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方法論記事

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

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DOI:

10.3791/57074

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2018年4月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。

要約

中心部に特に遺伝子操作は、心疾患の病因と治療の可能性の検討を大幅増強します。心臓固有遺伝子デリバリー生体内で一般的全身またはローカルの配信を実現します。尾静脈から全身投与が簡単かつ効率的な組換えアデノ随伴ウイルス 9 (AAV9) を使用して心臓の遺伝子発現を操作します。ただし、このメソッドの効率的な伝達ベクトルの比較的高い量を必要とする、非標的臓器の遺伝子導入可能性があります。ここでは、生体内で心臓特異的遺伝子操作マウスの心筋内注入のシンプルで効率的、かつ時間を節約法について述べる。(換気) なし、麻酔下でメジャーとマイナーの胸筋は切除したぶっきらぼうとマウスの心臓だった第 4 肋間スペースに小さな切開を通してマニュアル外部によって公開されるすぐに。その後、エンコード ルシフェラーゼ (リュック) とビタミン D の受容器 (VDR) または短いヘアピン RNA (shRNA) ターゲットに VDR、アデノ ウイルスは、心筋にハミルトン注射器で注入されました。その後体内イメージングを示したそのルシフェラーゼ中心部に特に正常に発現。さらに、西部のしみの分析は成功の過剰発現またはマウスの心臓における VDR の沈黙を確認しました。一度マスター、細胞やマウスの心臓におけるナノゲルなど他の材料の注入と同様、遺伝子操作、このテクニックが使えます。

概要

心臓病は、罹患率と死亡率の世界1,2の主要な原因です。心筋梗塞、心不全などの命にかかわる心臓疾患の効果的な治療戦略の欠如は、基になるある集中的な探査と新しい治療オプション3の身分証明書を集めています。これらの科学的な探検の心臓特異的遺伝子操作は広く使われている4,5です。心臓遺伝子操作ゲノム編集強力な転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) を使用することによって達成することができ、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化 CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9)/ツール、または異所性の遺伝物質 (例えば興味の蛋白質をコードする遺伝子を運ぶウイルスのベクトル) の配信6。生きているマウスに正確と時空間のゲノムの変更が許可されるゲノム編集、それはまだ6時間のかかり、労働集約的な練習。また、ウイルスのベクトルまたは小さな干渉 RNA (siRNA) 複雑な配信が日常的に心臓特異的遺伝子操作は6を実行しました。

成体マウスの心にウイルス ベクター配信は約 2 つの戦略によって達成される: 全身またはローカル注入。Cardiotropic 血清型 AAV9 など通気の全身投与は心筋特異的遺伝子操作7の非侵襲的です。ただし、このメソッドは、効率的な情報伝達と遺伝子発現に必要なベクトルの比較的高い量を必要とする、筋肉や肝臓7非標的臓器の重要な伝達があります。ローカル ウイルス注入は、心筋や冠動脈内配信7によって実現されます。冠動脈内の配信は、心筋内注入と比較して心の中でウイルスのより均等に配分をもたらします。ただし、この手法の欠点は、全身循環し、標的臓器8、および操作中に圧力測定器をその要件の伝達ウイルスのベクトルのうち急速洗浄です。対照的に、ウイルスを均等に失敗した心筋と同様に、サイト固有の配信でもより良いウイルス保持心筋内注入によりベクトル7です。小動物、冠動脈内の配信は技術的に困難、全身性 AAV9 注入と心筋がより一般的に用いられる4,5,7を実行します。全身注入が簡単に実行できますが、従来の心筋内注入機械換気と開胸を必要とする、広範な組織の損傷を引き起こすと時間がかかる。

本報告では、時間を節約、簡単な非常に効率的な心筋内注入法について説明しました。アデノ ウイルス shRNA VDR、ターゲットや VDR、ルシフェラーゼのエンコーディングは、心臓遺伝子発現を操作する注入しました。一度マスター、このメソッドはセルまたはマウスの心臓の他の材料の注入と同様、遺伝子操作の使用できます。

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プロトコル

すべての動物実験は、実験動物の使用に関する健康ガイドラインの国家機関によるとを実施し、研究所の動物倫理委員会で承認されました。男性 c57bl/6 j マウス (8-10 週齢) は、すべての実験のために使用されました。マウスは、24 の ° C ± 4 ° C、水や食料を無料での 12 h 明暗周期下で病原体フリーの条件の下で収容されました。

