方法論記事

テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネルを用いたショウジョウバエのシナプス接続を調べる

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DOI：

10.3791/57052

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2018年2月14日

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

この記事について

サマリー

この記事は、フグ毒、テトロドトキシン耐性ナトリウム チャネル、NaChBac を用いてニューロン間のシナプス接続をテストするためのメソッドを備えています。

要約

ここでは、新しい技術と呼ばれる Tetrotoxin (TTX) 設計された抵抗のプロービング シナプス (テレピン油) は、ターゲット ニューロン間のシナプス接続のテストに適用されます。メソッドは、特定のシナプス前ニューロンのテトロドトキシン耐性ナトリウム チャネル、NaChBac、遺伝子活性化因子の共発現に依存します。推定されるシナプス パートナーとの接続は、NaChBac を表現しないニューロンの電気的活動をブロックする TTX 存在下で全体セルの録音によって決定されます。このアプローチは、活性化または接続の記者としてカルシウム イメージングと動作するように変更できます。テレピン油は、ネットワーク内で接続を識別するために使用できるツールの成長のセットに追加します。しかし、テレピン油は、一括またはボリューム伝送と波及伝達も確実に報告という点でユニークです。

概要

神経科学の主な目標は、回路を介して情報の流れを理解するニューロン間の接続をマップすることです。多数のアプローチおよびリソース モデル システム1,2の範囲で神経細胞間の機能的結合をテストする利用可能となっています。電気生理学を使用して最も正確な配線図を生成するには、2 つのセル間の観察された接続が直接と間接とシナプス シナプスであるかどうかを解決することが重要です。哺乳類細胞におけるこの区別を作るためのゴールド スタンダードは、シナプス前の細胞の 1 つの action potentials と 2 番目のニューロンに興奮性シナプス電流 (工) の発症との間の待機時間を計測することです。短い待機時間は数ミリ秒と変動の少ない3シナプスの接続が必要です。長い電位シナプス コンダクタンスと記録間隔による検出の遅れを引き起こしている体細胞記録サイトどころか、樹状突起でシナプスがありますのでこのアプローチは無脊椎動物の神経細胞に複雑なすることができます。電極。このような遅延は、ポリ - シナプス貢献対に関するあいまいさを導入できます。さらに、小さなシナプス イベントは体性録音のサイトに到達する前に腐るかもしれないし、強いシナプス前の活動を運転はヒヨコ イベントを採用する可能性が高い。

様々 な技術は、無脊椎動物のシナプス接続をテストするために開発されています。1 つのアプローチは、過剰の Mg+ + , Ca+ +を含む高二価陽イオン溶液 (やあ Di) を使用します。このソリューションでは、削減の放出確率とシナプス入力4、5の検出を支持する活動電位のしきい値を増加シナプス接続をブロックします。必要な Ca ++ ++ Mg の正確な比率を決定するただし、簡単ではありません、ヒヨコの貢献は均一で適度な刺激6持続可能性があります。シナプス シナプス接続7を推論するは、前及びシナプス後膜間の近接の GFP 再構成間シナプス パートナー (把握) と呼ばれる別のアプローチを活用します。ここでは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) のコンポーネントは、1 つのニューロンで表され、分子の相補的なフラグメントは推定シナプス パートナーで表されます。蛍光の存在は、2 つのニューロン GFP 分子の再構成を許可するように十分に近い近接は、シナプスの存在を意味することを示します。把握報告できるシナプス虚偽、しかし、2 つのセルが密接に神経や束のように膜をあてる場合。把握の亜種はシナプトブレビン、アクティブなシナプス8時のみ再構成がように直接に GFP のシナプス前のフラグメントをテザリングでこのような偽陽性を排除します。把握とその亜種は、ショウジョウバエ中枢神経系の機能的結合を決定するのに尽力されている、いくつかの接続が見えるようにすることによって把握前及びシナプス後のパートナーとの間の距離が比較的大きい場合。これは特にニューロモデュレーション9または gaba 作動性抑制10に関連付けられているボリューム伝送の評価に関連します。

