マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

サマリー

この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。

要約

膵島はランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターである。この島は主に5種類のホルモン分泌細胞から成っている:α細胞分泌グルカゴン、β細胞分泌インスリン、δ細胞分泌ソマトスタチン、ε細胞分泌グレリン、およびPP細胞は膵臓ポリペプチドを分泌する。島内の細胞の60~80%はβ細胞であり、インスリン分泌を研究する最も重要な細胞集団である。膵島は、排外インスリン分泌を研究するための重要なモデルシステムです。高品質の島を取得することは、糖尿病の研究のために非常に重要です。ほとんどのイヌレット分離手順は、コラゲナーゼ注射、過酷で複雑な消化手順、および多重密度勾配精製ステップの部位へのアクセスを技術的に困難にする必要があります。本論文では、詳細な説明と現実的なデモンストレーションを用いて、単純な高収量マウス島分離法を特徴とし、以下の具体的な手順を示す:1)ヴァーターのアンプルでのコラゲナーゼPの注入、膵管に接合する小さな領域と一般的な胆管、2)外分泌膵臓の酵素消化および機械的分離、および3)単一の勾配精製工程。この方法の利点は、Vaterのよりアクセスしやすいアンプルを使用した消化酵素の注入、酵素と機械的アプローチの組み合わせを使用したより完全な消化、およびより単純な単一勾配精製ステップです。このプロトコルは、マウスあたり約 250 ~ 350 の島を生成します。そして島は様々な生体内研究に適している。この手順の可能な注意点は、酵素消化および/または長時間の勾配インキュベーションによる潜在的に損傷した島であり、そのすべては、インキュベーション時間の慎重な広告正当化によって大きく回避することができる。

概要

膵島の単離のための文献には2つの一般的な方法があります。一つは、膵臓を切除し、外科ハサミを使用して小さな部分にそれをダイシングし、その後、コラゲナーゼ溶液1、2、3でそれを消化する必要があります。もう一つのより正確な方法は、消化酵素を導入するために膵臓に存在するダクトのネットワークを使用することです。以下の部位は、消化酵素注射に使用されている:胆汁と嚢胞性ダクトの接点、一般的な胆管への胆嚢、または一般的な胆管自体1、4、5。膵島は膵臓に均等に分布しないことが知られています。脾臓領域は、最も島6が含まれています。消化酵素を送達するために解剖学的経路を使用する第2の方法は、脾臓領域を含む膵臓のより完全な灌流を可能にするが、この手順は、多くの場合、技術的にであるVaterのアンプルのクランプまたは縫合を必要とする挑戦。島の精製に関しては、複数の密度勾配、ならびに細胞ストレーナーおよび磁気引き込みが島3、7を浄化するために使用されてきた。これらのグラデーションの使用は時間がかかる可能性があり、Ficollグラデーションは島8の有毒な損傷をもたらす可能性があります。

現在のプロトコルは、Li et al.⁷によって記述された方法に基づいて構築され、自分自身^{および他の}1^,4の経験に基づいて追加の変更が追加されます。私たちのプロトコルの最も重要なステップは、肝臓の端近くの一般的な胆管のクランプ、外分泌組織を消化するためにVaterのアンプルを介してコラゲナーゼPを注入し、その後、機械的に消化を促進するために振る水浴を使用しています^{1, 4,7}.その後、'STOP'溶液は、島のさらなる消化を阻害するために適用されます。HBSSは、残りのコラゲナーゼPおよびSTOP溶液を洗い流すために使用される。Ficoll法を用いてヒトの島を精製した場合、収量はPercoll勾^配9の使用と比較して、より大きな機能能を有する島(例えば、インスリン分泌)の2倍であると報告された。しかし、研究は、島1、10に対するその毒性効果のためにフィコル勾配の使用に疑問を持っています。ヒストパク勾配は、マウス島の単離に最適な精製運動を提供し、より簡単なステップと^{低コストの}高品質の島の良好な収率を生み出すと報告されています。我々のプロトコルでは、ヒストパク-1077は、他の残留組織8、11から島を浄化するために使用される。収穫された島は、完全なRPMI-1640培養で培養することも、RNA/タンパク質定量で直接利用することも可能です。

