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方法論記事

ウサギの食餌によるメタボリック シンドロームの実験的モデル: 方法論的検討・開発・評価

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DOI:

10.3791/57117

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2018年4月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

この記事について

サマリー

我々 は高脂肪、高蔗糖食を使用してウサギの食事誘発代謝症候群 (メッツ) の実験モデルを開発する方法を説明します。動物は、中心性肥満、軽症高血圧、前糖尿病、高脂血症、こうして人間のメッツの主要コンポーネントを再現を開発しました。この慢性的なモデルは、病気の進行のメカニズムを知識の取得になります。

要約

近年、肥満および新陳代謝シンドローム (メッツ) 公衆衛生および臨床実習は、座りがちなライフ スタイルや不健康な食習慣の上昇のための彼らの高められた流行を与え成長問題になっています。動物モデルのおかげで基礎研究は、メッツなど病態のメカニズムを調べることができます。ここでは、我々 は食事誘発メッツとその評価の実験的家兎モデルを開発するために使用方法を説明します。風土順化の期間の後、動物は 28 週間高脂肪 (10% 水素化ココナッツ オイルと 5% ラード)、高蔗糖 (15% ショ糖水に溶解) を供給されています。この期間中にいくつか実験的手術はメッツのさまざまなコンポーネントを評価する: 形態と血圧測定、グルコース耐性決定といくつかのプラズマ マーカーの解析。実験期間、動物を開発した中心性肥満、軽症高血圧、糖尿、高脂血症と低 HDL、高 LDL およびトリグリセリド (TG) のレベルの増加の最後に、人間のメッツの主要コンポーネントを再現します。この慢性的なモデルにより新たな視点、リスク、患者の同定や、テストの新しいことができる臨床および臨床マーカーの検出、病気の進行のメカニズムを理解するため治療この複雑な病理学の処置のためのアプローチ。

概要

肥満とメタボリック シンドローム (メッツ) 公衆衛生および臨床実習は、座りがちなライフ スタイルと不健康な食べる習慣1の上昇のための彼らの高められた流行を与え成長問題になっています。メッツの複数の定義がありますが、それらのほとんどは、心血管疾患や代謝の変化など腹部肥満、低 HDL と LDL コレステロール、トリグリセリドの上昇、耐糖能異常、高血圧2 のクラスターとしてそれを記述します。 ,3,4。診断は、これらの 5 つの基準のうち 3 人が存在している必要があります。

動物モデルのため基礎研究は、メッツなど病態のメカニズムを調査することができました。いくつかの動物モデルを使用している、しかし、人体病理学 (図 1) の主な臨床症状、選択のモデルを再現非常に重要です。この目的は、(Verkest5と張 & 楯突いて6レビュー参照) 犬と豚では主に、人間に似た動物モデルが開発されました。しかし、動脈硬化症や高血糖食事療法による犬の開発は疑問5モデル犬にはメッツのすべてのコンポーネントは表示されません。実験手順の複雑さとそのメンテナンスに活用が豚モデルは、人間と最も解剖学的および生理学的な類似性を示しメッツの基になるメカニズムを解明するための重要な予測力を提供するためこのモデルの非常に労働集約型、高価な6を実行します。

その一方で、齧歯動物モデル (マウス、ラット) 食餌誘導性自発およびトランスジェニック、広範囲で使用されている文学の異なる臓器やシステム (ウォンを参照してくださいその病理結果とメッツ、高血圧、肥満の研究のためら7レビューのため)。これらのモデルの使用は、犬や豚よりもより手頃な価格は、彼らの重要な欠点があります。確かに、7不在、高インスリン血、高血糖、高血圧など他の人に対し、歪みによって動物はメッツの一部のコンポーネントを開発します。さらに、メッツ、いくつかの遺伝子組み換え系統の肥満の主要なコンポーネントの 1 つはだけ、ダイエットに関連する要因に依存しない、むしろそれはいくつかの動物が正常または減少の食品摂取量8と肥満になることに示されています。最後に、マウスおよびラット コレステリル エステル転送タンパク (CETP) の自然の欠乏を表示して動脈硬化症の発展に比較的抵抗力があるになるコレステロールの輸送の主要な手段として HDL を使用します。これは、CETP を表現し、LDL9を中心に彼らのコレステロールを運ぶ人間と脂質代謝の重要な違いです。

