方法論記事

5 Bromouridine ラベルと免役沈降法を用いた RNA 合成の検討

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DOI：

10.3791/57056

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2018年5月3日

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1DANDRITE - Danish Research Institute of Translational Neuroscience, Dept. of Biomedicine, Aarhus University, 2Dept. of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

この記事について

サマリー

このメソッドは、RNA 合成を測定する使用することができます。5 Bromouridine は、セルに追加され、合成された RNA に組み込みます。RNA 合成は、5 Bromouridine ターゲット免疫沈降標識 RNA と逆のトランスクリプションおよび量的なポリメラーゼの連鎖反応による解析に続いて、ラベルの直後に RNA の抽出によって測定されます。

要約

定常 RNA レベルは 2 つの条件間にくらべると、変更は生産や RNA の分解の変化によって引き起こされるかどうかを区別することはないです。このプロトコルでは、RNA の生産、5 Bromouridine は短い期間 (例えば、1 h) 内で合成された RNA の調査を可能にする免疫沈降に続いて RNA のラベルを使用しての測定法について説明します。Α-アマニチンやアクチノマイシン D などの有毒の転写阻害剤の使用上の 5 Bromouridine ラベルと免役沈降法の利点があるないまたは非常に低い短期的な使用中に細胞生存率に及ぼす。しかし、5-Bromouridine-免疫沈降のみ RNA として急速に低下の他に、ラベリング短期間以内に生産、ゆっくりと生成をキャプチャするため RNA はこの方法で測定することは困難することができます。5-Bromouridine-免疫沈降によってキャプチャされた 5 Bromouridine 標識 RNA は、逆のトランスクリプション、量的なポリメラーゼの連鎖反応、次世代シーケンシングして分析できます。RNA のすべてのタイプを調べることができ、メソッドでこの例に記載されている mRNA の測定に制限はありません。

概要

5-Bromouridine (BrU) 免疫沈降 (IP) なしで細胞における RNA 生成の研究または短い期間1,2をラベルの中に非常に限られた影響の細胞生理学。メソッドは、標識 RNA 抗体抗 BrU (図 1) を使用しての ip アドレスで新たに合成された RNA に BrU 続いて合成ウリジン誘導体の定款に基づいています。

何十年もそのタンパク質合成の転写調節することができますと転写因子の存在が 50 年以上も前に仮説を立てたが知られている3。今日では、いくつかの病気が転写、RNA の安定性の制御不全によって引き起こされる知られている (参考資料4の補足図 S1) と RNA の生産の変化を測定する能力が理解病で非常に重要なは開発。

その一方で、RNA の生産を調節するツールは少なすぎる、またはあまりにも多くのタンパク質発現やパーキンソン病 (PD) のように蛋白質の蓄積によって引き起こされる疾患の治療の新たな可能性を提供します。PD で、不溶性凝集体を蓄積優勢なタンパク質は α-シヌクレインと、α-シヌクレインのレベルは α-シヌクレイン遺伝子の遺伝子増殖は家族性 PD5を原因として病気に直結します。さらに、α シヌクレインを濃度依存的に集計します。Α-シヌクレインの mRNA のレベルのダウンレギュレーションしたがって PD 齧歯動物モデル6,7で神経細胞の損失を減少する RNA 干渉を使用して正常に達成されている興味深い治療方針です。

疾患や治療上の介在によって引き起こされる RNA の生産の変化を測定することができることが重要です。最新式の方法などの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT qPCR)、続いて逆のトランスクリプション RNA の定常状態レベルを測定が転写することによって変化を区別できないために変更RNA の安定性。RNA 減衰率の調査のため広く使用されている方法は、α-アマニチンや腐敗の Rna の測定に続いてアクチノマイシン D などの化合物を用いた転写マシナリーのブロックされています。ただし、誘導アポトーシス8,9などの細胞における転写の全体的な閉塞に関連するいくつかの問題があります。細胞毒素の効果の横にある転写阻害剤はまた α-アマニチンの遅い細胞内取り込みとアクチノマイシン D (参考10見直し) の特異性の欠如など、いくつかの技術的な問題を示します。

転写の全体的な閉塞を避けるためには、ヌクレオチド類似体、使用されている 5-エチニル ウリジン (5 EU)、4-thiouridine (4-TU)、BrU など。哺乳類細胞によってとられ、新たに合成された RNA は、特定の時間枠の内で RNA のパルス ・ ラベリングを有効にするのに組み込まれて、これらが容易に。BrU は 5 EU と 4-TU より毒性の少ない選択11,12の最寄りのアナログです。

