スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

サマリー

抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

要約

真菌感染症になっている最後の十年の重要な医療条件ですが使用可能な抗真菌薬の数は限られています。このシナリオでは、新しい抗真菌薬のサーチが必要です。ここで報告されるプロトコルは、抗真菌薬のプロパティの画面のペプチドにメソッドを詳しく説明します。それは潜在的な新しい抗真菌薬としての抗菌ペプチドの研究に合わせて変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性テストに基づいています。このプロトコルは、抗真菌化合物の活性を評価する機能の試金を記述および調査の下の分子の特定のクラスに合わせて簡単に変更可能性があります。法は、少量を使用して 96 ウェル プレートで実行される、大規模スクリーニングは、特に場合は、自動設定で実施時間の短時間で完了できます。この手順では、標準化された、調節可能な臨床プロトコルが真菌症の治療を改善するために新しい分子のベンチ作業の追求を助けることができる方法を示しています。

概要

真菌感染症となっている重要な医学的関心最近数十年でがん治療と HIV/エイズとともに生きる人の受診者など免疫不全の個体数の増加を主因は増大したことや臓器^1,2を移植しました。ただし、使用可能な抗真菌薬の非常に限られた配列とそれらにカビ抵抗性の報告数の増加が全身性真菌症³の治療法に関する主要な問題に貢献します。

新規抗真菌化合物の潜在的なソースは、抗菌ペプチド (アンペア)、感染⁴彼らの生得の免疫反応の一部として多くの生物によって生成される小さなカチオン性ペプチドです。それにもかかわらず、真菌病原体に対するこれらの化合物をテストするスクリーニング法は標準化されていません。異なったプロシージャは、時に同じモデル微生物^5,6,7アンペアの抗真菌活性を評価するために使用されています。これらの相違点といくつかのプロトコルの細部の欠乏は、化合物とフラワーの再現性比較を複雑にします。

新しい薬剤の候補者の試験を標準化する方法の 1 つは、臨床などの臨床現場における抗真菌薬感受性を定義するために使用し、実験室標準研究所 (CLSI) M27 A3 のガイドラインに従うことです。ただし、これらの抗真菌薬感受性試験が厳しすぎると考慮しない代謝の変化を考察種類を渡って、彼らはのみいくつかの [エージェントの確立されました。たとえば、とることはありません考慮非発酵性酵母の代謝の必要な。

このプロトコルにより、将来の抗真菌活性物質の活動の評価と抗真菌ペプチドの検索ここに実装されています。それは、新しい化合物^8,9のスクリーニングを最適化修正 CLSI M27 A3 ガイドラインからスープ希釈感受性テストに基づいています。これらの変更はコントロールとして参照を抗真菌薬の使用で結果を標準化しながら、最適の事前テスト成長少量化合物の温度や初期とさまざまなメディアでのバリエーションの使用を許可します。ウェル培養皿の使用で、このメソッドでは、画面多数の化合物の迅速かつ確実に可能です。

その固有の柔軟性のため化合物のいくつかの適応で、他の微生物に対する別の化学の授業でこのプロトコルを使用することができます。

プロトコル

1. ソリューションとメディア

1. 2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ、表 1に従ってサブロー デキスト ロース寒天培地を準備します。

