新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

サマリー

MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。

要約

明快さの開発以来らせんの技術をクリアできる透明な組織内三次元表現型写像立方 (明確な遮るもののない脳イメージングを含む新規クリア方法論の多数カクテルと解析) スイッチ (対話時間のシステム全体にわたるコントロール) および化学物質の体内動態、マップ (拡大、プロテオーム解析)、および協定 (受動的な明快さテクニック)、更なる拡大のため既存のツールキットに確立されています。生体組織の顕微解析。本研究の目的を改善し、全体の中枢神経系 (CNS)、腎臓、脾臓、および全体のマウス胚を含む無傷の齧歯動物組織の配列の元の協定の手順を最適化します。PsPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定) と呼ばれる、これらの手法は、細胞回路をマッピングとそのまま正常および病的組織における細胞内の構造を視覚化する非常に有効な手段を提供します。次のプロトコルの psPACT と mPACT を介して構造完全性の最小の侵入と最大組織クリアランスを実現する方法について詳細なステップバイ ステップの概要を提供します。

概要

科学的・臨床的調査の基本的な目的を含む器官の構造と機能の完全な理解を達成します。ただし、哺乳類の器官の非常に複雑な性質はしばしば完全に¹この目的を達成するために障壁として機能します。透明度 (明確な脂質交換アクリルアミド ハイブリダイズ剛体イメージング互換かみしめハイドロゲル)^2,3,4、そのまま組織からアクリルアミド ベース ハイドロゲル ハイブリッドを構築する関係を実現します。その構造的な整合性の⁵を維持しながら脳、肝臓、および脾臓を含む臓器の様々 な光のクリアランス。明快さは可視化だけでなく、複雑な携帯電話ネットワークとを区分することがなく組織形態を細かく分析する機会に従ってきました。

組織クリアランスを達成するために明快さは、手でサンプルの脂質含量を削除する電気泳動法を採用しています。電気泳動の組織の清算 (など) の方法を使用が褐変、エピトープ損傷を含む組織品質の面で様々 な結果を生成することを研究で示されている明快さは物理的に安定した組織ハイドロゲルのハイブリッド車を生産するために注目されている中、蛋白質の損失の^5,6。これらの問題に対処するため、パッシブ、イオン洗剤ベース脱脂法など治療に置き換えます、協定 (受動的な明快さ技術) などのプロトコルの修正は先進^7,8,9をされています。にもかかわらず、結果の一貫性を達成するため、ただし、協定は最大の認可を得るためのより多くの時間を必要です。さらに、これらの技術のどれもが、CNS フォーム全体またはラット、モルモットなど大きい齧歯動物モデルで適用まだされています。

本研究は、psPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定)、全体の中枢神経系と内臓マウスとラットの両方のモデルのための¹⁰の高速のクリアランスを促進するための新規方法論を提案し、これらの制限に対処しようとします。具体的には、psPACT プロセス 0.25% と 4% アクリルアミド組織ハイドロゲル形成; 中に 2 つの別々 の手順で VA-044mPACT は基本的に同じ手順が含まれますが、0.5% α-チオグリセ キー試薬として、SDS 決済ソリューションのサプリメントします。両方の技術は、光クリアランスを生成するために必要な時間を大幅に削減する内因性の全身と脳脊髄液循環システムを活用します。原理の証拠として我々 はクリア組織¹⁰血管パターンを分析する共焦点顕微鏡の使用を示します。

プロトコル

すべてのプロシージャは、延世大学医科大学研究倫理委員会によって承認されています。延世大学医科大学実験動物の世話委員会のガイドラインに従ってすべての実験動物が犠牲に。

1. 試薬の調製

注意: パラホルムアルデヒド (PFA) アクリルアミドおよびナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 有害刺激を適切な個人用保護具 (PPE; 白衣、手袋、保護メガネ) と発煙のフードでこうして扱う必要があります。