1 アデノ ウイルス溶液の調製

  1. 精製されたアデノ ウイルス ソリューションの到着後、-80 ° C のフリーザーでソリューションを保存します。
    注: 実行可能なマウスのアデノ ウイルス注入を行った。アデノウイルスベクターの無菌性を確保するため、アデノ ウイルス (エンコード ルシフェラーゼ、VDR、またはターゲットに VDR shRNA) 調製し、, 市販9,10を精製しました。
  2. 操作の日、-80 ° C のフリーザーから精製されたアデノ ウイルス ソリューション (3 x 1010プラーク形成単位 [pfu]/mL) を取り出すし、氷上アデノ ウイルスのベクトルのソリューションを解凍します。
  3. フェイス マスク、滅菌手袋、滅菌ガウンを着た。
  4. 50 μ L の準備手術前日に滅菌されているハミルトン注射器。
    注: 滅菌、ハミルトン注射器はガーゼに包まれ、高温・高圧滅菌器で配置。「ソリッドの滅菌」のモードが選ばれ、滅菌が「スタート」ボタンを押すことによって開始されました。
  5. 精製されたアデノ ウイルス ソリューションの完全な融解後スプレーの 75% エタノール、アデノ ウイルス ソリューションを含む管、層流無菌フードにアデノ ウイルス ソリューションを移動します。
  6. 層流無菌フードでは、ハミルトンのシリンジに 30 G の針の添付ファイルに続く針なしハミルトン注射器を使用して 50 μ L アデノ ウイルス ソリューションを吸引します。
  7. 上方に 30 G の針とシリンジを保持、アデノ ウイルス ソリューション (針の先端から最初のソリューションの滴の外観で確認) と針が塗りつぶされるまで注射器のピストンがゆっくりと。
    注: それは 30 G の針を合わせて約 45 μ L ソリューションをかかりますので、今はほとんどないソリューションが表示されるシリンジで。
  8. 上記準備された注射器を使用して、別の 30 μ L のアデノ ウイルス ソリューションを慎重に吸引、その後の使用のための氷に緩くおおわれた注射器。

2. 麻酔や手術の準備

  1. イソフルラン気化器に 20 mL イソフルランを追加、イソフルラン気化器を酸素ボンベに接続します。
  2. バルブを開き、酸素を聞かせてイソフルラン気化器に酸素タンクからフローします。イソフルラン気化器で酸素フロー モニター経由で 2 L/分で酸素流量を維持します。
  3. イソフルラン気化器に接続されているプラスチック製のケージで 2 分間 100% 酸素 (2 L/分) で 4% イソフルランとマウスの麻酔を誘導します。
  4. プラスチック製ケージから麻酔下マウスを取り出しと層流無菌フードでは、腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定、鼻の円錐形によって 100% 酸素 (2 L/分) で 2% イソフルレンで麻酔を維持します。
  5. つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。
  6. 角膜を乾燥から保護するためにそれぞれの目に滅菌眼クリームを適用します。
  7. 胸部と上腹部を剃る。1 分削除脱毛クリーム坊主のサイトに市販の脱毛クリームを適用し、残りのぬれたガーゼで毛皮。
  8. ヨウ素クロルヘキシジンによる消毒剤 (例えば entoiodine) の 3 のスクラブと手術部位 (左胸の下の部分) を消毒します。滅菌ドレープで手術部位をカバーしてください。

3. 心筋内注射マウスの心臓におけるアデノ ウイルス

  1. 手袋を脱ぐし、滅菌手袋の新しいペアに置きます。
  2. 外科はさみのペア、マイクロ モスキート止血鉗子を滅菌し、高の操作の前に日に針ホルダー温・高圧滅菌器 (手順 1.4 注記参照)。
  3. 剣と腋窩を結ぶ線に沿って 0.5 cm の皮膚切開を行います。大胸筋と小胸筋とマイクロ モスキート止血鉗子を解剖ぶっきらぼう。
  4. 大胸筋と小胸筋の取り消しによって肋間スペースを公開します。貫通し、マイクロ モスキート止血で第 4 肋間スペース (または観察によって広い肋間スペース) を開きます。
  5. そっと胸の壁の右側に押すことによって非利き手の人差し指でハートを外部化する切開に向けて心を押してください。
  6. 優しく非利き手の親指と人差し指で外在の心臓を保護します。
  7. 支配的な手で満ちているアデノ ウイルス (図 1) ハミルトン シリンジを介して 3 つのサイト (左心室の腹、背、左右壁) で左心室の心筋に 30 μ L アデノ ウイルス ソリューションの合計を挿入します。
  8. 注入が完了したら、すぐに胸腔内の空間に心を配置します。
  9. 手動で胸壁を皮膚切開部位に向かって軽く押す、胸腔内の空気を避難させます。
    注: 成功した空気避難は主要な胸びれと追放された空気によって引き起こされるマイナーな胸筋の羽ばたきによって証明されることができます。
  10. 5-0 シルク縫合糸で水平マットレス縫合で皮膚を閉じます。
    注: 大胸筋と小胸筋がない縫合する、彼らは解剖だけぶっきらぼう、彼らの解剖学的構造、操作を通じてそのまま。