2. 真菌の菌の成長条件

1. 必要になるまで、-80 ° c、35% のグリセロールで凍結する在庫としてすべての真菌系統を格納します。
2. 各実験の前に次の手順を実行します。
   1. カンジダ ・ アルビカンス系統。
      1. ストックのバイアルを解凍し、200 μ L をキャップと撹拌 (200 rpm) 30 ° C で一晩文化滅菌 50 mL ポリプロピレン チューブにサブロー ブドウ糖液 10 mL に転送します。チューブを傾斜し、文化のよりよい通気を少し開いてキャップを残すしてください。
   2. クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス系統。
      1. 冷凍ストック バイアル表面をこすり。サブロー ・ ブドウ糖寒天培地プレート上に細胞をプレートし、30 ° C で 48 時間インキュベート隔離されたコロニーの目に見える成長は後に、、最大 15 日間のパラフィン フィルムで封冷蔵庫 (4 ° C) でプレートを維持します。
      2. 生殖不能のつまようじまたは滅菌接種ループを用いた平板から中型の隔離されたコロニーを収集し、滅菌 50 mL の円錐管にサブロー ブドウ糖液 10 mL に接種します。撹拌 (200 rpm) 30 ° C で約 24 時間インキュベートします。
      3. 24 時間培養を超えないようにします。チューブを傾斜し、よい通気を少し開いてキャップを残すしてください。常に、これは抗菌薬耐性に影響を与える重要な要因ですので、各テストの前に細胞の生育を標準化することをお勧めします。
         注: 両方の菌が急速な伝播実験では、30 ° C で栽培されたが、温度を研究、たとえば臨床治療 (37 ° C) の目的を反映するように変更できます。最も重要なは、この最初の孵化時間の各真菌の分離の事前確立・再現性を確保するためのすべてのテスト全体で維持する必要があります。
3. 菌の増殖後室温で 5 分間 1,200 x g で円錐管を遠心分離によって細胞を収集します。上澄みを廃棄し、PBS の 10 mL を加えます。
4. 再懸濁します細胞と遠心分離機再び室温で 5 分間 1,200 x g で。
5. PBS 洗浄と遠心分離をさらに 2 回繰り返します。第 3 洗浄後 2 X RPMI 1640 媒体 (ペレットのサイズ) によると 5 mL の細胞を再懸濁します。
6. 1: 100 または縮尺希釈 (細胞懸濁液の濁度) に応じて遠心管に 1 mL を準備します。
7. この希釈 10 μ L 分注検定商工会議所に配置し、顕微鏡下での 4 つのコーナー領域内のセルの合計数をカウントします。計算式で濃度: (総細胞数/4) × 希釈係数 x 10⁴ (商工会議所希釈定数)。
   1. 生存数と成長条件が検討されている分離の体系的に関連付けられた場合は、100% の生存率を検討してください。
      注: 標準化と生存率のカウントの品質管理することができる抗菌感受性試験 (EUCAST) 抗真菌酵母^{10 最小阻止濃度 (MIC) 法に関する欧州委員会に従ってバック メッキ}.
   2. 場合は調査の下で分離の成長/生存率の相関関係が確立されていない、フロキシン B¹¹、トリパン ブルー^{などの死んだ細胞を選択的に色の染料の援助と検定で生きているセルをカウントすることによって菌の生存率を測定します。12}、ヤヌス グリーン¹³か。場合にのみ、この時点の人口の生存率は 90% 以上は、このプロトコルの真菌細胞を使用します。
      注: デッド/生きている染料が選択の菌とも限りません。使用する前にそれらをテストしてください。たとえば、トリパン ブルー色素はクリプトコッカスとうまく働きません。
8. その後、2 X RPMI 1640 培地で細胞懸濁液を準備 (2 X 調整 RPMI 1640 培地で接種)。96 ウェルのプレートは、各プレートの 5 mL の量を検討してください。
   1. C. アルビカンス株すべての 4 x 10³セル/mL のストックの細胞懸濁液を準備します。この濃度は各ウェル (2 x 10³セル/mL) の最終的な細胞濃度の 2 X です。
   2. クリプトコッカス菌 2 x 10 のセル⁴セル/mL のストック文化を準備します。この濃度 (1 × 10⁴セル/mL) 各ウェルで最後のセル濃度 2 倍であります。
   3. 他の菌濃度、培養時間に関連して特定の研究にとって理想的である知られている抗真菌剤でテストします。菌の代謝と複製の時間を考慮します。

3. ペプチド (不明なエージェント)

1. -20 ° C で凍結乾燥させたペプチドを格納し、それらを各実験の前に脱イオン水に溶解します。一度水に溶解したストレージの最大時間は、各ペプチドの性質によって異なります。
2. 試金 (2 X) でテスト最高の最終濃度 2 倍の因数を準備します。理想的には、凍結融解サイクルを避けるために 1 つの時間の使用のための十分なペプチドの因数の数が少ないを準備します。
   注: 濃度の選択は、文学とペプチドの性質に基づく必要があります。約 100 μ m、ペプチドのシリアル希薄を開始し減少するか、または得られた結果によってこの濃度範囲を増加させることをお勧めします。