我々のプロトコルは、コラゲナーゼP消化と単一の勾配精製ステップの組み合わせを使用して、他の公開されたプロトコルよりも簡単です。私たちの方法は、厳しい外科的処置を必要とせず、わずか数回の簡単な手順を持っています。さらに重要なことに、このプロトコルは、12を報告したように、一貫して高品質の機能島(250-350/マウス)の良好な収率を生成します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、テキサスA&M大学の動物ケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています。手術ツールの必要性を図1に示し、手順の概略図を図2に示します。

1. ソリューション

1. ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を100mLの10X HBSS(在庫から)に900mLの蒸留水を加えて1L HBSS(1X)を作ります。
2. 100X胎児牛血清(FBS)の50 mLを氷冷1X HBSSの450 mLに加えることによって、STOP溶液を準備する(新鮮にし、1時間以内に使用する必要があります)。これは500 mL STOPの解決を作る。STOP溶液を4°Cに保ちます。
3. コラゲナーゼP溶液を氷冷1X HBSSに1mg/mLのコラゲナーゼPを加えることで、コラゲナーゼP溶液を調製する(使用してから1時間以内に新鮮にする必要があります)。6 mL/マウスを使用します。
   1. コラーゲンナーゼP溶液に0.05%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を加えます(これは単離された島に栄養素を提供します)。例えば、6 mLコラゲナーゼP溶液に3mg BSAを用いる。氷の上に保管してください。
   2. 1つの50 mLチューブ内のすべてのマウスに必要なコラゲナーゼPの量を計算し、調作する。
4. 10%FBSを追加することにより、完全なRPMI 1640媒体を準備し、 100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、INS-1細胞サプリメント(10 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、および0.05 mM 2-メルカプトエタノール)~5Mを含有する500mL RPMI 1640培糖物一晩の培養とインキュベーションのために。

2. 準備

1. 25 mL RNase阻害溶液の3つの50 mLチューブを充填し、70%エタノールまたは蒸留H2Oを充填する。これらの解決はプロシージャの前および間に外科用具をきれいにするために使用される。
2. プロトコルを開始する前に、RNase阻害ソリューションのツールのヒントを30分間浸します。これにより、ツール上の潜在的な RNase が排除されます。
3. 手術中に使用するためのサイズで6に6に事前カット吸収パッド。
4. 1X HBSS溶液を事前に準備し、4°Cで保存します。手術前にSTOPソリューションを準備します。4 °Cで保存します。
5. 手術の直前にコラゲナーゼP溶液を準備し、氷の上に保存します。
   注:これは準備の2時間以内に使用する必要があります。
6. 消化および精製のためのラベル 50 mL チューブ;各マウスのための2つのチューブを準備し、1つは消化用、もう1つはイレット精製用です。動物 ID が両方のチューブにあることを確認します。
7. 最初の50 mLチューブにコラゲナーゼP溶液を3mL加えます。残りの3mLのコラゲナーゼPを注入する。
8. 残りの3mLのコラゲナーゼ溶液を、30G 1/2を針に取り付けた3mLシリンジに引き込みます。注射器を氷の上に置く。

