマウスのジェノタイピングを実行します。
      注: 80% アルコール滅菌器具にはなりませんが、試料の汚染を最小限に抑えられます。
    2. 2 mM 株に滅菌 PBS ですべてのトレーサーを希釈し、-20 ° C で光から保護因数を格納
    3. (テトラメチル ローダミン) TMR などのトレーサーを選択し、(かに) 個別励起/蛍光スペクトルとの FITC は、蛍光顕微鏡による色素間の干渉を最小限に修正可能なリジン (TMR を使用してまたはFITC フィルターそれぞれ)、蛍光測定透水性測定用のプレート リーダー。
      注: TMR デキストラン 3 kD FITC デキストラン 3 kD 研究に使用修正可能な両方のリジンおよびそれ故にされる可能性がありますもとアルデヒドの免疫組織化学的解析ポスト固定の地域差を調査するために。
    4. すべての動物を介護施設ガイドラインに従い細心の注意をもって処理します。1:1 の混合10,13各トレーサーの 100 μ L を使用して追加のトレーサーを組み合わせた場合、200 μ L まで増やすことができます 100 μ L トレーサー ソリューションで各マウス腹腔内を挿入します。トレーサー蛍光バック グラウンド減算の偽コントロールとしてではなく単独で PBS で少なくとも 1 匹の動物を注入します。
    5. トレーサー注入後 5 分麻酔のケタミン ・ キシラジン i.p 注入と動物 (100 mg と 5-10 mg 0.9% で本体重量 kg あたり生理食塩水重量、それぞれ 25 g マウスあたりカクテル 150 μ L)。
      注: 獣医軟膏適用されませんでした目のプロシージャの間に動物の麻酔と灌流/犠牲間の期間は短かったと (10 分) が観察場所目の任意の乾燥はなかった。
  2. 血のコレクションおよび心臓の血流
    1. 心筋灌流 10 分局所麻酔薬投与後の動物を準備します。動物の麻酔外科平面に達したことを確認するために足けいれん反応がないことを確認してください。
    2. 自分の背中に動物を置き、80% エタノールを腹部の皮膚に適用されます。小さなハサミを使用して、胸郭のすぐ下に小さな切開 (2 cm) で腹壁を開きます。横隔膜から肝臓を分離し、ゆっくりと横隔膜の胸腔内15の公開を切り取ります。
    3. 両側に胸郭をカットし、左心室を公開するためにカットの胸骨を修正します。左心室の後部の蠕動灌流システムに接続されている 21 ゲージ蝶針を挿入します。
    4. 右心房を穴をあけるとすぐに (10 s) 血清採血管に血液 (と最後カットオフ) 1 mL ピペット チップを使用して胸腔内に放出の 200-300 μ L を収集して氷の上保存します。
      注: この灌流プロシージャは非生存です。
    5. 血液を収集すると、すぐに灌流システム (10-12 rpm, 5 mL/分) に切り替えるし、暖かい (RT) 1x PBS で 3 分のための動物を灌流 (Ca の無料2 +/Mg2 +イオン)。
      注: PBS 含んでいる Ca2 +/Mg2 +イオンはより良い心臓の活動の灌流中に利用できます。灌流に使用される PBS の合計量は 15 〜 20 mL の範囲内です。
    6. 肝臓の色に注意して灌流品質を評価する腎臓灌流後ホワイト/ペールに表示されます。
      注: 腎臓や肝灌流必ずしも大動脈から脳が特に心房穿刺中に手順 3 で準備中に破裂を得る動脈 (頸動脈・椎骨) 到達として脳血流。