4. 参照抗真菌薬 (ポジティブ コントロール)

1. 水で希釈したそれらのため: 分析の最高濃度の 2 X ソリューションの準備 (セクション 5 を参照してください: ステップの希釈の抗真菌の試金)。
   1. C. アルビカンス菌のフルコナゾールの 128 μ G/ml またはキャスポファンギンの 128 μ g/mL の溶液を準備します。両方のプレート濃度 64 μ g/mL になります。
   2. クリプトコッカス菌のアムホテリシン b (水溶性溶液) 32 μ g/mL の溶液を準備します。プレート濃度 16 μ G/ml になります。
      注: 通常アムホテリシン B 希釈ジメチルスルホキシド (DMSO) でこの抗真菌剤は水には溶けにくいので。ただし、市販水溶性アムホテリシン B 製剤があります。
2. 有機溶剤で希釈した抗真菌薬のため: X、DMSO に原液 100 を用意し、その使用のための水で 10 倍に希釈します。
   注: したがって、井戸に DMSO の最終濃度が 1% を超えてください。制御が必要ないくつかの菌類を容認しないもこの濃度、溶媒のことを考えると 1 %dmso を含んでいる媒体で菌をなるも。DMSO は感光性を覚えて、だから箔プレート カバーまたは潜伏期間の持続期間のための暗い部屋に配置。

5. 抗真菌アッセイ

注: In vitro抗真菌アッセイがいくつかの変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性試験に基づいて実行されます。

1. 各ペプチドが 2 倍連続希釈を準備し、50 μ L の最終巻にポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートで抗真菌薬を制御します。
   1. 最高の 2 倍の濃度で抗真菌剤/ペプチドの 100 μ L 必要な列に最終濃度 1-3、行内 A. 追加ピペットを使用して
   2. マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 B h で、他の井戸に 50 μ L の滅菌水を追加します。
   3. 最高濃度 (行 A) と井戸の 50 μ L を削除、次の濃度 (B 列) の次に移し、均質化します。
   4. 最低濃度で井戸まで上記の手順を繰り返して、この井戸 (列 H) の 50 μ L を廃棄します。水だけで空のコントロールまたは負/成長コントロールのいずれかを列 11、12 (行 A、B、C) を残します。
   5. (1-3 列と列 11 (負/成長制御)); 各ウェルに RPMI 1640 中調整接種 × 2 の 50 μ L を追加します。C. albicansの最終濃度になり 2 x 10³セル/mL、最終濃度クリプトコッカス菌 10⁴セル/mL になります。
   6. 空白のコントロールを準備 (50 μ L の水 + 50 μ L 2 セルなし X RPMI 1640 媒体) 負/成長制御 (50 μ L 水 + 抗真菌薬なし 50 調整 μ L 接種 2 X RPMI 1640 媒体) と記載されている上記のウェル プレートに負荷。
2. テストするそれぞれの化合物のプロシージャは、選択した抗真菌コントロール (4-10 列) を繰り返します。
   注: シリアル希薄することができる垂直方向に、下の実験としてまたは水平方向 (すなわち、与えられた化合物/抽出テストする必要があるの希釈液の数が 8 個以上場合) のプレートに。
   1. 化合物を参照する場合薬、またはそのコンポーネントのいずれかが感光性、削減された光でアッセイを行う、箔、板をカバーまたは孵化中に暗い部屋に配置。
3. 次のオプションの推奨事項を検討してください。
   1. 蒸発を削減とガス交換を許可する明確なカバー プレートとプレートをシールします。
   2. プレートが、湿気のある商工会議所;それも蒸発を減らすのに役立ちます。
4. クリプトコッカスの揺れ 200 rpm 37 ° c 24 時間または 48 h 48 h、 c. アルビカンス株すべての版を孵化させなさい。最終的な音量 (100 μ L) により、波及効果が発生しません。
   注: 有意差が認められなかった 24 h でマイク測定値とC. albicansの緊張のための 48 時間の間。それにもかかわらず、48 時間の測定値は、視覚化やすくなっています。
5. 潜伏期間前後倒立光学顕微鏡の援助と汚染の兆候を確認する同様の形態変化を確認するすべての井戸を観察します。
   注: 読みすることができます視覚的に行うし、実験の終わりに撮影します。読む前にプレートを少しホモジナイズしてください。読み取りは、600 の外径を測定することによっても実行できます nm、細胞塊またはフィラメント現象は観察されていません。
6. 別の日に少なくとも 3 回の実験を実行します。