ここでは、補完・新規技術を示すショウジョウバエ中枢神経系に直接シナプス接続をテストするため。このメソッドと呼ばれるテトロドトキシンに設計された抵抗のプロービング シナプス (テレピン油)、フグ毒 (TTX) の共発現で機能-耐性ナトリウム チャネル、NaChBac、および推定から録音中のシナプス前細胞の光遺伝学的活性化シナプス パートナー9。、TTX 存在下で NaChBac を表現する以外の細胞で活動電位を介したすべての活動は抑制されます。NaChBac チャネル選択的に対象となるシナプス前セル光誘発のシナプス伝達を許可の興奮性を復元します。このメソッドは、接続はシナプス回路を採用の確率を削減しながら体の記録によって postsynaptically 解決できるようにシナプス前ニューロンの強力な活性化を許可します。重要なは、この手法はボリューム伝送の検討を許可し、回路を通して単一ニューロンからリリースされた送信機の広がりを明らかにします。また、テレピン油は、従来の薬理学を通じた接続の化学的性質を明らかにできます。テレピン油は TTX を区別しないナトリウム チャンネルの遺伝子組換え発現を可能にするモデルにおける使用に適しています。

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プロトコル

1. ハエや識別 GAL4 プロモーター ライン

  1. GAL4 プロモーターのラインを選択し、UA NaChBac 遺伝子と活性化のための光遺伝学的遺伝子を運ぶハエとそれを交差します。
    注: その高い電気伝導度と NaChBac 媒介活動電位がアクティブ化、使いやすさのためには、UA CsChrimson11が選択されます。ブルーミントン株式リポジトリからは UA NaChBac と UA CsChrimson の両方があります。
  2. エタノール (35 mM) の原液としてすべて trans 網膜を準備し、-20 ° C での冷凍庫保管ソリューション
  3. 約 5 mL の水分を補給されたジャガイモにこの株式のミックス 28 μ L フレーク フードと従来のショウジョウバエ媒体のバイアルの先頭にこの混合物を追加します。
  4. 0.2 mM すべて-トランス-レチナールの 1-3 日11を含む食品に csChrimson を表現する大人のハエを発生させます。

2. TTX 在庫を準備します。

  1. 蒸留水または脱イオン水で原液 1 mm TTX を作成します。数ヶ月の研究室の冷蔵庫にこのソリューションを保存します。多くの機関が有害または制御物質として TTX を分類、TTX のストレージに関する機関の方針を確認してください。

3. 電気生理学のハエを準備します。

  1. すべて trans 網膜に食品に発生する古い大人のハエ 1-3 日を収集します。
    注: は、パッチクショウジョウバエのニューロン12,13の詳細については 2013 年にマーシーとターナーを参照してください。
  2. ハエをシンチレーション バイアルに入れてください。ハエを固定する 1 分の氷にバイアルを配置します。
  3. 粗鉗子を使用すると、カスタム記録室にハエを挿入します。商工会議所は、3 ½"サークル レーザー カット 1/16" アクリルからから成っています。カット ¾"穴は 2 液性エポキシでカスタム ホイルがアタッチされているセンターです。ハエが挿入希望の形をした三角形の箔が含まれます。
  4. ワックスまたは記録室の中でしっかりとそれを動物に UV 硬化型エポキシ樹脂を適用します。
  5. グースネック光ファイバー顕微鏡下で可視化のための準備を照らします。彼らは側から直接その場を照らすので、それらを調整することにより斜照明用グースネック繊維を設定します。
  6. まだハエの明確に可視化を可能にする最低の設定に光のレベルを調整します。この光の強度は、個々 の実験の間で異なります。
    注: このプロトコルは、適応することができますでその場の脳を使って移植法14。
  7. 外部録音の生理食塩水を取得します。MM で生理食塩水を含む: 3 103 塩化ナトリウム、KCl、5 N-トリス (ヒドロキシメチル) メチル-2-— ジアルキルアミノエタン-スルホン酸、8 トレハロース、ブドウ糖 10、26 NaHCO3、1 改良近距離音響ホログラフィ2PO4、1.5 CaCl2、および 4 MgCl2 (270-275 mΩ に調整)。95% O25% CO2 (カーボゲン ・) 生理食塩水をバブルし、7.3 の15に pH 調整をしています。
  8. フライの準備上の細胞外記録生理食塩水 4-6 滴を配置します。この時点で、優れた視認性解剖顕微鏡で光のレベルを上げます。
  9. 電解を用いたタングステン細線をシャープに。ワイヤー自演3の飽和溶液を調製し、先端を削ってまで 20 回 100 ms のためのソリューションにワイヤの先端を浸漬しながら約 20 V の AC 電流を適用します。場で、脳がむき出しの頭にキューティクルを削除するのに尖ったタングステン ワイヤを使用します。
  10. さらに気管とそれを囲む脂肪体を削除することによって、脳を公開します。触角の丸い突出部にアクセスする、記録室に可視性を高める箔下にアンテナを優しく挟むに曲がったタングステン線または同様のツールを使用します。レコーディングが作成される興味の領域をカバー グリアの被覆を離れて引き裂く軽くシャープな鉗子を使用します。
  11. 電気生理学のリグに録音室を転送します。すぐに開始外部録音生理食塩水で灌カーボゲン ・脳を維持するために、バブル。食塩貯留層は、顕微鏡ステージ上に配置し、準備に重力供給します。廃棄物の生理食塩水を収集するために、真空ラインと 2 L の三角フラスコを使用します。