4. 術後管理

  1. 二度毎日操作11の後最初の 48 時間の術後の痛みを軽減する皮下注射を介してブプレノルフィン (3 mg/kg) を管理します。
  2. 手術後、完全に回復するまですぐに熱パッド (37 ° C) の上のマウスを維持します。それは完全に回復した後ケージにマウスを配置します。
  3. ハミルトンの使用済み注射器、高温・高圧滅菌器で 30 G 注射針滅菌 (手順 1.4 注記参照)。シャープス コンテナーの滅菌の 30 G の注射針を収集します。

5. 心臓ルシフェラーゼ発現を測定するin Vivoイメージング

  1. アデノ ウイルス注入後の 5 日目、ルシフェリン ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で 15 mg/ml の新鮮な在庫ソリューションを準備します。0.2 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。
  2. 150 mg/kg 体重でルシフェリン溶液注入目を覚ましマウス腹腔内ベンゼン。
  3. イメージング システムを入れます。
  4. 自動イメージング システムの自己診断後、「発光」として画像モードを選択し、次の設定を行う: 露出: 自動;ビニング: 8;FStop: 1;励起: ブロック;排出: オープン。
  5. ルシフェリン注射後 10 分で抱水クロラール注入 (300 mg/kg 体重) によるマウスを麻酔します。つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。
  6. カメラに向けて胸を温水イメージング ステージ上腹臥位での麻酔下のマウスを固定します。
  7. 画像 (各マウスの 1 画像) を収集し、胸の周りの利益 (率 ROI) の同一円測定領域を描画することによって信号の強さを数値化します。
  8. 画像のコレクションの後マウスを犠牲にし、次のセクションで説明したように、組織を収集します。

6. 組織の収穫

  1. ウイルス注入 (図 1 b) 後の異なる時間ポイントで 4% イソフルランとマウスを麻酔の維持と鼻の円錐形によって 2% イソフルレン麻酔・腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定します。
  2. 前頸部で正中腹壁切開を行います。肩甲舌骨と胸鎖乳突筋の取り消しによって右総頚動脈を公開します。
  3. Transecting 右総頚動脈と血を流してによってマウスを犠牲に。
  4. 腹部の正中腹壁切開を行います。鎖骨中央線上に沿って胸郭の両側から肋骨を切り、横隔膜のトランセクトします。
  5. 剣を持ち上げることによって心を公開します。上行大動脈を見つけるし、血管周囲の脂肪組織を慎重に取り外します。
  6. Cannulate 大動脈と逆行性 4 ° C リン酸緩衝液 (PBS) の 0.5 ml、1 mL の注射器に接続されている 30 G 針で心臓を灌流します。
  7. 灌流後、中心部を切除、左と右の心室に分割します。肝臓、肺と脾臓を切除します。
  8. 冷 PBS (4 ° C) で、2 つの洗後液体窒素の極低温バイアルで収集されたすべての組織を個別に格納します。

7. タンパク質発現の定量

  1. 均質化のバッファーを準備するには、1: 100 の比率で市販の換散バッファーにプロテアーゼ阻害剤のカクテルを追加します。処理されるサンプルの数に基づいて容量を計算します。その後の使用のための 4 ° C で準備された均質化バッファーを保持します。
  2. 液体窒素タンクから組織を取る。組織の高精度スケール (組織の各部分の約 60 mg) 重量を量る。
  3. 組織を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。すぐに遠心チューブに 200 μ L の均質化のバッファーと冷却 1.5 mm 鋼球 (4 ° C) を追加します。
  4. 冷却 (4 ° c) マイクロ遠心チューブ用の研削盤、自動体内金属ホルダーをセキュリティで保護し、次の設定でコンピューターを起動することによって均質化を開始: 周波数: 70 Hz時間: 120 秒。
  5. 均質化後、(16,000 × g, 4 ° C)、ホモジネートを遠心し、100 μ L ピペットを新しい 1.5 mL チューブに上清を慎重に転送。
  6. 追加読み込みバッファーし、1:4 の割合で上清タンパク質溶液 (5 x) と 100 ° C で 5 分間でタンパク質を変性します。
  7. 心臓や他の臓器組織に蛋白質の表現のレベルの西部のしみの分析 (結果を図 2および図 3に示す代表) によって監視されてさらにプロトコルに従って前述の12。

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結果

実験プロトコルおよび報告に関する主な手順のいくつかは、図 1に表示されます。アデノ ウイルス エンコード ルシフェラーゼ (Adv ・ リュック) の心筋内注射後 5 日目は、生体内でイメージ投射 adv リュック注入マウスで具体的にあった中心 (図 2 a、 B)、ルシフェラーゼの堅牢な過剰発現と示されました。ウエスタンブロット法 (図 2)、非標的臓器伝達の不在を示唆によって確認されました。対照的に、コントロール マウスにおけるルシフェラーゼ発現が検出されましたないです。ルシフェラーゼの成功の過剰発現と一致して、西部のしみの VDR (adv-VDR) (図 3 a) をエンコード アデノ ウイルスを注入したマウスの左心室内推奨の大幅に増加した VDR 発現解析。さらに、adv s...