3. 手続き

1. RNase阻害溶液からすべてのツールを取り出し、その後、70%エタノールでチューブに最初に浸し、次に蒸留H2 Oを含むチューブに浸し、次にきれいなペーパータオルでエアドライ。
2. マウスが深く麻酔されるまで、0.5 mLのイソムランを含むチャンバーにマウスを置きます。
3. チャンバーからマウスを取り出し、鉗子でフットパッドをつまんで麻酔の状態を確認します。深い麻酔は、呼吸が着実に遅くなり、マウスが足のつまみに反応しなくなるという観察に基づいています。マウスが深く麻酔されたことを確認した後、子宮頸部脱臼でマウスを安楽死させ、吸収性パッドにマウスを置きます。
   1. 麻酔マウスを胃の上に置き、首に圧力をかけ、尾を引っ張って脳から脊柱を脱臼させる。
4. マウスの手足を吸収パッドにテープで留め、70%のエタノールで体にスプレーし、余分なエタノールを拭き取ります。
5. 切開を行うためにカバーガラス鉗子と湾曲した外科はさみを使用してください。まず腹部の皮膚に水平切開を行い(約3センチメートル)、腹壁を露出させるために皮膚を大きく開く。次に、腹腔内の膵臓を完全に露出させるために、腹腹膜に垂直切開(〜3〜4cm)を行う(図3)。
6. 胆管を露出させる肝臓の葉を優しく押すと、淡いピンクのチューブとして現れます(図3)。
7. 腸を腹腔の右腰椎/腸の領域から右に慎重に動かし、胆管と肝動脈を露出させる(図3)。
8. シュワルツマイクロセレファイン(図1)を使用して、一般的な胆管をできるだけ肝臓に近づけて慎重にクランプします。
9. 膵管と一般的な胆管の組合によって形成された十二指腸乳頭に位置するVaterのアンプルラを同定する。一般的な胆管への入り口である解剖顕微鏡下で見ると、Vaterのアンプルが腫れて現れる(図4)。
   注:解剖顕微鏡の光の強度/角度を調整すると、見つけやすくなります。
10. コラゲナーゼP溶液の3mLで注射器をヴァーターのアンプルに挿入します。図5に示すように、一般的な胆管の長さの約1/4の針をダクトに押し込む(アンプルアはダクトに導く)。
11. 針がアンプルに入ったら、針の向きがダクトと平行になるようにしてください。
12. マイクロAdson鉗子で締め付け、ダクトに穿刺されないようにして針を安定させる(図5)。
13. 図6に示すように、シリンジからコラーゲナーゼP溶液の3mLを一般的な胆管(抵抗を感じるのに十分)にゆっくりと着実に注入する。目標は、コラゲナセが膵管に入るように強制的に逆流圧力を作成することです。膵臓の頭部、首、体および尾部の領域がすべて完全に膨張した場合、注射は成功したと考えられる。
    注:膵臓が完全に膨張していないか、脾臓領域が完全に膨張していない場合、島の収量は低くなります。脾臓面積は、^島6の最も高い数が含まれています。インフレーションは、溶液で満たされた膵臓組織間の開いた空間の出現によって確認することができる。
14. 膨らんだ膵臓を慎重に解剖し、3mLの氷冷コラゲナーゼP溶液を含む50mL消化管に入れます。
    1. 2つの鉗子(曲がりくてとマイクロアドソン)を使用して膵臓を取り除きます。図1を参照してください:(脾臓から始まり、脾臓から膵臓を引き離し、胃から十二指腸に沿って取り除き続けます。
       注:切開は必要ありません。
    2. 細かい外科用ハサミを用いて3mLの氷冷コラゲナーゼP溶液を用いて消化管内で3~5sの膵臓をチョップする(図7A)。
15. 37°Cの水風呂でラックにチューブを固定し、約12〜13分間100〜120 rpmで振ります。
16. インキュベーション後、手でチューブをゆっくりと振り、コラゲナーゼP消化液が均質になるまで組織を乱す(図7B)。均質性は、膵臓の微粒子の砂のような外観によって確認される。穏やかな手振りの約30sは、通常十分です。組織が十分に均質化されているかどうかを調べるために光にチューブを保持します。必要に応じて別の〜15sのために振ります。
17. 消化したら、すぐに氷の上にチューブを置き、酵素消化を終了するために氷冷STOP溶液の40 mLを追加します。
    注:この時点で消化管は、複数のマウスで作業する場合、最大2時間の氷の上に残すことができます。
18. 30x gの300 x gでスイングバケツ遠心分離機でチューブを遠心分離します(遠心分離機の温度はフレキシブルです)。
    注:組織ペレットがチューブの壁ではなく、50 mLチューブの底部に形成されるように、スイングバケツ遠心分離機を使用してください。これは、より良いイレット収量のために重要です。
19. デカントし、STOP溶液で遠心分離を2回以上繰り返し、各スピン後に溶液をデカントする。その後の洗浄ごとに20mLのSTOP溶液を使用してください。
    1. 各スピンの前に、20 mL STOP溶液で50mLチューブ内の組織ペレットを静かに振ることによってペレットを破壊する。
