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方法論記事

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

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DOI:

10.3791/57081

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2018年3月29日

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1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

この記事について

サマリー

エナメル質の形成と変化を理解すると、エナメル芽細胞活性の検討が必要です。ここでは、さらに定量的および定性的な実験プロシージャで使用可能性があります分泌と成熟期エナメル芽細胞を含むエナメル器官のマイクロ分析する信頼性と一貫性のある手法について述べる。

要約

環境条件や生活の方法から生じるエナメル質欠損、彼らの高い有病率のため公衆衛生の懸念されます。これらの欠陥はエナメル合成エナメル エナメル器官であるという責任がある細胞の活性変化に起因します。、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞増殖、分化、死のイベントの具体的かつ正確なシーケンスに従ってください。ラットの切歯を継続的に成長、生理学的および病理学的条件でエナメル芽細胞活動と分化段階を研究する適切な実験的モデルです。ここでは、我々 はマイクロ分析環境有害物質に暴露したラットのエナメル器に信頼性の高い一貫した方法をについて説明します。ミクロ解剖歯科上皮には分泌と成熟期エナメル芽細胞in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学的アッセイなどの定性的な実験のためだけでなくなどの定量に使用できるにはが含まれてRT qPCR、RNA シーケンスおよび西部にしみが付くこと。

概要

環境毒性や不適切な生活習慣1,2,3,4への暴露から多く発達エナメル質の欠損があります。中断イベント、現在記載されている手順を使用してエナメル質形成の分子の特性、いくつかの有害物質への暴露の早いマーカーとして結果エナメル質欠損の使用を推進しの健康の歴史の再構成のために役立つことがあります。エナメル質が synthetized1,2周産期の期間それぞれの患者。エナメル合成は、エナメル芽細胞活動5によって 4 つの段階に分けることができます。最初のステップでは、前駆体細胞および pre-エナメル芽細胞増殖を再びグループ化します。2 番目の段階では、差別化されたエナメル芽細胞はエナメル基質タンパク質 (体)、主にアメロゲニン、エナメリン、アメロブラスチン、最終的なエナメル質の厚さを決定するを分泌します。したがって、EMP 合成の中断は、エナメル質の定量的欠陥につながります。におけるエナメル質の厚さの堆積後成熟段階を開始します。この段階で、幅と厚さにおけるアパタイト結晶の成長により重量最大 96% の生体組織は、最高の鉱化作用の割合に到達するエナメル質ができます。質的に成熟段階鉛中に発生する中断イベントはエナメルの欠陥です。最後に、エナメル、齧歯動物の色素沈着とも呼ばれる後の成熟の段階に入るし、歯噴火しエナメル質欠損 (もしあれば) 取り返しのつかない不可逆的なアポトーシスを受ける、欠陥の潜在的な回顧記録を提供エナメル芽細胞と強調しました。齧歯動物、エナメル、同様の一連のイベントがそれらをエナメルの一般的なプロセスを検討する適切なモデルの歯が成長し続ける特殊性で移動できます。したがって、エナメルの中断のエナメル質および/または中断イベントの時間ウィンドウの種類に応じて、数量の変更の結果します。その意味で、ダイオキシン類、鉛、および内分泌撹乱化学物質ビスフェノール A (BPA)、ゲニステイン、ビンクロゾリンなどへの暴露は、エナメル hypomineralizations1,2,3 を生成する示されています。 ,6,7,8。非対称白い不透明な斑点は、胎児期、出生1後最初の月の間に低用量 BPA 用量に暴露したラットの切歯に同定されました。これらのエナメル質欠損ラットと人間の臼歯切歯 hypomineralization (MIH) の類似した臨床的、構造的、生化学的特性を共有します。MIH は最近は、歯のエナメル質の病理病因まだ残る多くの因果関係の要因にもかかわらず不明9,10の9,10,11 に仮定されたこと ,12。