4. 全細胞記録を取得します。

  1. 市販のピペット引き手を引いて、パッチ ピペット。7 mΩ の近くの先端抵抗と適切なピペットを達成するための設定については、マニュアルを参照してください。
  2. パッチ ピペットに内部録音ソリューションの 4 μ L を追加します。アスパラギン酸カリウム 140、10 HEPES、4 MgATP、0.5 Na3GTP、1 グリコールエーテルジアミン四酢酸、および 1 から成っている内部の生理食塩水で mM KCl です。
  3. 全細胞記録用パッチ クランプ アンプを設定します。アンプのオフセットをゼロし、テスト パルスを提供するアンプを設定します。ここでは、午前のシステム パッチ クランプ アンプ 2,400 が使用されます。
  4. ピペットを肯定的な圧力を適用し、セルのアプローチします。ピペットを直接セルに連絡してマイクロマニピュレーターを使用します。肯定的な圧力をリリースします。セット-60 に膜の保持可能性 mV。ピペットは、膜低サブ ピコアンペアの保持電流によって立証されるように gigaohm シールを形成する必要があります。
    注: GFP を用いた細胞標的を導かれて、いる場合 ChR2 活性化と潜在的なシナプスを防ぐために epifluorescent ライトの使用を最小限にする試み。また手順 5 を適用する前に数分を待ちます。
  5. -50 からテスト パルスを提供するアンプを設定する-60 mV mV。この設定は、標準パッチ ・ クランプ アンプです。パッチ ピペットを充電に必要な流れを表す大きな容量性過渡テスト パルスを明らかにします。午前 2400 容量補正ノブを調整することによって容量性過渡または同じようなアンプを削除します。
  6. 細胞膜を破壊し、細胞構成を取得する否定的な圧力の短いパルスを適用します。
    注: ニューロンの静電容量を示す向けのトランジェントの大幅な増加がある場合、セル全体構成が観察されます。保持電流 (ベースライン) のわずかな増加はまた観察する可能性があります。アンプを現在のクランプ モードに設定し、-50-60 ~ セルの可能性を調整 mV。