20. 40 mLの氷冷HBSSと遠心分離機で300 x gで300 x gでティッシュペレットを30sで再中断します。
21. デカントし、HBSS溶液でスイングバケット遠心分離機を使用して遠心分離を繰り返し、各スピン後に溶液をデカントします。洗浄ごとに20mLのHBSSを使用してください。
    1. 各スピンの前に、ペレットを破壊し、20 mL HBSS溶液を含むチューブを静かに振ることによってチューブの底部からそれを取り外す。
22. 最後の遠心分離の後、すべての HBSS を削除します。
23. 次に、ペレットを含む50mLチューブに室温密度勾配の5mLを追加します。均質化するまで、低速で一時的に渦。
24. 室温密度勾配の別の 5 mL を 50 mL チューブに追加します。渦/混合しないでください。
    注:より良い勾配が中断することなく形成できるように、安定したままでいることは重要です。
25. 室温HBSSバッファのピペット10 mLは、チューブ(密度勾配を含む)に、グラデーションを形成できるようにゆっくりとゆっくりとドロップバイドロップします。10 mLピペット付きのピペットガンを使用して、HBSSをドロップワイズに追加します。
26. スイングバケット遠心分離機を使用して、1700 x gのスピンチューブを15分間、加速度/減速の速度を最も低い設定に変更して、勾配を維持してください(図7C)。
27. スピン後、勾配を乱さずにチューブを慎重に取り外します。冷たいHBSS(ピペットHBSS上下)であらかじめ濡れたピペットガンを使用して、密度勾配とHBSSの間に形成された島の層(5〜10 mL)を新しい50 mL島のコレクションチューブにピペットアウトします。
    注:島をピペットにする前に冷たいHBSSでピペットを濡らして、島がピペットの内壁に付着するのを防ぐのに役立ちます。
    1. 分離が不完全な場合、島は密度勾配層に見え、密度勾配(下層)の10mL全体を、界面で形成された島層と共にピペットアウトする(HBSS最上層の約8~10mLを残すだけ)。
       注: 島層と密度勾配層(下層)の両方を収集すると、島のピッキング時間が長くなる可能性がある破片の収集が発生する可能性がありますが、他のステップは変更されません。これらの層の両方を収集することは、入り手層がよく形成されている場合には必要ありません。
28. 島を含む新しい50 mLチューブに20 mLの氷冷HBSSを加え、スイングバケツ遠心分離機で3分間350 x gの遠心分離機を追加します。
29. スピン後、ピペット(底部に3mLを残す)を下に入れ、下に島を含むペレットを邪魔することなく慎重にピペット(デカントしない)。上清を捨てます。
30. 洗浄と遠心を少なくとも3回繰り返します。毎回20mLのHBSSを追加し、各スピンの前にペレットを中断してください。
31. RPMI-1640完全なメディアボトルを使用前に37°Cの水浴で温めます。最後の遠心分離の後、HBSSのすべてを取り除き、以前に調製した完全なRPMI-1640培体(FBS、INS-1細胞サプリメントおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含む)の4 mLをペレットに加えます。
32. チューブをそっと旋回させてペレットを外し、すぐにRPMI-1640メディアを100mmペトリ皿に注ぎます。チューブにRPMI-1640メディアの別の5 mLを追加し、任意の残りの島を洗い流すために穏やかにそれを旋回し、また、同じペトリ皿にメディアを注ぎます。
    1. 解剖顕微鏡の下で、20 μLピペットを使用してペトリ皿から健康な島を選び、完全なRPMI 1640媒体の10 mLを含む新しいペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡で見ると、島は比較的透明でウィスピーな外分組織と比較して滑らかな表面を持つ球状/長方形および金褐色に見えるべきである。
       注:解剖顕微鏡の倍率は通常12.5-16倍に設定される。イレット収量は、マウスのひずみ、年齢、性別などの様々な要因によって異なります。このプロトコルは、通常、健康なC57BL/6Jマウスの年齢4-10ヶ月から250-350の健康な島を生み出します。
33. 翌日の実験のために一晩5%のCO2注入と95%の加湿空気で37°Cで無菌インキュベーターで島をインキュベートするか、または後で所望の分析のために島を凍結する。
    1. いったん凍結した島は、分泌アッセイ、RNAまたはタンパク質定量のみに使用することはできません。凍結する細胞を収集するには、HBSSバッファにそれらを配置し、バッファの200-500 μLですべての島を収集し、1.5 mLチューブに転送し、遠心分離機350 x gを1-2分で除去し、30-40 μL溶液を残して上清を除去し、-20°Cに置いて短期保存(数日)または長期保存のための-80 °C。