環境要因のための別の重要なエナメル hypomineralization 病理は歯の弗素症 (DF)、フッ化物の過剰吸収の結果である (> 0.1 mg/kg/日)13,14。フッ化物の主な情報源は、飲料水は、補足またはフッ化物で自然豊かです。フッ化物は、齲蝕予防にもしばしば処方が、予防的投与量はわずか 50% 毒性の 1 つよりも低い (0.05 mg/kg/日)。MIH と DF、環境要因への暴露から生じる 2 つの頻繁に病態が生じる内分泌かく乱化学物質2など他の有害物質とフッ化物の hypomineralizing 効果の増強により特徴付けられる必要がある共通の機能またはアモキシシリン15。

異なる分化段階でエナメルを含むラット エナメル器官の郭清のマイクロは、エナメル芽細胞の活動を妨害し、歯の噴火後診断されるエナメル質欠損を引き起こすことができる分子の作用のメカニズムを理解するのに役立ちます。つまり、環境毒性のためエナメル質遺伝子発現とエナメル マトリックス組成の変化の特性評価、有害物質への暴露の歴史の再構成ができ、環境安全の公共の監視が容易になります健康。

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プロトコル

本研究で使用されるすべての動物は、ケアと農業 (A-75-06-12) フランスの省から実験動物の使用のためのガイドラインに従って維持されました。

1. 動物に対する毒性

  1. このプロトコルを実行する前に必要な制度上の承認を取得、すべての動物のケアのガイドラインを遵守することを確認します。
  2. エナメル芽細胞分泌期および成熟期エナメル芽細胞に調査せずの影響をテストするためにさまざまな実験的グループの憲法を許可する研究プロトコルの設計を適用します。ここでは、フッ素 (NaF) の組み合わせでまたはない BPA (図 1 a)2への露出によって雄 Wistar ラットの 4 つのグループが構成されました。すべての動物の観察・解剖日 65 (図 1 b)。

2. ラットから Hemi 下顎骨の解剖

  1. 必要に応じて別々 の頭に体の残りの部分から、斬首に続く、CO2窒息によるラットを安楽死させます。ラットは専用ボックス16で 5 分の CO2を公開します。
  2. #11 メスを使用して、下顎の前歯部に簡単にアクセスを得るために下の唇からすべてのスキンを削除します。
  3. 同じメスでわずかな圧力で 2 つの前歯の間を切開を行い、下顎は 2 つの半分に分割されます。
  4. 顎をデタッチするメスと一時的な下顎関節し、高級ピンセットでヘミ下顎骨を保持します。
  5. メスと周囲の軟部組織をカットし、筋肉、腱、靭帯、骨が完全にきれいになるまでスクレーパーを使用してを削除します。

3. 切歯17,18の分離

  1. 慎重に刃を切歯の主要な長手方向軸と平行に配置することによって、骨を剃り落とします。頚部ループ近く切歯の終わりまで切歯 (近位端) の先端近傍の骨稜で開始します。切開モーションから近位遠位方向に進みます。
  2. 遠位片側下顎骨の下顎を取り外して簡単に子宮頸のループまたはエナメル芽細胞 (図 2の赤い線) の分泌期を損なうことがなく、切歯が離陸を許可するメスと子宮頸のループに最初のカットを作る。
  3. モル、2 番目の下の 2 番目のカットを確認し、骨と切歯の内側表面の間メスを挿入します。すべての基底骨を持ち上げ、回転外側切歯とエナメル質を避けるために慎重にそれを取る器官のティッシュを損なう高級ピンセットを使用して。

4. 両眼のレンズの下にエナメル器官のマイクロ郭清

  1. 生理食塩水リン酸緩衝 (PBS 1 X) 200 μ L ピペットを使用して切歯上にドロップします。高級ピンセットで切歯を上向き唇の表面に取る。メス、無色と組織のオレンジ色の部分の間をマークを確認します。このマークは、注目すべきその後 (図 2) は、基になる白斑に対応します。
  2. 掘削機または同等のツールを分泌期 (無色) エナメル芽細胞と成熟期 (オレンジ) エナメル芽細胞の切歯の先端にメスのマークに対応する頂端にメスのマークから細胞の表面をこすり。
  3. 以前説明した19としての転換期に対応する 2 mm の組織を削除します。間充織による汚染を避けるためにエナメル器官解剖時に、中切歯を開かないでください。
  4. 前述の20としてすぐに切歯 (図 2) の頂端部に位置し頚部ループをカットします。
  5. 10% ホルマリンまたは溶解溶液 (材料の表を参照) さらに捜査のためにそれを収集します。