逆に、実験ウサギはより大きい動物と齧歯動物の実験モデルの中間の段階を表します。したがって、人事やメンテナンス、大規模な動物モデルの実験プロシージャでより容易に処理されての最低要件とプロトコルの種類にウサギを簡単に送信できます。さらに、高脂肪食で飼育ウサギ肥満人間8,10,11と同様の血行や神経体液性変化であることが報告されています。脂質代謝に関する注記のウサギ豊富な CETP プラズマでありそのリポタンパク質プロファイル LDL の豊富な12人間のようでもあります。また、ウサギでは高脂血症を非常に急速に開発そう考えると、草食動物、として食餌療法脂肪13に非常に敏感であります。

figure-introduction-1
図 1: メッツ動物モデルの比較。Verkest5チャンと楯突いて6、ウォンらを参照してください。7レビューのため。"figure-introduction-2"利点を示しますと"figure-introduction-3"の不利な点を示します。*、論争をキャロルらによって研究、 *指摘によって異なります8、いくつかの遺伝子組み換え系統が食品の摂取量とは独立して肥満になります。CEPT: コレステリル エステル転送タンパク質であります。GTT: ブドウ糖負荷試験です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

さまざまな臓器やシステムにメッツが製造した病理学的改造の基礎となる基本的なメカニズムを解明するために、この複雑な病理学の主要コンポーネントを再現した実験モデルの選択を理解するには人間のメッツは、不可欠です。ウサギは人間生理学および慢性のプロトコルおよび測定で使用の手頃な価格との類似性を与えられる多くの利点を提供できます。このラインで高脂肪・高蔗糖食を使用していくつかのウサギの食事誘発モデルはずっと14,15,16,17,18,19 (表 1) を使用し、メッツのさまざまなコンポーネントの特性評価は、器官の改造と表現型の関連非常に重要なのです。したがって、この記事の主な目的はその病態の研究ができるウサギの食事誘発のメッツと器官の改造の影響のモデルを開発する方法を説明します。

研究ダイエット期間品種メッツのコンポーネント
ObHTHGDl
陰 et al. (2002)14·   10% の脂肪24 週間·     男性 nzw 種figure-introduction-4-figure-introduction-5figure-introduction-6
·   37% ショ糖·     2 kg
Zhao et al. (2007)15·   10% の脂肪36 週間·     男性の JWfigure-introduction-7figure-introduction-8figure-introduction-9figure-introduction-10
·   30% ショ糖·     16 週間
Helfestein et al. (2011)16·   10% の脂肪24 週間·     男性 nzw 種figure-introduction-11-figure-introduction-12figure-introduction-13
·   40% ショ糖·     12 週間
·   0.5 0.1 コレステロール
寧ら (2015)17·   10% の脂肪8-16 週間·     男性 WHHLfigure-introduction-14-figure-introduction-15figure-introduction-16
·   果糖 30% *·     12 週間
Liu et al. (2016)18·   10% の脂肪48 週間·     男性 nzw 種figure-introduction-17-figure-introduction-18figure-introduction-19
·   30% ショ糖·     12 週間
アリア Mutis ら (2017)19·   15% の脂肪28 週間·     男性 nzw 種figure-introduction-20figure-introduction-21figure-introduction-22figure-introduction-23

表 1: 食事誘発メッツ ウサギの高脂肪、高蔗糖食を用いたモデル。シンボル"figure-introduction-24「を示しない場合は、」figure-introduction-25"の存在と"-"は評価されません。* 制限。WHHL、渡辺遺伝性 hiperlipidemic ウサギ。JW、日本白色種ウサギ。Ob、肥満。HT、高血圧。HG、高血糖。Dl、高脂血症。

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プロトコル

動物のケアと本研究で使用される実験的プロトコル科学的目的に使用される動物の保護に関する EU 指令 2010/63 遵守し、制度的ケアおよび使用委員会 (2015/VSC/エンドウ/00049) によって承認されました。

注: プロトコルは、28 週間高脂肪、高蔗糖食の慢性の管理とメッツの主要なコンポーネントの評価で構成されます。4.39 ± 0.14 (標準偏差) の重量を量る 11 成人男性のニュージーランド ホワイト (NZW) ウサギを用いて kg、20-22 週齢実験的プロトコルの初めであった。湿度 (50 ± 5%) の部屋に収容された彼らと、12 h 光 (20 ± 1.5 ° C) の温度制御条件のサイクルします。言葉の「食事」と「ダイエット」は、プロトコルの手順で同じ意味で使用可能性があります。