5. シナプス接続をテストします。

  1. 光パルスを生成する LED ドライバーをトリガーするデータ集録 (DAQ) システムを構成します。ここでは、Matlab とナショナルインスツル メンツの DAQ システムを使用して、LED ドライバーにアナログ信号を提供します。アナログ信号をドライバーに LED の輝度は調整可能します。LED は LED 620-630 nm の波長です。
  2. 準備の下に直接にハイパワー赤色の LED を配置します。0.238 mW/mm2に達する場光の強度を調整します。
  3. 関心のシナプス後細胞から録音中のシナプス前ニューロンをアクティブにします。細胞活性化生じる、pharmacogentically を達成するまたは神経刺激を介して。ここでは、csChrimson と赤色光の短いパルスが適用されます。
    注: Epsp として現在のクランプまたは工として電圧クランプでは、シナプス接続を監視できます。シナプス接続が 40 ms 光パルス応答の TTX を適用する前に表示されます。そうだ場合は接続を認められなかったニューロンがシナプスがある接続されているいずれかのモノラル - または polysynaptically。潜在的な保有物は、それに応じて興奮または抑制の接続を強調する調整ができます。
  4. 1 の最終的な集中を達成するために灌流システムに TTX を追加通常生理食塩水中での接続が発生した場合 μ m の範囲を使って再循環ポンプ キャプチャして TTX を節約するために生理食塩水を再利用します。蠕動性ポンプはお風呂から食塩を描画し、生理食塩水の貯水池に戻る。
  5. 上昇し、下落を風呂で生理食塩水レベルを許可しない強力な一定真空を提供するためにポンプの回転数を調整します。
    注: TTX のアプリケーションは全部携帯で監視中のニューロンの活動をスパイクの停止になります。これは、生理食塩水に十分な TTX が追加されていることを確認します。
  6. 赤色光 (パルスごとの 40 ミリ秒) の短いパルスを再度適用します。この時点で、残っている任意のシナプス接続は可能性がシナプス。TTX のままシナプス結合の化学的性質をテストするのには循環の生理食塩水に薬理学的拮抗薬を追加します。
    メモ: 光遺伝学とニューロンの蛍光ターゲットを結合する場合があります永続的記録を取得しようとしたときのニューロンのシナプス前の人口をアクティブにすることが重要。これはシナプスうつ病につながることができるし、の接続を参照してくださいすることは困難になります。ニューロンと channel2rhodopsin を視覚化する赤の蛍光体を使用ことができます csChrimson は緑の蛍光蛋白質の範囲に広く拡張する長い励起帯があるため (Ch2R) は細胞を刺激する使用ことができます。そう、特定の遺伝学およびカスタム フィルター キューブが必要です。適切なハエを生成、LexA または Q システム バイナリ表現システムの下で赤の蛍光体 (RFP または mCherry) を表現するハエを行います。これらは、Gal4 プロモーターと UAS Ch2R と UAS NaChBac のエフェクター遺伝子を表現するハエと交差する必要があります。落射蛍光の最適フィルター キューブ赤の蛍光体を励起が Ch2R。 さらに刺激しない狭い加振範囲、フィルター セットは、同様に多くの放射光を収集するために長いパス排出フィルターを含める必要があります。パーツ番号 et580/25 x と t600lpxr (49306 セット) からクロマから設定カスタム フィルターを使いましたが et610lp バリア/排出フィルターを使用。

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結果

テレピン油は、モノとニューロン間のシナプス結合でヒヨコの貢献を区別するために使用されます。セルの弱い刺激は、直接接続のテストに使用できるよりシナプス前の活動を多くの場合運転シナプス接続 (図 1 a) を募集しています。テレピン油は、TTX を区別しないナトリウム チャネル NaChBac と光活性剤の共発現し、シナプス接続 (図 1 b) を除去するために TTX 存在下で接続をテストします。TTX は、テレピン油 (図 2 a) の適切な準備となってショウジョウバエ脳における活動電位を効果的にブロックします。NaChBac ナトリウム チャネルの遺伝子組換え発現ニューロンの興奮性および大きいプラトー電位 (図 2 b) で結果を救出します。

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ディスカッション

テレピン油分析は褒め割れ特定ニューロン間のシナプスの検出を有効にする回路に使用される現在の技術です。具体的には、アプローチは広く TTX を区別しないナトリウム チャネル NaChBac ニューロンの興奮性を復元中 TTX と活動電位の沈黙によってシナプス接続を明らかにします。シナプス後イベントの監視全体セルの録音をしながら、シナプスのリリースは光刺激によって誘発されます。テレピン油は、一括に敏感なまたはボリューム伝送距離の延長や薬理学的操作を実行する能力の誘発によって把握など他のアプローチから自分自身を区別します。手法は比較的簡単に採用、光刺激シナプスのシナプス前の部品にデュアル全体セルの録音を取得するよりもより現実的であるため 1 つだけ記録電極と光源を必要とします。テレピン油の基本的な要件は、活動電位が検討しているシステムで簡単に TTX によってブロックされます。しかし、TTX は分類学上の門の広い範囲にわたってニューロンに作用、のでテレピン油が両方の哺乳類、無脊椎動物モデル システムに広範に適用できると思われます。

テレピン油、刺激と推定されるシナプス前人口のまたはシナプ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