1. 4% アクリルアミド (AA の) 溶液 (A4P0): 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 180 mL 40% アクリルアミド溶液 20 mL を加えます。
2. 0.25% VA 044 ソリューション: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g を追加] 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 mL に塩酸 (VA-044) 粉末。VA 044 粉末は、常温で保存できますが、一方、PBS で可溶化時に 4 ° C で保存されなければなりません。最高の結果を得るには、実験に必要なソリューションの量だけを準備します。
3. 協定カクテル ソリューション: 4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューションの 225 mL にアクリルアミドの 10 g を追加し、4% と 200 mL にボリュームを調整する PFA。使用前に VA 044 粉末 100 mg を 50 mL の円錐管に混合物の 40 mL に追加します。
4. 協定ソリューション バッファーをクリア: ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 40 g を 350 mL の 0.1 M PBS に追加し、0.1 M PBS と 500 mL にボリュームを調整します。MPACT クリア ソリューション、ソリューション バッファーをクリア協定に 0.5% α-チオグリセを追加します。
5. マウスをこの研究で使用された 2 週齢 BALB オスのマウス本研究で使用されるラットは 2 週齢雄 SD ラット.

2. 麻酔および灌流外科

注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。

1. 26 g 針、1 mL の注射器を使用して zoletil の 30 mg/kg の病原体フリー部屋に動物を麻酔します。5 のための動物を監視-10 分。
2. 動物の麻酔外科平面に達している、つま先ピンチ応答メソッドを使用して麻酔の深さを確認します。応答がないを確認します。
   注: マウスおよびラットの手術を伴う次の手順前研究¹¹で使用される同様のプロトコルに従います。
3. 外皮と腹部の壁を通して、胸郭の下に 5-6 cm の切開を行います。
4. あらかじめ切開のサイトを検索するのに胸部領域を触診、横隔膜の切開をするのに鈍い曲線ハサミを使用します。
5. 切開を胸腔内に公開する胸部の全体の長さにわたって。
6. 慎重に肺を置き換えません。鎖骨まで胸部のカットを作る。アイリスのはさみを使用して、左心室の後部の端に小さな切開を作る。カットの心室を通過、上行大動脈に 18 ゲージ鈍やオリーブをひっくり返した灌流針を挿入します。
7. 針を固定し、止血の中心をクランプして漏れを防ぐ。また、針の先端を大動脈のクランプに変更された止血を使用します。
8. 右心房、大動脈に与えるダメージを最小限を確保するよう配慮で大きな切開を行います。ラットは、灌流の準備が整いました。

3. 全体の血流とラットの解剖

注意: PFA とアクリルアミドは、有害刺激を適切な PPE と発煙のフードでこうして扱う必要があります。

注: 手順全体の灌流はウーらによる以前の研究で使用されるプロトコルに似ています。(2016)^10,11。

1. 18 ゲージ針、空気の泡を導入しないように注意しながら心臓の右心房に接続します。
2. 50 mL の注射器を使用すると、迅速かつ均一にヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液 50 mL をポンプします。
3. 蠕動ポンプのチューブに 18 g 針を接続します。
4. 10 mL/min の循環速度で 200 mL のヘパリン (10 単位/ml) を含む冷たい 0.1 M PBS 溶液で洗ってください。
5. 250 mL の循環速度を 10 mL/min で冷 4 %pfa 溶液で固定します。ラットは、この段階では硬いはずです。
6. 収集し、処分のため残りの PFA ソリューションを格納します。
7. 協定、18 ゲージ針、チルド協定 4 %pfa があり、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー カクテル溶液で組織を灌流、頭と背骨を取り外します。首から鼻の正中切開することによって頭蓋骨を公開します。この追加灌流ステップは、psPACT と mPACT メソッドに必要です固定後すぐに頭と背骨を分離し、頭蓋骨を公開します。
8. 任意の残留首と背骨の筋を除去することによって、頭蓋底を公開します。
9. Rongeurs とはさみを使って頭蓋骨をはがします。脳と脊髄を削除します。
10. 4% で組織を保存 4 ° c; PFA組織は、1 週間まで保存できます。