(1) 食事管理

  1. 取得またはダイエットの準備
    1. 追加された水素化ココナッツ オイル (10%) と市販の高脂肪の食事を取得し、(5%)19をラードします。このダイエットは、3.7 kcal·g-1を提供します。
    2. 殺菌水 (例えば、2 L 入荷 15% ショ糖溶液の使用 300 g ショ糖) ショ糖の適切な量を溶解することにより 5 〜 15%ショ糖液を準備します。15% 溶液 0.6 kcal·mL-1を提供します。
    3. 市販コントロール ダイエット19、2.7 kcal·g-1を提供するを取得します。
  2. 4 週間の動物を順応させる
    1. 毎日コントロール ダイエット 120 g 群で各動物をフィードします。水の自由を提供します。
    2. メッツでの動物の飼料グループ 250 g 食事コントロール 50% と 50% 高脂肪の食事は、4 週の終わりまで 100% 高脂肪の食事に徐々 に増加します。
      注: 目的を達成するためになる: (i) 35% の制御と週 1; 末 65% 高脂肪の食事(ii) 25% の制御と週 2; の終わりによって 75% 高脂肪の食事(第 3 週末 iii) 15% コントロールと 85% 高脂肪食事(4 週末 iv) 100% 高脂肪の食事。
    3. メッツで動物の開始時に、5% スクロース グループ水を与えるし、4 週目の終わりまで 15% のショ糖濃度を高めます。
    4. 1.1.1 で提供される値ごとのカロリー摂取量を計算するチョウとショ糖溶液の摂取を登録します。1.1.2。
  3. メッツ (28 週) を誘発します。
    1. 食事コントロールのコントロール グループ 120 g で各動物をフィードし、広告の自由を毎日水します。
    2. 高脂肪の食事と 15% スクロースを水のメッツ グループ 250 g の動物をフィードします。毎日の食事とショ糖液 3 日おきを取り付けます。
    3. 残りの食事と水を毎日毎日の摂取量を推定するための重量を量る。

2 形態学的評価

  1. 毎週動物の体重を測定します。
  2. 高さ、長さ、腹部の輪郭、および脛骨の長さを測定し、管理実験的ダイエットと 14 と 28 日麻酔下の動物は数週間前にbmi 値を推定します。
    1. 滅菌使い捨てカテーテル (18-22 G) と右耳辺縁静脈を cannulate し、0.9 %nacl 水溶液の 1.5 mL に続いてプロポ フォール (8 mgkg-1) を挿入します。麻酔下のウサギのそれ以降の手順に記載されている測定を実行します。
    2. 測定の高さと長さ。側臥位 (長さ) で測定テープがあり、測定、記録、鼻からかかとまでの距離を使用してください。同じ位置で肩の肩峰から足 (高さ) の先端までの距離を取る。
    3. 体重 (kg) · として20体ボディマス指数 (BMI) を計算します。[長さ (m) × 身長 (m)]-1。
    4. 腹部の輪郭の周りに優しく測定テープを置き、仰臥位で動物と測定を取る。
    5. アキレス腱の挿入に膝関節の下の部分から脛骨の長さを測定します。

3. 空腹時血糖と静脈内糖負荷試験 (IVGTT)

注: お勧め日 (すなわち2-15) の同時手続きを開始します。

  1. 0.9 %nacl 水溶液 100 mL にブドウ糖 60 g グルコース ストック溶液 (60%) を準備します。
  2. 高速 7 h (食品を取り外し、水を維持する) のための動物は、腹臥位で落に意識したウサギを配置します。血糖値計 (メーター内に新しいストリップを挿入) を準備し、ランセットを使用して血を一滴を取得する左耳辺縁静脈から最初のサンプルを取る。[テスト ストリップと測定血糖値血糖値計を使用して、空腹時血糖を確認すると血の滴をタップします。
  3. 使い捨てカテーテル (18-22 G) と右耳辺縁静脈を cannulate し、60% グルコース溶液 (0.6 g·kg-1) のボーラスを注入します。
    注: 膠灰粘土を準備するには、グルコース ストック 1 mL/kg を追加します。
  4. ブドウ糖注射後 15、30、60、90、120、180 分でランセット (血の一滴) を使用して血液サンプルを取るし、3.2 と同様に血糖値計でそれらを分析します。
  5. 使い捨てのカテーテルを外し、ピンチ、ガーゼをカテーテル挿入のサイト。血液が凝固すると、一度ガーゼを削除し、動物の状態を確認します。