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ディスカッション

現在のレポートに示します Gaoらによって心筋梗塞誘導法から変更された心臓の発現ウイルスベクターの心筋内注入法が変更されました。13現在、体内特性特定遺伝子の機能のほとんどを含むノックアウト、トランスジェニック マウス3,14,15,16,17 の世代、高価な時間のかかる、労働集約型であります。また、遺伝子ベクターまたは全身またはローカル注入による siRNA の配信も広く循環器病研究4,5,7の遺伝子操作の練習します。特に、心筋内注入は、特定の状...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、著名な若手学者 (81625002)、国家自然科学基金、中国の (81470389、81270282、81601238)、プログラムの上海学術研究リーダー (18XD1402400)、上海市の国立科学基金によって支えられました。教育委員会 Gaofeng 臨床医学助成 (20152209)、上海 Shenkang 病院開発センター (16CR3034A)、上海交通大学 (YG2013MS42)、上海 Jiao はさみ大学大学院医学 (15ZH1003、14XJ10019)上海セーリング プログラム (18YF1413000) と蚌埠市医科大学 (Byycx1722) の大学院イノベーション プログラム。私たちの研究室で彼の以前のヘルプ、博士 Erhe Gao に感謝します

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipments
層流滅菌フードFengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd.(中国蘇州)FS-CJ-2F
CentrifugeThermo Scientific(米国ウォルサム市)75005282
ティッシュ研削盤Scientz Biotechnology Co., Ltd.(中国寧波市)Scientz-48
高温高圧滅菌器平山市(埼玉県埼玉市)HVE-50
イソフルラン気化器 マトリックス(オーチャードパーク、アメリカ)VIP3000
IVIS Lumina IIIイメージングシステムPerkinElmer(ウォルサム、米国)CLS136334
Precision バランスザルトリウス (Göttingen, Germany)28091873
Instruments 
Eppendorfピペット(100 & micro;L)エッペンドルフ(米国ウェストベリー) 
Eppendorfピペット(10 & micro;L)エッペンドルフ(米国ウェストベリー) 
鉗子上海医療機器(グループ)株式会社 JD4020カーブチップ
ハミルトン シリンジハミルトン (ネバダ州、アメリカ)80501Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostatF.S.T (フォスターシティ、アメリカ)13011-12湾曲、先端幅1.3mm
ニードルホルダー Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (中国、上海)J32110
Surgical scissorsF.S.T (Foster City, USA)14002-12
1-mL SyringeWeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (中国、山東省)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibodyCST (Danvers, 米国)#2118
抗ルシフェラーゼ抗体Abcam (Cambridge, UK)ab187340
抗ウサギIgGCST (Danvers, 米国) #7074
抗VDR抗体アブカム社(英国ケンブリッジ) ab109234
BuprenorphineThermo Scientific (Waltham, USA)PA175056
Chloralic hydrasLingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic VialsThermo Scientific (Waltham, USA)3754181.8 mL 
脱毛クリームVeet(中国、上海)
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 Gibco(グランドアイランド、 米国)14040133
EntoiodineLiKang(中国、上海)310132
EPチューブSarstedt(ニュートン、米国)PCR001
FilterMillipore(ベッドフォード、米国)細孔サイズ0.2 & micro;m 
IsofluraneYipin Pharmaceutical Company (中国河北省)
LuciferinPromega (マディソン、米国)P1041
Lysis buffer for western  blotBeyotime (Shanghai, China)P0013JWithout inhibitors
Ophthalmic creamApex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBSGibco (Grand Island, 米国)10010023
プロテアーゼ阻害剤カクテルThermo Scientific(米国ウォルサム)78438
5-0 silk sutureShanghai Medical Instruments(Group)Ltd., Corp.(中国上海)
鋼球Scientz Biotechnology Co., Ltd.(中国寧波)幅1.5mm
シリンジ針Kindly Medical Devices Co., Ltd.(中国浙江省)30ゲージ 
ウォームマットWarmtact電気加熱技術有限公司(中国広東省)NF-GNCW
49200000594920000113

参考文献

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