BrU IP は、RNA 合成と安定率を調査し、従って総 RNA の変化の根本的な原因を区別する使用ことができます。この記事は、RNA 合成の測定に焦点を当てるし、参考2 RNA の安定性の調査の詳細についてを参照します。RNA 合成を調べるためには、細胞が簡単に付け BrU例えばBrU IP1 (図 1) に続いて 1 時間。これにより、ラベリング短期間内で合成された RNA の測定、観察された変化は RT qPCR による総 RNA の変化を測定することによってよりも RNA 合成の規則のより良い推定値を与えます。特筆すべきは、しかし、にもかかわらず、ラベリングの時間は、たとえば、のみ 1 h まだ劣化が観察される RNA レベルに影響を及ぼすに持つことができます。

BrU IP 実験からの RNA は、RT qPCR1または次世代シーケンス2,13によって下流の分析に適しています。北にしみが付くことやリボヌクレアーゼの保護試金など、その他の標準の RNA 検出方法は、特定の Rna の適用もあります。

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プロトコル

注: 特に明記しない限り、室温ですべての手順を実行、冷蔵庫 (を除いて溶出からバッファーの SDS を含む)、氷の上にバッファーを維持します。プロトコルは 5 つのセクションに分けられる: 準備の RNA サンプルです。ip アドレスのビーズの準備ビーズ; に BrU 標識 RNA の結合溶出と 3 ステップ フェノール フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出によってバインドされている BrU 標識 RNA の浄化(この例は Rt-qpcr を使用) で RNA の解析

1. RNA サンプルの準備

  1. 自動セルを用いたカウント HEK293T 細胞カウンターし、の合計を取得する 10 mL 成長媒体 (10% 牛胎児血清と 50 μ G/ml ペニシリン/ストレプトマイシン ダルベッコ変更イーグル培地添加) で 10 cm シャーレで細胞を 3,500,000 の種子 > 40 μ g RNA時に後で 48 時間の抽出。37 ° C と 5% の CO2の細胞を維持します。
  2. 播種後 48 h 8 mL 成長媒体を吸引し、細胞を乾燥を避けるために 2 mL を残し。2 mM BrU を追加し、8 mL に任意の治療は成長媒体を吸気し 8 mL BrU 含んでいる成長媒体を再適用する前にセルから残留 2 mL を削除します。これは遺伝子発現の変化を誘発することができますので、BrU のセルへの適用時に新鮮なメディアの使用を避けてください。
  3. BrU と治療 1 時間細胞を孵化させなさい。5 mL ハンクのバッファー内セルを洗浄し、2 mL 0.05% トリプシンを使用してセルを trypsinize します。反応を停止し、15 mL チューブにセルを転送 1,000 x g で 2 分間細胞スピンダウン 8 mL 成長媒体を追加します。
  4. 上澄みを除去し、RNA の隔離を使用して細胞ペレットからの総 RNA の抽出キット (材料の表を参照してください) またはその他ご希望の方法と RNase フリー H2o. ストアで続行する準備ができるまで-80 ° C で RNA を溶出します。

2. ビーズの IP のための準備

  1. ピペッティング時に損失を考慮し、混合旋回余分なプラス 1 調査するサンプルの数をバッチでビーズを準備します。抗マウス IgG 磁気ビーズ渦混合することによって徹底的に再懸濁します、RNase フリーの 1.5 mL チューブのサンプルあたりの 20 μ L ビーズを取り出してください。場所マグネット スタンド、ビーズのまま約 20 秒で 1.5 mL チューブ側を収集します。
  2. 上澄みを除去、マグネット スタンドからチューブを取り出し、ピペッティングで 400 μ L 1 x BrU IP バッファーで再懸濁します。2 の非常に簡単にチューブを回転テーブル トップ遠心分離機で s マグネット スタンドに戻ってそれを置くし、上清を除去。洗浄工程をもう一度繰り返します。
  3. ヘパリンを使用してビーズに非特異的結合をブロック。1 mL 1 のビードを再停止しなさい x BrU-IP + 1 mg/mL ヘパリン バッファー、および回転 30 分洗浄用ビーズ、一度手順 2.2 のように残す。
    注: ヘパリンは、バインディングの Rna と競合負荷電ポリマーです。下流のアプリケーションをシーケンス処理がない場合、tRNA または他の無関係な Rna を使用もできます。
  4. 1 mL 1 x BrU IP バッファーのビードを再停止しなさい、BrU も認識し、1.25 の μ g/サンプル反-α-ブロモデオキシウリジン抗体を追加します。1 h のビーズを回転させながらインキュベートまたは室温で一晩します。
  5. 3 回ステップ 2.2 のようにビーズを洗浄します。1 mM BrU と残す回転ビーズに、ここの抗体の感度を下げることで 30 分間 IP 中に不明確な結合のリスク補完 50 μ L/サンプル 1 x BrU IP バッファーのビードを再懸濁します。
  6. 3 回ステップ 2.2 のようにビーズを洗浄し、50 μ L/サンプル 1xBrU IP バッファーで再懸濁します。