5. さらなる調査のための区切られたエナメル器官組織のコレクション

  1. 200 μ L の PBS 1 X バッファーを切歯にドロップします。
  2. #11 メス刃で慎重にデタッチ バッファーで徐々 に歯科の上皮細胞別に以前行ったメス マークの助けを借りて、ステージごとに。
  3. 細胞 RNA とタンパク質の抽出は、蛋白質と Rna (材料の表を参照) を抽出できる換散溶液中の組織を置きます。
    注: 組織ショベル管で均質な混合物を得るまでセルを研削、高品質 Rna を準備します。混合物は、前述した2,8,17製造元の手順に従って RNA および蛋白質の抽出の準備ができて。通常、約 5-10 μ g 合計各準備を Rna と 150 μ g タンパク質を入手します。
  4. 組織学的解析、免疫組織染色 (IHC) との in situハイブリダイゼーション (っぽい)、2 h、4 ° c 1 × PBS でストアの 10% ホルマリンで細胞層を置きます。組織することができます埋め込むワックス ・ パラフィンの組織 10 月凍結切片の。
  5. EMP 抽出の高級ピンセットで切歯を取る。空気 (若干の脱水) に短い暴露後白い斑点はエナメル質の石灰化の開始を表す切歯の唇面の中央部の周り表示されます。このホワイト スポット対応に移行-/初期のエナメル芽細胞、成熟期だから指標として EMPs21の抽出のためそれを使用します。

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結果

多くは欠陥をエナメル質など歯の弗素症12,13、フッ化物の過剰吸収による環境条件に起因またはエナメルの hypomineralization いくつかの内分泌かく乱化学物質の1、への露出により MIH のよう7,22。これらの発達のエナメル質の欠損は実験的ラット (図 1)1,2,7,23,24

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ディスカッション

エナメル質欠損の特性が、変化の理解を開発を助けるかもしれない変えられたエナメル芽細胞活性および/または混乱したエナメル芽細胞増殖・分化・成熟プロセス鉛不可逆的なエナメル質欠損し、順番、エナメル質形成におけるエナメル芽細胞の活動。したがって、孤立したエナメル器官の研究は、エナメルの欠陥がどのような環境や遺伝、その起源につながる病理のイベントを明らかにする決定要因です。

この手法は、もともとヒラーらが記載されています。17 ・ ロビンソンら18日、エナメル器官分化の各段階に特定の効果を発揮する使用されます。それは、EMP 抽出19,24,25適応されています。我々 は現在エナメル器官の主要な部分を分離し、Rna とタンパク質 (おそらく内極細胞蛋白質) 量的・質的分析をさ...

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開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

この仕事は、歯科医学の研究 (IFRO) の大学パリ ・ ディドロ、フランス国立衛生研究所と医学研究 (INSERM)、フランスの研究所によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ビスフェノール ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
ホルマリン 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FranceTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, France74126RNeasy Protect Mini Kit
Androgen receptor antibodySanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816ウサギポリクローナル抗体
PBS 10xEUOMEDEXET330。フ
ッ化ナトリウム(NaF)Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州S-1504
パラプラストレギュラーライカマイクロシステム、ナンテールセデックス、 フランス39601006
組織OCTVWR、Fontenay-sous-Bois、フランス411243
Extra Fine Bonn Scissors - Straight/8.5 cmPHYMEP , Paris, France14084-08
Handle for Scalpel Blades - 12.5 cmPHYMEP, Paris, France10035-12
Curved Scalpel BladePHYMEP , Paris, France10035-20
解剖ナイフ - ファイン/ストレートチップPHYMEP、パリ、フランス10055-12
サークルナイフPHYMEP、パリ、フランス10059-15
の刃n°11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, France233-0024
双眼レンズLeica biosystems, Nanterre cedex, フランスMZFLIII
テキストでwas / parafinと呼ばれています メス

参考文献

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