2. ティッシュの処理

  1. オルガン コレクションとストレージ
    1. 灌流末、頚部転位と収穫脳と腎臓によって動物の死を確認します。脳血流を脳 (髄膜の血管で目に見える血) の色によって灌流の品質が良い場合、透磁率の解析から動物を除外するを確認します。メス (図 1) を使用して 2 hemibrains に脳を分けます。
    2. メスの 1 つ hemibrain の嗅葉と小脳の無料で解剖し、大脳半球を 2 mL チューブに転送します。小脳の透水性評価に必要な場合、その他のチューブでヘミ小脳を格納します。
    3. 1 つの腎臓を別の 2 mL チューブに転送します。ドライアイスにサンプルをすぐに保存します。
    4. 組織-tek 社最適切削温度 (O.C.T) ドライアイスの化合物で残りの腎臓とヘミ脳 (小脳と嗅葉から成る) をネイティブで埋め込みます。
    5. 最終的には、遠心分離機の 10、000 g、4 ° C で 10 分間で血清採血管で氷の上保存血液サンプル血清培養上清を 1.5 mL チューブに転送し、ドライアイス コンテナーに配置します。
    6. さらに処理まで-80 ° C の冷凍庫にドライアイスで収集されたすべてのサンプルを転送します。
      注:、凍結融解後の均質化効率の増加として均質化の手順に進む前にサンプルを凍結することが重要です。
  2. 均質化および遠心分離
    1. 氷-80 ° C でダウン凍結ヘミ大脳と腎臓のサンプルを解凍し、臓器を含むチューブの重量を量る。これらの重みから組織重量を得るためのいくつかの空管 (約 20) の平均値を減算します。追加 300 μ L、200 μ L 冷 1 の腎臓とヘミ-大脳をそれぞれ含むチューブ X PBS。
      注: (ヘミ小脳、100 mg 以下) のような組織の量を減らすため個々 のチューブを計量することをお勧めします。
    2. 約 15 ストロークを実行することによって電気のオーバーヘッド攪拌 (1, 000 rpm) に接続されているポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 杵と元エッペン チューブ内の各サンプルを均質化 (1 ストロークを 1 と 1 を =)。サンプルの間に PBS で杵を洗い、次のサンプルに進む前に乾燥拭いてください。
      注: 螢光を潜在的な干渉により均質化時に洗剤の使用を避けた。ただし、組織を徹底的に均質化、1 つのラウンドの凍結融解後、どちらがより効率的に細胞内のトレーサーがこのプロトコルで検出されたも。
    3. 光と卓上遠心分離機で 4 ° C、20 分 15,000 g で最後にすべて一緒に遠心から保護されている氷の上の均質化のサンプルを格納します。即時蛍光または後で解析する-80 ° C で氷の上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
  3. 蛍光測定と定量化
    1. 前の手順の最後に固定されている場合は、氷の上箔と光から守り-80 ° C で保存組織培養上清、血清サンプルを解凍します。
    2. 黒 384 ウェル プレートに希釈血清 (30 μ L 1 × PBS + 20 μ L の血清) または組織培養上清 (として) の 50 μ L をピペットします。適切な背景差分を確保するため血清および組織培養上清の偽動物から少なくとも 1 つのサンプルは、この組織ホモジネートの背景は通常希釈剤として使用される PBS のそれより高い。
      メモ: 3 偽動物の平均は偽蛍光値 (データは示されていない) に非常に小さな変動が観察されたが、自発に使用できます。また脳サンプルなど低蛍光サンプルの信号対雑音比を高めることができる PBS で希釈して使用される血清の量を減らせます。40 μ L の PBS で希釈し最大 10 μ L の血清を調べた。泡が井戸に存在しないことを確認します。
    3. 384 ウェル ブラック プレートをプレート リーダーに挿入し、蛍光測定を選択する新しいスクリプトを開きます。
    4. ゲインを最適に設定し、それぞれ TMR や FITC dyee の 550/580 または 490/520 の励起/蛍光 (nm) の値に使用生蛍光ユニット (RFUs) を取得する測定を開始します。
    5. プレート リーダーから未加工の蛍光ユニット (RFUs) を使用して、対応する偽値を差し引いた透磁率指数 (PI) を計算します。
      1. * 透水性インデックス(mL/g)= (組織 RFUs/g 組織重量)/(血清血清 RFUs/mL)
    6. 例の計算脳透磁率指数 (PI) 動物 GOF1 (表 1):
      1. GOF1 脳 RFUs - 偽脳 RFUs 154 22.5 を = = 131.5
      2. GOF1 血清 RFUs - 偽血清 RFUs 38305 27 を = = 38278
      3. 脳の重量 (g) = 0.195
      4. 血清量 (ml) = 0.02
      5. 脳の透過性インデックス (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        注: 透磁率指数の計算は、絶対と同等の実験と組織型との間にある値を得られます。これらはしかし 2 グループ12間の比較の容易さのための比率として表示できます。1 まだ維持間の動物変化対照群をコントロール グループ平均を運転、制御グループの平均 PI と両方のグループで各動物の PI を割ることによってこれを実現できます。この変換は、1 に設定されて、コントロール グループを基準にして実験的グループ (またはグループ) の値を提供します。
  4. トレーサーの蛍光可視化
    1. クライオスタットのセクションは-20 ° C に設定し、室温で置かれたスライドをセクションを転送 10 μ m に組織-tek 社化合物 (O.C.T) (ステップ 2.1) でネイティブに埋め込まれた腎臓/ヘミ-脳ブロックをカットします。セクション乾燥 (約 30 分)、一度転送は使用するまで-80 ° C のフリーザーにスライドします。
    2. 染色の日に 10 分、37 ° C でスライドを解凍し、PBS でクイック洗濯後室温で 10 分間 4 %paraformaladehyde (PFA) のセクションを修正します。
    3. 室温で 1 時間 0.5% トリトン X-100 pH 7.5 1 %bsa を含む滅菌 PBS の透過/ブロック バッファーのセクションを孵化させなさい。
    4. CD31 一次抗体と室温で 1.5 h のスライドを孵化させなさい (0.5 mg/ml、クローン メック 13.3)、トリトン X-100 (pH 7.2) PBS の 3 つの 5 分洗浄後滅菌 PBS、0.5% BSA 0.25% を含むバッファーの 1: 100 で希釈しました。
    5. 蛍光標識抗体希釈 1: 500 (2 mg/mL) の種特異的に室温で 1 時間上のバッファーの二次抗体の孵化を実行します。CD31、1: 500 の希釈でヤギ抗ラット 568 アレクサやアレクサ 488 を使用できます。DAPI を含める (300 μ M) 二次抗体で、核を染色する (1:1、ストックから 000 希釈) をミックスします。
    6. アクア polymount とステンド グラスのセクションをマウントし、暗闇の中で常温で重合のために一晩置いておきます。
    7. スペクトル イメージング共焦点レーザー スキャン顕微鏡システムを使用して画像を取得します。NIS 要素ソフトウェア (バージョン 4.3) によってイメージを分析します。モンタージュの数字の生成のため、Photoshop などのソフトウェアを使用できます。