3. ビーズに BrU 標識 RNA の結合

  1. 手順 1.3 からの RNA 抽出の RNA 濃度を測定紫外可視吸光光度法を使用し、希釈 40 μ g RNA 各サンプルから無料の RNase H2O で 200 μ L の総ボリュームに。
  2. RNA と卓上遠心分離機で簡単にスピンを変性する 80 ° C で 2 分間の RNA のサンプルを加熱します。BrU-IP + BSA/RNAse 阻害剤 x 200 μ L 2 を追加します。
  3. 50 μ L 再停止される各サンプルにステップ 2.6 からビーズを準備し、1 h. 洗浄 4 回ステップ 2.2 のようにビーズを回転のままを追加します。

4. 溶出と 3 段階フェノール フェノール/クロロホルム クロロホルム抽出法による RNA の精製

  1. RNA を溶出し、フェノールの抽出を実行
    1. 溶出が RNA、200 μ L の溶出バッファーでビードを再停止しなさいし、すぐにその後 200 μ L フェノール、pH 6.6 を追加 (注意: 有毒を参照してくださいステップ 4.1.2 下注) 任意の非 RNA 分子をサンプルから削除します。
    2. 旋回ミックス サンプルとスピン卓上遠心分離機で 25,000 x g で 3 分。
      注: フェノールは毒性があり皮膚の保護を身に着けているヒューム フードで処理する必要があります。わずかに酸性 pH のみ RNA およびない DNA が抽出されることが保証されます。RNA は、料金の親水性の性質上水相に残ります。蛋白質の疎水性コアはフェノールをバインドし、低い有機フェノール相に移動します。
  2. フェノール-クロロホルム抽出を行う
    1. (200 μ l の処理での経験によって、約 190 μ L) を可能な限り相を吸引し、200 μ L フェノール/クロロホルム、pH 6.6 管に移動 (注意: 有毒なメモを参照してください)。サンプル間で同じ量を吸引することを確認します。
    2. 旋回は、サンプルと 25,000 x g で 3 分のスピンを混ぜます。
      注: クロロホルムは毒性があり皮膚の保護を身に着けているヒューム フードで処理する必要があります。クロロホルムは、フェノールは、逆のトランスクリプション14およびポリメラーゼの連鎖反応のための15を阻害することによって RNA の下流の分析に影響を与えることができますを削除する追加されます。
  3. として水性上部の段階 (現在約 180 μ L) 前に、の吸引によってクロロホルム抽出を行なうし、200 μ L のクロロホルムを含む管に転送します。サンプルをミックスを試して、スピン 25,000 x g で 3 分。
  4. 吸引として水性上部の段階 (現在約 170 μ L) の前に、17 μ L (1/10 巻) 3 M CH3COONa、pH 6.0 を含む管に転送。中和し、水溶液から RNA を沈殿させる、2 μ L グリコーゲン (20 mg/mL)、一緒に RNA の沈殿物と RNA の餌をより見えるようになりますを追加します。
  5. 何度かチューブを反転で塩イオンと RNA とミックス間のバインディングの向上に 500 μ L 96% エタノールを追加します。ドライアイスに-20 ° C または 15 分で一晩管を残します。
  6. 25,000 x g、ペレットを乱すことがなく 30 分破棄上清の 4 ° C でサンプルをスピンし、餌を残留塩分を落 185 μ L 75% エタノールで洗浄します。25,000 × g、4 ° C、5 分で回転します。
  7. ペレットを乱すことがなく完全に上澄みを廃棄し、オープンふた付け 5-10 分を乾燥するペレットを残します。10 μ L で RNase フリー H2O はペレットを脅かさないようチューブの側面に適用を再懸濁します。