4. 血圧

  1. 圧力トランスデューサー、0.9 と 10 mL の注射器を含む集録システムを準備 (血圧記録) の集録ソフトウェアがパソコン/ノート パソコン、アンプ、三方活栓 % 食塩水。
  2. 機器を設定します。まず、圧力変換器、トランスデューサーと、カテーテルの間で三方活栓と注射器を配置し、圧力トランスデューサーをアンプに接続します。アンプを PC/ラップトップに接続します。
  3. メーカーの推奨事項に従って圧力トランスデューサーの校正を実行します。
  4. 腹臥位でウサギ落に意識した動物を配置します。カニューレの前に耳を温める、局所的に挿入のサイトの周りの耳で局所麻酔薬 (2.5% リドカイン/プリロカイン) を適用します。優しく簡単に識別動脈血管パッケージを実行する領域をタップします。その後左耳の中央動脈に滅菌カテーテル (18-22 G) を挿入します。拘束を緩め、30 分間静かにする動物を許可します。
  5. 心のレベルでの動物の横に配置されます圧力トランスデューサーを配置する、動脈カテーテルから直接 20 分間継続的に血圧を記録 (サンプリング周波数: 1 KHz、図 5 bを参照してください)。
    注: 血液凝固の干渉から無料録音血圧 (BP) を保つために (BP 信号振幅を失うまたは消える)、塩化ナトリウム (0.9%) 注射をすべきであります。三方活栓を使用して、カテーテルをトランスデューサーから、カテーテルに注射器からなる回路を開くと 1-2 の mL を注入回路を閉じます。カテーテルで血栓のフォームがありますが削除されます。トランスデューサーと、カテーテルの間の回路を開くし、信号が回復された後に記録を継続します。
  6. 録音が完了すると、カテーテルを外し、血損失を食い止めるためのカテーテル挿入のサイトでガーゼでピンチします。血液が凝固すると、一度ガーゼを削除し、動物の状態を確認します。

5. プラズマ計測

注: お勧め日 (すなわち2-15) の同時手続きを開始します。

  1. 高速 7 h (食品を取り外し、水を維持する) のための動物は、腹臥位で落に意識した動物を配置し、左耳辺縁静脈で滅菌 21 G 針を挿入します。点滴に血が開始されると、最初のドロップを破棄し、チューブで示されるレベルまで EDTA 管で血液サンプルを収集します。氷の上のサンプルを格納します。
  2. 1,500 × g、15 分間、4 ° C での血液サンプルを遠心分離します。遠心分離の後ピペットを使用してプラズマを吸引し、250 μ L の因数を準備します。
  3. すぐに新鮮なサンプルを分析します。基本的な制御パラメーターは次のとおりです: トリグリセリド、総コレステロール、HDL と LDL コレステロール。
    注: いない新鮮な分析したサンプルは、-80 ° C のフリーザーですぐに格納する必要があります。血漿サンプルから血糖値の分析に興味がある、血糖値のテストは EDTA の代わりにフッ化物シュウ酸とチューブを使用する必要があります。

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結果

メッツは、その研究が実験的なモデルの使用によって促進すること代謝と心血管の異常のクラスターを表します。確かに、メッツによって生成される病理学的改造の基になるメカニズムを解明するため適切に人間の条件のような研究に適した実験モデルの選択は非常に重要です。その評価の詳細な特性解析とショ糖、飽和脂肪の多い食事を使用してウサギにメッツを誘導する方法を紹介します。遺伝子組み換え動物モデルではなくダイエットの使用は大きい重要性のダイエットに影響を与える全身の代謝19、従ってに似て密接に人間メッツで起こる。階乗 (混合モデル) を用いて 2 つの要因、1 つの反復測定または「内」要因の分散分析 (時間: 前に、14 週と週 28、分析によって) と 1 つの「間」の要因 (グループ: 制御とメッツ) 統計分析のため。意義が受け入れられたときp < 0.05。

高脂肪、高蔗糖食も動物によって容認され...

