5 Bromouridine ラベルと免役沈降法を用いた RNA 合成の検討

サマリー

このメソッドは、RNA 合成を測定する使用することができます。5 Bromouridine は、セルに追加され、合成された RNA に組み込みます。RNA 合成は、5 Bromouridine ターゲット免疫沈降標識 RNA と逆のトランスクリプションおよび量的なポリメラーゼの連鎖反応による解析に続いて、ラベルの直後に RNA の抽出によって測定されます。

要約

定常 RNA レベルは 2 つの条件間にくらべると、変更は生産や RNA の分解の変化によって引き起こされるかどうかを区別することはないです。このプロトコルでは、RNA の生産、5 Bromouridine は短い期間 (例えば、1 h) 内で合成された RNA の調査を可能にする免疫沈降に続いて RNA のラベルを使用しての測定法について説明します。Α-アマニチンやアクチノマイシン D などの有毒の転写阻害剤の使用上の 5 Bromouridine ラベルと免役沈降法の利点があるないまたは非常に低い短期的な使用中に細胞生存率に及ぼす。しかし、5-Bromouridine-免疫沈降のみ RNA として急速に低下の他に、ラベリング短期間以内に生産、ゆっくりと生成をキャプチャするため RNA はこの方法で測定することは困難することができます。5-Bromouridine-免疫沈降によってキャプチャされた 5 Bromouridine 標識 RNA は、逆のトランスクリプション、量的なポリメラーゼの連鎖反応、次世代シーケンシングして分析できます。RNA のすべてのタイプを調べることができ、メソッドでこの例に記載されている mRNA の測定に制限はありません。

概要

5-Bromouridine (BrU) 免疫沈降 (IP) なしで細胞における RNA 生成の研究または短い期間^1,2をラベルの中に非常に限られた影響の細胞生理学。メソッドは、標識 RNA 抗体抗 BrU (図 1) を使用しての ip アドレスで新たに合成された RNA に BrU 続いて合成ウリジン誘導体の定款に基づいています。

何十年もそのタンパク質合成の転写調節することができますと転写因子の存在が 50 年以上も前に仮説を立てたが知られている³。今日では、いくつかの病気が転写、RNA の安定性の制御不全によって引き起こされる知られている (参考資料⁴の補足図 S1) と RNA の生産の変化を測定する能力が理解病で非常に重要なは開発。

その一方で、RNA の生産を調節するツールは少なすぎる、またはあまりにも多くのタンパク質発現やパーキンソン病 (PD) のように蛋白質の蓄積によって引き起こされる疾患の治療の新たな可能性を提供します。PD で、不溶性凝集体を蓄積優勢なタンパク質は α-シヌクレインと、α-シヌクレインのレベルは α-シヌクレイン....

プロトコル

注: 特に明記しない限り、室温ですべての手順を実行、冷蔵庫 (を除いて溶出からバッファーの SDS を含む)、氷の上にバッファーを維持します。プロトコルは 5 つのセクションに分けられる: 準備の RNA サンプルです。ip アドレスのビーズの準備ビーズ; に BrU 標識 RNA の結合溶出と 3 ステップ フェノール フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出によってバインドされている BrU 標識 RNA の浄化(この例は Rt-qpcr を使用) で RNA の解析

1. RNA サンプルの準備

1. 自動セルを用いたカウント HEK293T 細胞カウンターし、の合計を取得する 10 mL 成長媒体 (10% 牛胎児血清と 50 μ G/ml ペニシリン/ストレプトマイシン ダルベッコ変更イーグル培地添加) で 10 cm シャーレで細胞を 3,500,000 の種子 > 40 μ g RNA時に後で 48 時間の抽出。37 ° C と 5% の CO₂の細胞を維持します。
2. 播種後 48 h 8 mL 成長媒体を吸引し、細胞を乾燥を避けるために 2 mL を残し。2 mM BrU を追加し、8 mL に任意の治療は成長媒体を吸気し 8 mL BrU 含んでいる成長媒体を再適用する前にセルから残留 2 mL を削除します。これは遺伝子発現の変化を誘発することができますので、BrU のセルへの適用時に新鮮なメディアの....

結果

AsPC 1 セルの BrU ラベル時間の私たちの最初のテストを行った。セルは 0、1、2、および 4.5 h、続いて総 RNA の抽出、BrU IP の BrU と扱われました。GAS5 GAPDH BrU IP RNA は、1 h のラベルがそれぞれ GAPDH の GAS5、背景 (0 h) と比較して約 9 〜 と 44 倍変化を到達するのに十分に測定しました。

BrU IP と上記分析は、変更が発見された場合を調査する使用された (PLK-2) ポロ様キナーゼ 2 時に α シヌクレイン mRNA の定常状態レベルで抑制は mRNA 合成¹の変更によって引き起こされました。これは背景 (図 2) と比較して十分なラベルを提供し、治療時間が影響を与えることができますので、1 時間ラベルが選ばれました。2 mM BrU 治療は、1 時間の長.......

ディスカッション

このプロトコルでは、新しくのラベルによって RNA の生産の決定は bru さんは、続いてすぐの RNA の抽出、BrU 標識 RNA の免疫沈降で 1 h の RNA を生産のための BrU IP の使用について説明します。このメソッドは、以前の参照¹⁶に記載されているし、この記事にフェノール クロロホルムの精製ステップと同様に、BrU の低濃度の事前治療ビーズで IP 特異性と RNA の純度の向上にいくつかの追加手順が含まれています次の IP RNA の純度を高めます。さらに、ここで非 BrU BrU からキャプチャされた RNA を比較することによって BrU IP の特異性を示すデータを述べる細胞を治療します。フェノール クロロホルム浄化は安いが、BrU で標識 RNA の少量を考慮した下流解析の高められた信号を RNA キットを代わりに使用して取得ことがあります。我々 の経験は、しかし、サンプル間で最も等しい RNA 抽出がフェノール クロロホルム浄化を使用して得られることです。

BrU ラベルと IP、定常 RNA レベ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リボロック Rnase 阻害剤	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 ヒツジ 抗マウス IgG	Life Technologies	11202D
&α;-ブロモデオキシウリジン マウス抗体	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	サーモフィッシャー		紫外可視分光光度法
水飽和フェノール pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
フェノール:クロロホルム:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
高純度 RNA 単離キット	Roche	11828665001
大容量 cDNA 逆転写キット	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Taqman RNA probes	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystems
HEK293T cell line	ATCC
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Lonza	BE12-604F
ウシ胎児血清	Biochrom	S0115
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	A2213
ハンクス緩衝液			5.3 mM KCl、0.44 mM KH2PO4、0.2 mM Na2HPO4、および 136.8 mM NaCl pH 6.77、オートクレーブ滅菌済み。
DEPC-H2O			0.1% ジエチルピロカーボネート処理 H2O
2xBrU-IP バッファー			40 mM Tris-HCl pH 7.5 および 500 mM NaCl DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse 阻害剤			2xBrU-IP バッファーに 1 μg/μL BSA および 80 U/mL リボロック
BrU-IP+ 1 mg/mL ヘパリン			2xBrU-IP バッファーを 1:1 DEPC-H2O で希釈し、1 mg/mL ヘパリン
1xBrU-IP			2xBrU-IP バッファーを DEPC-H2O で 1:1 希釈し、0.5 μg/μL BSA および 20 U/mL Ribolock
溶出バッファー			0.1% SDS 含有 RNAse フリー H2O