RNA の解析

  1. CDNA の逆のトランスクリプションを使用して cDNA を準備キット (材料の表を参照してください) またはその他の優先 2 μ L の RNA のサンプルと用いた 1 μ g 酵母総 RNA RNA のキャリアとして cDNA 合成反応 (次世代シーケンシングの cDNA を使用する場合は使用しません)。対応する入力の cDNA 作製に 1 μ g RNA 酵母 RNA なしを使用します。
  2. 希薄 cDNA 1:25 とミックス 9 μ L 希釈 cDNA 10 μ L の qPCR のマスター ミックスと 1 μ L 蛍光プローブ両方テーブルの材料に指定されています。
    注: cDNA 希釈は cDNA の調製と qPCR 法使用に依存します。
  3. (例えば、 7500 の高速リアルタイム PCR システムまたはそれと同等の) 次の qPCR のプログラムを実行する: 50 ° C、20 で 2 分 95 ° C、3 の 40 のサイクルで s 95 ° C、30 秒 60 ° C で s

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結果

AsPC 1 セルの BrU ラベル時間の私たちの最初のテストを行った。セルは 0、1、2、および 4.5 h、続いて総 RNA の抽出、BrU IP の BrU と扱われました。GAS5 GAPDH BrU IP RNA は、1 h のラベルがそれぞれ GAPDH の GAS5、背景 (0 h) と比較して約 9 〜 と 44 倍変化を到達するのに十分に測定しました。

BrU IP と上記分析は、変更が発見された場合を調査する使用された (PLK-2) ポロ様キナーゼ 2 時に α シヌクレイン mRNA の定常状態レベルで抑制は mRNA 合成1の変更によって引き起こされました。これは背景 (図 2) と比較して十分なラベルを提供し、治療時間が影響を与えることができますので、1 時間ラベルが選ばれました。2 mM BrU 治療は、1 時間の長...

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ディスカッション

このプロトコルでは、新しくのラベルによって RNA の生産の決定は bru さんは、続いてすぐの RNA の抽出、BrU 標識 RNA の免疫沈降で 1 h の RNA を生産のための BrU IP の使用について説明します。このメソッドは、以前の参照16に記載されているし、この記事にフェノール クロロホルムの精製ステップと同様に、BrU の低濃度の事前治療ビーズで IP 特異性と RNA の純度の向上にいくつかの追加手順が含まれています次の IP RNA の純度を高めます。さらに、ここで非 BrU BrU からキャプチャされた RNA を比較することによって BrU IP の特異性を示すデータを述べる細胞を治療します。フェノール クロロホルム浄化は安いが、BrU で標識 RNA の少量を考慮した下流解析の高められた信号を RNA キットを代わりに使用して取得ことがあります。我々 の経験は、しかし、サンプル間で最も等しい RNA 抽出がフェノール クロロホルム浄化を使用して得られることです。

BrU ラベルと IP、定常 RNA レベ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

ルンドベック財団オーフス大学、Dandrite、ルンドベック A/S は、この仕事を支えた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リボロック Rnase 阻害剤ThermoFisherEO0381
Dynabeads M-280 ヒツジ 抗マウス IgGLife Technologies11202D
&α;-ブロモデオキシウリジン マウス抗体BD Bioscience555627
Nanodrop 1000サーモフィッシャー紫外可視分光光度法
水飽和フェノール pH 6.6ThermoFisherAM9712
フェノール:クロロホルム:IAA 25:24:1 pH 6.6ThermoFisherAM9732
高純度 RNA 単離キットRoche11828665001
大容量 cDNA 逆転写キットThermoFisher4368814
Taqman Fast Advanced Master MixThermoFisher4444557qPCR Master Mix
Taqman RNA probesThermoFisherSNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1Flurogenic probes
7500 Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystems
HEK293T cell lineATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumLonzaBE12-604F
ウシ胎児血清BiochromS0115
Penicillin/StreptomycinBiochromA2213
ハンクス緩衝液5.3 mM KCl、0.44 mM KH2PO4、0.2 mM Na2HPO4、および 136.8 mM NaCl pH 6.77、オートクレーブ滅菌済み。
DEPC-H2O0.1% ジエチルピロカーボネート処理 H2O
2xBrU-IP バッファー40 mM Tris-HCl pH 7.5 および 500 mM NaCl DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAse 阻害剤2xBrU-IP バッファーに 1 μg/μL BSA および 80 U/mL リボロック
BrU-IP+ 1 mg/mL ヘパリン2xBrU-IP バッファーを 1:1 DEPC-H2O で希釈し、1 mg/mL ヘパリン
1xBrU-IP2xBrU-IP バッファーを DEPC-H2O で 1:1 希釈し、0.5 μg/μL BSA および 20 U/mL Ribolock
溶出バッファー0.1% SDS 含有 RNAse フリー H2O

参考文献

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RNA RNA HEK293T RNA IP RNA

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