4. ハイドロゲル モノマー注入およびラットおよびマウスの中枢神経系の重合

注意: アクリルアミド、SDS、α-チオグリセ、PFA の刺激は、こうしてヒューム フードと適切なおしっこを処理する必要があります。

1. 協定 (パッシブ手法をクリア)
   1. 分離し、文化の全体中枢神経系 (脳と脊髄) 固定マウスおよびラットから 4 %pfa、4% アクリルアミドと 0.25% VA 044 パウダー、24 h. 組織が s に完全に没頭していることを確認のための 4 ° C でストアのチルド協定カクテル溶液 50 mL のチューブにソリューション。
   2. 10 分のティッシュを使用してゲルの交配システム窒素タンクに接続されているために、窒素ガスのサンプルを埋め込む: システムを 37 ° C に設定新鮮な寒さ (4 ° C) 協定を含む 50 mL のチューブに組織を転送カクテル ソリューション チューブ キャップと接続し、真空をオンにします。
   3. ヒドロゲルを重合、3 h、または重合が完了するまで (150 rpm、37 ° C) 振動のインキュベーターでサンプルを格納筒を配置します。
   4. あぶらとり紙を使用して (材料の表を参照)、削除残りの重合ハイドロゲル周囲の組織。
   5. 組織を含むクリア液 (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) 50 mL チューブに転送します。
   6. 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均して、完全明快さを達成するためにマウスの中枢神経系の約 20 日かかります。
2. psPACT (プロセス別のパッシブ クリア技術)
   1. ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。
   2. 組織の転送 4% を含む 50 mL のチューブ PFA、および 24 時間のための 4 ° C でストアするには組織は固定液に完全に浸漬。
   3. 0.1 M PBS で 1 時間固定ティッシュを洗うが、A4P0 溶液 (0.1 M PBS で 4% アクリルアミド) に譲渡。24 h の 37 ° C でストア。
   4. 0.1 M PBS で 5 分のための組織を洗浄します。
   5. 0.25% の組織を浸す 0.1 M PBS で VA 044。6-24 h、37 ° C で保存し、新鮮な 0.25 %va-044/PBS 溶液に転送します。
   6. 10 分のティッシュを使用してゲルの交配のために窒素ガスのサンプルを埋め込む窒素タンクに接続されたシステム (材料の表を参照してください): 新鮮な寒さ (4 ° C) を含む 50 mL のチューブに組織を転送 0.25 %va-044/PBS 溶液、チューブ キャップと接続。真空をオンにします。
   7. 組織に転送ソリューション (0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds) をクリアします。
   8. 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動のインキュベーターでサンプルをインキュベートします。平均して、マウス中枢神経系における透明度を達成するため約 17 日かかります。
3. mPACT (変更された受動的なクリア法)
   1. ボーン カッターと PFA 固定マウスおよびクリーン ベンチのラットからはさみ全体 CNS (脳や脊髄) を分離します。
   2. 4.2.2 - psPACT プロトコルの 4.2.8 の手順に従います。
   3. 組織に転送ソリューションを消去します。条約と psPACT のプロトコルとは異なり mPACT は 0.1 M PBS、pH 8.0 で 8 %sds に加えて 0.5% α-チオグリセから成るクリア ソリューション必要がありますに注意してください。Α-チオグリセより迅速かつ効果的に組織を明確に役立ちます非褐変のエージェントです。組織はソリューションに完全に没頭することを確認します。
   4. 組織がクリアされるまで、37 ° C および 150 rpm に設定振動インキュベーターにサンプルを配置します。平均では、マウスの中枢神経系における明快さを達成するために約 2 週間かかります。

5 屈折率整合とクリアされた中枢神経系の免疫染色

注: nリム (Nycodenz ベース屈折率マッチング ソリューション) は、0.8 グラム/mL の Nycodenz パウダー 30 mL 基本バッファー (0.01% アジ化ナトリウムと pH 8.0 0.1 M PBS でトゥイーン 20) に溶解で構成されています。ソリューションが粉体の適切な溶媒ようにインキュベーターの振動、37 ° C で置かれることをお勧めします。