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結果

我々 は最近、アンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) マウスではある健康の条件10の高いコントロール マウスより脳血管透過性を示しています。脳卒中誘発マウス、GOF マウスが大きな梗塞サイズは、コントロールの同腹子より大きな透磁率を持っていたことを示していますがだった。これらの結果は、BBB で透磁率にアン 2 の重要な役割を表示します。プロトコルは、GOF マウスを利用したがって、体内透過試金を記述する同腹子を制御するそれらを比較します。ただし、このメソッドは、疾患モデル、遺伝子組換えマウスの任意のモデルに適用することができます。 または BBB 透過性を変更我々 は、 10、11,12,13では以前と同じ治療薬。

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ディスカッション

血液脳関門の機能障害は、プライマリとセカンダリの脳腫瘍や脳卒中を含む神経疾患の数に関連付けられます。BBB 破壊はしばしば命にかかわる中枢神経浮腫を関連付けです。開始の分子機構の解明や BBB の閉鎖したがって神経疾患一般の治療的意義の調査の研究者。ただし、調査方法は蛍光画像17,18の面倒で主観的な定量化に依存する技術的な問題に関連付けられている、BBB 透過性体内の報告は本邦では、します。,19します。 さらに、メソッドのいくつかは、それはより堅い障壁を形成しない表面的な脳血管の透過性を示すものとして虚偽は全脳蛍光イメージング。動物は多くの場合重要な血液分画による誤った解釈につながる灌流客観的脳組織吸光度 (例えばエバンス ブルー透過性評価) に基づく定量化が実行されているときでも。脳の重量は、透磁率の計算に含まれていない多くの場合、血管透過性に起因する浮腫、重量が増加し、純の透過性を変更する必要があります別の変数です。さらに、セ...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

著者は、この作業を支援する Leduq 財団によって資金を供給 Sphingonet コンソーシアムを認めたいと思います。この作品も「血管分化と改造」共同研究センターによって支えられた (CRC/Transregio23、プロジェクト C1) と 7。FP、COFUND、ゲーテ国際ポスドク プログラム移動で、291776 号の資金。我々 はさらに処理および遺伝子型解析マウスと彼女のテクニカル サポートのキャサリン ・ ソマーを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
テトラメチルローダミン(TMR)デキストラン3kDサーモスフィッシャーD3308
オレセインイソチオシアネート(FITC)デキストラン3kDサーモスフィッシャーD3306
タミン(ケタベ)ゾエティス
キシラジン(ロンプン)バイエル
0.9%生理食塩水フレゼニウスカビドイツGmbH
1X PBSGibco10010-015
Tissue-tek O.C.T化合物Sakura Finetek4583
37% ホルマルデヒド溶液Sigma252549-1L4% 溶液
牛血清アルブミン、フラクション VRoth8076.3
Triton X-100SigmaT8787
ラット抗 CD31 抗体、クローン MEC 13.3BD Pharmingen553370
ギ抗ラットアレクサ568分子プローブA-11077
ギ抗ラットアレクサ488分子プローブA-11006
DAPI分子プローブD1306
アクアポリマウントポリサイエンス株式会社1860621
ゲージバタフライニードルBD387455
血清コレクションチューブSarstedt41.1500.005
2mL eppendorf tubesSarstedt72.695.500
Kimtech精密ワイプ ティッシュワイパーKimberley-Clark Professional05511
384ウェルブラックプレートGreiner781086
スライド スーパーフロストプラスThermoscientificJ1800AMNZ
PTFE 乳棒ウィートン358029
電動オーバーヘッドスターラーVWRVWR VOS 14
プレートリーダーTecanInfinite M200
CryostatMicrom GmbHHM 550
Nikon C1 スペクトルイメージング 共焦点レーザー走査型顕微鏡システムニコン
蠕動灌流システムBVK Ismatec
超小型遠心機eppendorf5415R
フルケヤヤ

参考文献

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