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ディスカッション

適切な実験モデルの確立は、メッツの研究開発をより一貫性のある、信頼性の高いメソッドを提供できも臓器や改造システムの根底にある基本的なメカニズムを理解する必要です。ここで、食事誘発メッツとどのようにこのモデルを特徴づける代謝と心血管の異常のこのクラスターの主要なコンポーネントを評価する関連する実験モデルを開発に使用するメソッドを説明: 中心性肥満、高血圧、耐糖能異常、高脂血症と低 HDL、高 LDL と TG 値の増加。

モデルの主要な強さは、病理学の臨床症状の前に条件を勉強する能力です。確かに、代謝の変化に関する 28 週間動物 II 型糖尿病を発症しなかったし、(図 4) 前糖尿病の状態にあった。同様に、プラズマの生化学的マーカーはアテローム性動脈硬化の開発の重要な要因は、総コレステロール値 (表 3) で LDL や TG、HDL の減少が変更なしに伴う脂質プロファイルに明らか変質を示した。増加を観察することができますも、収縮期血圧、拡張期、およびマップ週 28 (

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III フェダーイン ・資金 (CIBERCV CB16/11/0486) FJC Generalitat (PROMETEOII/2014/037)、大学バレンシア (UV-INV-PRECOMP14-206372) mz Generalitat (GV2015-062) によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
獣医用スケールSOEHNLE7858スケール
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
アルミフィード用ショベルCOPELE10308アルミフィード用ショベル
http://copele.com/es/herramientas/48-pala-para-pienso-de-aluminio.html
バランスPCE IbéricaPCE-TB 15天びん
http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/balanzas/balanza-compacta-pce-bdm.htm
ストレーナー (直径 20 cm)ツヴィリング39643-020-0ストレーナー
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
ボウルツヴィリング40850-751-0スケール
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
ファンネルBT インジニエロス販売不可Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blueB Braun4251318末梢静脈カテーテル
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-Propofol
Lipuro 10 mg/ml vial 20 mlB Braun3544761VET全身静脈麻酔薬
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-FisioVet
血清液 500mlB ブラウン472779Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Film Vet 1,25cm x 5mB ブラウンOCT13501プラスチック絆創膏
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5mB BraunOCT13502プラスチック石膏
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luerB Braun4606108V2 つの使い捨てボディの注射吸引シリンジ
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-Seca
201secaseca 201周囲を測定するための人間工学に基づいたテープ
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verdeB Braun4657543Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-CONTOURNEXT-Meter
BAYER84413470血糖分析システム
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test stripsBAYER83624788血糖テストストリップ
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT 穿刺器具BAYER6702穿刺器具
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 カラーランセットBAYER81264857毛細血管穿刺用超薄型滅菌ランセット
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringeB Braun4606205VScale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - 滅菌B Braun9031219N封筒入りの滅菌ガーゼ パケット
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla リドカイン/プリロカインアストラゼネカはご利用いただけません局所麻酔薬
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G ショートB ブラウン4251342末梢静脈カテーテル
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-Introcan
Certo 20GB Braun4251326末梢静脈内カテーテル
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
血圧トランスデューサー-MA1 72-4497ハーバード大学装置724497血圧
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26AD InstrumentsML826Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6AD Instrumentsnot availableアクイジションソフトウェア
https://www.adinstruments.com/products/labchart
動物バイオアンプAD機器FE136アンプ
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mgBD367861採血チューブ
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
遠心分離機SciQuip2-16KL遠心分離機
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
エッペンドルフ リファレンス 2, 100 – 1000 μLEppendorf4920000083Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mLEppendorf30121023Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZWウサギ(16-18週齢)Granjaサンベルナルド利用できませんニュージーランド 白ウサギ
> http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/ スクロース シグマS0389-5KG飲用溶液用ショ糖
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es®ion=ES
ウサギ維持管理ダイエットダイエット
http://www.ssniff.com/
Rabbit高脂肪ダイエットSsniffS9052-E020脂肪ダイエット
http://www.ssniff.com/
ウサギラックと飲酒者Sodispanは利用できませんウサギ用ラック
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
ウサギ用拘束Zoonlab3045601http://www.zoonlab.de/en/index.html
SsniffV2333-000制御高具

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