結果

この手順の適切な完了は、腹腔内のマウス解剖学のいくつかの理解を必要とします。これは、Vaterのアンプルの適切な識別と一般的な胆管のクランプを可能にします。全体の手順は、通常1-2時間かかります。4~6匹のマウスから島を同時に分離する方が効率的なので、複数のサンプルを一緒に遠心分離することができます。島のピッキングの時間は、島の数と消化の効率に応じて異なります。1匹のマウスから250~350の島を選ぶのに約1時間かかる場合があります。

この論文では、非常に現実的な画像の数が含まれています:図3は、一般的な胆管および肝動脈を露出させるマウスの腹腔を示す。図4は、膵臓と十二指腸の間の接合部(針が挿入される場所)の近くにある、より大きく光沢のあるVaterのアンプルと同様に、より明るい色であるように見える一般的な胆管の全長を示しています。クランプは、肝臓にコラゲナーゼPの流れを遮断するために、肝臓に近い一般的な胆管と肝動脈束に配置されます。胆管を正しくまたは堅く締め付け...

ディスカッション

このプロトコルは、コラーゲナーゼ灌流および消化を含み、続いて島の精製を行う。このプロトコルの最も重要なステップは、効果的な注入と膵臓1、4、7の完全な灌流です。このプロトコルの送達方法は、酵素が解剖学的経路を横断して、島1を取り巻く外分泌組織をより良く消化することを可能にする。さらに、この技術は、島4、6の最高濃度を有する脾臓領域の完全な消化に適している。このプロトコルは、よく制御された消化時間と慎重に実行された精製ステップで、250〜350の健康な島を生成することができます。このプロトコルから単離された島は、グルコース刺激インスリン分泌ex vivo¹²を研究するために正常に使用されている。我々の経験から、インスリン分泌は5.5 mMのブド...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3mLシリンジ	BD	309657	HodingコラゲナーゼP
カバーガラス鉗子	VWR	82027-396	切開処置を助けるためにマウスの皮膚を保持する
湾曲した鉗子	Sigma-Aldrich	Z168696	膵臓除去中に組織を保持する
イソフルラン	ピラマル	B13B16A	手術前にマウスを麻酔する
100mmのペトリ皿	VWR	30-2041	膵島培養に使用
30 G. ½ インチ ニードル	BD	305106	コラゲナーゼ P を送達するための vater の Ampulla の浸透用 - このゲージは、ほとんどの CBD
50ml チューブ	VWR	89039-658	消化された膵臓組織、コラゲナーゼ P、および精製された膵島を保持する
防水防湿バリア付き吸収パッド	VWR	82020-845	syurgicalprocesdudesからの血を吸収するために
スイングバケツおよび減速の機能が付いている遠心分離機5810R	Eppendorf	5811FJ478114	ティッシュを造粒するために、ペレットは円錐管の底で形作られる-振動バケツ遠心分離機は必要である。また、グラデーションレイヤーを形成するためにも減速機能が重要です。
コラゲナーゼP-1g	ロシュ診断	11249002001	外分泌膵臓の消化用
湾曲した手術用ハサミ	フィッシャーサイエンティフィック	13-804-21	開いたマウス腹部を切断するため
解剖顕微鏡	オリンパス	SZX16	コラゲナーゼを膵臓に正確に送達するための主要な解剖学的構造の同定に使用
ハンクのバランスの取れた塩溶液 10x	コーニング	20-023-CV	洗浄細胞
Histopaque-1077	シグマ	RNBF5100	グラジエント形成用
光源	リーズ	LR92240	顕微鏡の視認性向上
RNaseZap	フィッシャー・サイエンティフィック	AM9780	RNase
RPMI-1640 メディア除去用 L-グルタミン	コーニング	15-040-CV	培養島
シュワルツマイクロserrefines(微小血管クランプ)	ファインサイエンスツール	18052-01	総胆管と肝動脈の
クランプ 揺れるウォーターバス	Boekel/Grant	8R0534008	外分泌組織の機械的消化に重要
小型手術用ハサミ	VWR	82027-578	膵臓に付着した組織を切断