原稿にジョシュア歌手、ジョナサン ・ シェンク、コメントに対して思いやりのある校閲者に感謝したいと思います。我々 も感謝したいベン ホワイトとハロルド法テクニックについて議論します。ジョナサン ・ シェンクは、図 3 aのデータを提供します。この作品は、ホワイト ホールの基盤助成金、QG を NIH R21 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135神経活性化剤として使用
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466TTX
テトロドトキシンTochris1078TTXの購入には特別な許可が必要な場合があります。これは規制物質であるため、
すべてのトランスレチナールSigma-AldrichallトランスレチナールR2500ロドプシン
溶接可能な321ステンレス鋼の補因子が必要 シート, 0.002" 厚い、 10インチ ワイドマクマスターカー3254K7フライホルダーを作るために使用されます。カスタムホイルは、提供されたPDFファイルから pololu.com でレーザーカットすることができます
解剖顕微鏡ツァイスステミ 2000-C準備の解剖に使用
ワクサーアルモア・エクトラ ワクサー66000解剖中に使用してホイルでフライを固定します
パラフィンワックスジョアン4917217ワクサー
番号5鉗子ファインサイエンスツール#5CO解剖およびdesheathing
の解剖のはさみのファイン科学用具15001-08解剖の間にキューティクルの部品を取るのに使用され
タングステン ワイヤーAMシステム797500電気分解と使用して解剖のための鋭利な針を作るために
蠕動ポンプを往復単にポンプ(アマゾン)循環TTXPM200S
蠕動ポンプZitrades(Amazon)N / APWM調光コントローラー、LEDライトまたはリボン用、12ボルト8アンペア、調整可能な明るさのライトスイッチ調光コントローラーDC12V 8A 96W、LEDストリップライトB
バーサマウント用 精密圧縮空気レギュレータマクマスターカー1804T1パッチング中に正圧を適用するため
ガラスキャピラリーワールドプレシジョンインスツルメンツTW150F-3パッチピペット用
多目的ゲージマクマスターカー3846K431圧力レギュレーター用ゲージ
電気生理学カメラDage MTI IR-1000IR範囲(850 nm)で動作するカメラならどれでも動作します。赤い照明は、csChrimson
IR LEDThorlabs M850F2斜め照明
光ファイバーThorlabsM89L01IR LED
対物レンズへの結合 オリンパス 40XLUMPlanFLNこれは、ほとんどのマイクロシプスで使用でき、ハエのニューロンの視覚化に適しています。
琥珀色LEDThorlabsM590L3dRFPとmCherry
青色LEDThorlabsM470L3dGFPの視覚化用
GFPフィルターセットChroma49011GFPの視覚化またはチャネルの刺激用
Chroma et580/25x および t600lpxr (49306 セットから) ただし、ET610LP バリア/エミッション光学系付き識別されたニューロンに channel2rhodopsin Dichroic でパッチを当てて
、琥珀色と青色 LEDThorlabsを組み合わせるDMLP550R mCherry の下のパッチのみを使用し、青色光で channel2rhodopsin を励起します。
赤色LEDLEDサプライクリー XPE 620 - 630 nmcsChrimson
LEDドライバLEDの3021-D-E-1000光遺伝学的刺激のためのLEDの駆動に使用
マニピュレータサッターインスツルメンツMP-225録音中にピペットの位置に使用
パッチクランプアンプAMシステムモデル2400同等のアンプが適しています
ベッセルフィルターワーナーインスツルメンツ LPF 202Aパッチング中にオシロスコープへの電流トレースをフィルタリングするために使用される補助フィルタ。
データ集録システム ナショナルインスツルメンツNI PCIe-6321      781044-01アンプからコンピュータへのデータ記録に使用
コネクタブロック - BNC端子 BNC-2090ANational Instruments779556-01アンプをDAQカードに接続するために使用。
スチールホイル マクマスターカー3254K7カスタムレコーディングチャンバー用スチールホイル
マグネットK&JマグネティックスD42リングスタンドに録音室を固定する
1/16インチ セルキャストアクリル クリアポロルカスタム録音室を作るために使用します。アクリルは、付属のPDFファイルから pololu.com でレーザーカットできます
チャネルカスタムと一緒に使用 て させる 再の速度コントローラーのためのー IR LED用用 の視覚化用 場合にのみ使用してください 駆動に使用

参考文献

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