1. 0.1% の組織を孵化させなさい 2 時間 0.1 M PBS でトリトン X-100 を 0.1 M PBS 6 時間で 2% ウシ血清アルブミン (BSA) をブロックします。
2. 3 回の pbst; セクションを洗う (0.1 %0.1 M PBS でトゥイーン 20) 2 のための 2 日間 (この場合は血管の汚れは、抗家兎の PECAM CD31 抗体) の一次抗体を持つセクションを染色します。
3. 2 日間の 2 %bsa で (この場合、ヤギ抗うさぎ IgG Cy3 蛍光共役) の二次抗体を使用してセクションを染色します。
4. 洗浄は 2-10 日間 pbst; 2 時間で 3 回組織と 15 mL のストアnリムをラベル付け。
5. イメージング、前に 35 〜 60 ミリメートル ティッシュの培養皿上nリムの少量にラベル付けされた組織を移動します。お皿の下の縁のまわりでシリコーンで固定します。
6. 1.5-2 mL の新鮮なnリムを追加します。

6. 画像処理

1. タイル走査共焦点レーザー スキャン microscopewith 10 倍の倍率を使用してクリアされた組織の画像を取得 (材料の表を参照してください)。Cy3 標識組織の 550-600 nm の波長を使用します。

結果

最適化された受動的なクリアリングの技術を使用して全体の中枢神経系の透明なモデルの生成

マウスおよびラットの全中枢神経組織の光のクリアランスは、様々 な受動的なクリアリング テクニック (図 1) を使用して急速に達成されました。時間をかけてクリア組織の模式図を図 2 aに示します。元協定メソッドとは異なり psPACT (別のプロセス協定) ハイドロゲル ハイブリッドを形成するために 2 つの別々 の手順で 4% アクリルアミド (A4P0) と 0.25% VA 044 イニシエーター溶液サンプルを扱うことを含みます。mPACT (変更された協定) 0.5% α-チオグリセとソリューションをクリア 8 %sds を補うことで psPACT に更に改良します。協定、psPACT、14 日に mPACT...

ディスカッション

大幅改善の前の組織をわかりやすく^2,3,4、7等をクリアで達成一貫性協定受動的、非電気泳動抽出方法に勤めている間^,8テクニックが最も急を要するが最大組織明確¹²を達成するために必要な時間の長さ、いくつかの欠点はいまだに。現在の研究では、組織の組織構造と整合性^6,10を維持したままクリアに必要な時間を大幅に削減協定プロトコルの修正を提案します。さらに、最初の時間のため、清算プロトコル全体の中枢神経系組織と高次齧歯動物モデル、ラット¹⁰組織のアプリケーションを示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Affymetrix, Inc.	75819	清算液
Nycodenz	Axia-Shield	1002424	nRIMS 溶液
40% アクリルアミド溶液	Bio Rad Laboratories, Inc.	161-0140	重合(A4P0)
2,2´-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩	和光純薬工業(株)	017-19362	重合 (VA-044)
1-チオグリセロール	Sigma-Aldrich	M1753-100ML	清算液 (mPACT)
Tween-20	Georgiachem	9005-64-5	nRIMS solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML	免疫染色
ウシ血清アルブミン (BSA)	ボヴォゲン	BSA100	免疫染色ヘ
パリン	メルクミリポア	375095	灌流(PBS)
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002-25G	nRIMS溶液
PECAM-CD31抗体	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-28188	免疫染色
用ヤギ抗ウサギIgG Cy3蛍光標識	Jackson ImmunoResearch Inc.	111-165-003	免疫染色
4% パラホルムアルデヒド	Tech &イノベーション	BPP-9004	灌流、重合
20X リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4)	Tech &イノベーション	BPB-9121	灌流、バッファー
10 mL ストリップ	コーター	4488	溶液移送
50 mL チューブ	ファルコン	352070	クリアリングチューブ
35 mm 細胞培養ディッシュ	SPL	20035	イメージング
共焦点ディッシュ	SPL	211350	イメージング
1 mL シリンジ	韓国ワクチン株式会社	26G 1/2	麻酔
50 mL シリンジ	Korea vaccine Co., Ltd	21G1 1/4	灌流
アクリルアミド	Sigma-Aldrich	A3553	重合 (A4P0)
Whatman 3MM paper	Sigma-Aldrich	Z270849	ブロッティングペーパー ゲル除去用
共焦点顕微鏡	Zeiss	LSM780	Imaging
ZEN lite Software	Zeiss	ZEN 2012	Imaging
蠕動ポンプ	Longerpump	BT100-1F	Perfusion
EasyGel	Lifecanvas Technologies	EasyGel	Tissue gel hybridization system