結果

マイクは、潜伏期間の終わりに目に見えるカビを完全に阻害する最も低い抗菌化合物の濃度として定義されます。任意も濁度負/増殖制御井戸に似ていますが、明確なメディア空井戸のようで、よくは肯定的な結果を考慮この議定書の目的は画面の潜在的な抗真菌薬の高速メソッドを持っているため、否定的な考え。ただし、指定されたアンプは菌や殺菌するかどうかを知ることに興味がある場合肯定的な井戸からメディアもサブロー ・ デキスト ロース寒天培地の上にメッキしたり別の生存率テストでチェックします。

新規化合物の作用のメカニズムは知られている、したがって、菌分離 (チェック要領、テーブル、または文献データ) チェックする前に、予想される範囲内参照抗真菌にあるかどうかを確認する不可欠です、(この場合、アンプ; に化合物のテストのマイク図 1と図 2) 条件が理想的であ...

ディスカッション

希釈テスト目標化合物、化合物の少量を使用して潜在的な抗真菌活性を解析したり、同時に濃度の範囲でそれをテストします。したがって、潜在的な新規抗真菌化合物のスクリーニングの最初のステップとしては、このプロトコルの使用をお勧めします。ここで提示されたプロトコルは、抗真菌療法診療所の選択を支援するために設計、M27 A3 プロトコルに基づいており、さまざまな新しい抗真菌化合物に適応することができます。全体的に、このプロトコルは、抽出物、化合物の物理化学的機能に集中できます。メディアの化合物がヒスタチン 5¹⁴に及ぼす RPMI など真菌の細胞との相互作用をブロックして、たとえば、アッセイの潜在的な候補を効果が表示誤って。この場合、RPMI が干渉するときの代替メディアはモップ pH 7¹⁵酵母窒素ベース (YNB) バッファーです。

参照抗真菌結果がガイドラインの範囲内である限り、プロトコルも変更前の成長条件、菌濃度、培養温度、光に敏感なコンポーネントをできます。参照抗真菌は、テスト菌種の現在の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
培地および試薬
RPMI 1640培地、l-グルタミン、重炭酸ナトリウムなし	サーモフィッシャー	31800-022
3-(N-モルフォリノ) プロパンスルホン酸<->モルフォリノ) (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please)	Sigma-Aldrich		2X RPMI中程度
塩化ナトリウム(NaCl)	Dinâを緩衝するために使用します。マイカ	1528-1	137 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
カリウム (KCl)	J.T.Baker	3040-01	2.7 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
リン酸二水素カリウム (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	60230	2 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
BD Difco Sabouraud デキストロース ブロス	BD	238230
BD Difco Sabouraud デキストロース 寒天	BD	210950
グリセロール	Sigma-Aldrich	V000123	35% (solução de estoque?Criopreservaçãあ?
滅菌水			Para diluição das drogas na diluição セリアーダ
<ストロング>抗真菌薬
アムホテリシン B	Sigma-Aldrich	A2942
フルコナゾール	Sigma-Aldrich	F8929
カスポファンギン	Sigma-Aldrich	PHR1160
<ストロング>プラスチック
50mLコニカルチューブ	Sarstedt	62.547.254
ペトリ	J.Prolab	0304-5
96ウェルプレート	Corning	3595
滅菌溶液リザーバー	KASVI	K30-208
光学
顕微鏡	ニコンを使用して溶液をピペットにするために使用します	E200MV
遠心分離機	サーモフィ	ッシャーMegaFuge 16R
インキュベータ	ーEthik Technology	403-3D	を37°Cに設定します。C
シェーカー	ニューブランズウィックサイエンティフィック	エクセラE25	を37°に設定。C、200 RPM
セル計数チャンバー、ノイバウアー	BOECO ドイツ	BOE 13
マルチチャンネルピペット	HTL	5123